專(zhuān)利名稱(chēng)：一種具有抗hiv-1病毒的結(jié)核基因疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，涉及一種基因疫苗，尤其涉及一種可同時(shí)預(yù)防結(jié)核病和艾滋病的雙功能疫苗及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
:結(jié)核病仍然是導(dǎo)致人類(lèi)病死的首要感染性疾病之一，是全球范圍內(nèi)的重大健康問(wèn)題。全球每年有800萬(wàn)活動(dòng)性結(jié)核患者并導(dǎo)致300萬(wàn)死亡；我國(guó)約有5.5億人口曾經(jīng)感染結(jié)核，每年13萬(wàn)人死于結(jié)核，每月約有12萬(wàn)新發(fā)病人。近年合并感染結(jié)核及HIV的患者與日俱增，全球至少有三分之一的HIV患者感染了結(jié)核，他們比未感染結(jié)核的HIV患者更易發(fā)展成結(jié)核病且病死率大大增加。HIV高流行率的地區(qū)常出現(xiàn)結(jié)核病患病急劇增加?，F(xiàn)有的BCG疫苗僅對(duì)兒童和成人的肺外結(jié)核有效果，對(duì)于成人的肺內(nèi)結(jié)核缺乏保護(hù)效果。目前還沒(méi)有有效的HIV預(yù)防或治療疫苗。因此研制新型的同時(shí)具有抗HIV潛能的雙功能結(jié)核疫苗具有重要的意義。以往研究表明，誘導(dǎo)Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答對(duì)于清除細(xì)胞內(nèi)感染色結(jié)核分枝桿菌至關(guān)重要，誘導(dǎo)⑶4+Thl及其分泌的高水平的IFN Y、以及⑶8+CTL的產(chǎn)生，可有效保護(hù)動(dòng)物抵抗結(jié)核桿菌攻擊。對(duì)于HIV-1的保護(hù)性免疫應(yīng)答，目前認(rèn)為血清中和抗體及Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答均發(fā)揮重要作用?；蛞呙缬址Q(chēng)DNA疫苗，是將外源目的基因構(gòu)建于真核表達(dá)質(zhì)粒、直接注射動(dòng)物的第三代疫苗，由于可在體內(nèi)表達(dá)目的抗原，通過(guò)外源性、內(nèi)源性以及交叉抗原提呈途徑激活DC細(xì)胞提呈抗原，不僅能夠引發(fā)體液免疫應(yīng)答，特別能有效地激活Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答如CD4+Thl和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，因此有利于清除細(xì)胞內(nèi)感染病原體如結(jié)核分枝桿菌和HIV。

由于常規(guī)BCG疫苗的無(wú)效性、以及結(jié)核耐藥菌株的出現(xiàn)和AIDS病導(dǎo)致的結(jié)核感染，使得現(xiàn)有技術(shù)中的疫苗預(yù)防或者治療結(jié)核病和艾滋病的效果不佳
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗及其制備方法和應(yīng)用，所述的這種具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗要解決現(xiàn)有技術(shù)中的疫苗預(yù)防或者治療結(jié)核病和艾滋病的效果不佳的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明提供了一種具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗，由一個(gè)載體構(gòu)成，在所述的載體中插入有一段外源目的基因，其特征在于:所述的外源目的基因包括一個(gè)人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1NL4-3株來(lái)源的衣殼蛋白p24的全長(zhǎng)基因，在所述的人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1NL4-3株來(lái)源的衣殼蛋白p24的全長(zhǎng)基因中嵌合有來(lái)自結(jié)核桿菌抗原的4個(gè)T細(xì)胞表位多肽基因，所述的4個(gè)T細(xì)胞表位分別是結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的MPT64蛋白的76 84位基因，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的Ag85A蛋白的242 250位基因，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的Ag85B蛋白的184 192位基因，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的TB10.4蛋白的74 82位基因，從人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1NL4-3株來(lái)源的衣殼蛋白p24全長(zhǎng)基因的5’開(kāi)始，在第I位堿基前插入結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的MPT64蛋白的76 84位基因，在第273位堿基后插入結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的Ag85A蛋白的242 250位基因，在第303位堿基后插入結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的Ag85B蛋白的184 192位基因，在第441位堿基后插入結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的TB10.4蛋白的74 82位基因，所述的人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1NL4-3株來(lái)源的衣殼蛋白p24全長(zhǎng)基因的DNA序列如SEQ ID NO:2所示，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的MPT64蛋白的76 84位基因的DNA序列如SEQ ID N0:4所示，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的Ag85A蛋白的242 250位基因的DNA序列如SEQ ID NO:6所示，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的Ag85B蛋白的184 192位基因的DNA序列如SEQ ID NO:8所示，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的TB10.4蛋白的74 82位基因的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。進(jìn)一步的，嵌合了結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的4個(gè)T細(xì)胞表位基因的HIV-1NL4-3株來(lái)源的衣殼蛋白蛋白p24的全長(zhǎng)基因所構(gòu)成的外源目的基因的DNA序列如SEQ ID NO:12 所示。進(jìn)一步的，所述的載體為真核表達(dá)質(zhì)粒，所述的真核表達(dá)質(zhì)粒選自pcDNA3.1質(zhì)粒、或pVAXl質(zhì)粒。進(jìn)一步的，所述的人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1NL4-3株來(lái)源的衣殼蛋白蛋白p24的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。進(jìn)一步的，所述的結(jié)核分枝桿菌H37RV株來(lái)源結(jié)核桿菌MPT64蛋白的76 84位基因的氣基酸序列如SEQ ID NO:3所不。進(jìn)一步的，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源結(jié)核桿菌Ag85A蛋白的242 250位基因的氣基酸序列如SEQ ID NO:5所不。進(jìn)一步的，所述的 結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源結(jié)核桿菌Ag85B蛋白的184 192位基因的氣基酸序列如SEQ ID NO:7所不。進(jìn)一步的，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源結(jié)核桿菌TB10.4蛋白的74 82位基因的氣基酸序列如SEQ ID NO:9所不。進(jìn)一步的，嵌合了結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的4個(gè)T細(xì)胞表位基因的人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1NL4-3株來(lái)源的衣殼蛋白蛋白p24的全長(zhǎng)基因所構(gòu)成的外源目的基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。本發(fā)明還提供了上述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗的制備方法，包括以下步驟:I)提取HIV-1NL4-3株DNA作為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增HIV-1衣殼蛋白p24編碼
基因;2)以HIV-1衣殼蛋白p24基因作為模板，分別通過(guò)PCR擴(kuò)增帶彼此有18個(gè)或24個(gè)堿基重疊的雙鏈DNA片段1、片段2、片段3，所述片段I的雙鏈DNA的序列為:atgaagttcc tcagcgcggc aacatcgtcc cctatagtgc agaacctcca ggggcaaatgtacttcaagg agtcgcgccg ttgtagcagg ggatatcacg tcttggaggt ccccgtttacgtacatcagg ccatatcacc tagaacttta aatgcatggg taaaagtagt agaagagaagcatgtagtcc ggtatagtgg atcttgaaat ttacgtaccc attttcatca tcttctcttc
gctttcagcc cagaagtaat acccatgttt tcagcattat cagaaggagc caccccacaacgaaagtcgg gtcttcatta tgggtacaaa agtcgtaata gtcttcctcg gtggggtgttgatttaaata ccatgctaaa cacagtgggg ggacatcaag cagccatgca aatgttaaaactaaatttat ggtacgattt gtgtcacccc cctgtagttc gtcggtacgt ttacaattttgagaccatca atgaggaagc tgcagaatgg gatagattgc atccagtgca tgcagggcctctctggtagt tactccttcg acgtcttacc ctatctaacg taggtcacgt acgtcccggaattaagctga tcgccaacaa cacccgcgtc gcaccaggcc agatgagaga accataattcgact agcggttgtt gtgggcgcag cgtggtccgg tctactctct tggt
所述的片段2的雙鏈DNA的序列為ggccagatga gagaaccaag gggaatctac gccggctcgc tgtcggccct gagtgacataccggtctact ctcttggttc cccttagatg cggccgagcg acagccggga ctcactgtatgcaggaacta ctagtaccct tcaggaacaa ataggatgga tgacacataa tccacctatccgtccttgat gatcatggga agtccttgtt tatcctacct actgtgtatt aggtggatagccagtaggag aaatctataa aagatggata atcctgggat taaataaaat agtaagaatgggtcatcctc tttagatatt ttctacctat taggacccta atttatttta tcattcttactatagcccta gcacccatga agccaacacc atggcgacca gcattctgga cataatatcgggat cgtgggtact tcggttgtgg taccgctggt cgtaagacct gtat所述的片段3的雙鏈DNA的序列為atggcgacca gcattctgga cataagacaa ggaccaaagg aaccctttag agactatgtataccgctggt cgtaagacct gtattctgtt cctggtttcc ttgggaaatc tctgatacatgaccgattct ataaaactct aagagccgag caagcttcac aagaggtaaa aaattggatgctggctaaga tattttgaga ttctcggctc gttcgaagtg ttctccattt tttaacctacacagaaacct tgttggtcca aaatgcgaac ccagattgta agactatttt aaaagcactgtgtctttgga acaaccaggt tttacgcttg ggtctaacat tctgataaaa ttttcgtgacggaccaggag cgacactaga agaaatgatg acagcatgtc agggagtggg gggacccggccctggtcctc gctgtgatct tctttactac tgtcgtacag tccctcaccc ccctgggccgcataaagcaa gagttttgta agtatttcgtt ctcaaaacat t3)將上述的3個(gè)片段混合，變性成為單鏈，通過(guò)彼此重疊的18個(gè)或24個(gè)堿基互補(bǔ)連接，作為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增獲得嵌合了 4個(gè)T細(xì)胞表位的人類(lèi)免疫缺陷病毒衣殼蛋白p24外源目的基因，將目的基因經(jīng)雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的載體連接，獲得權(quán)利要求1所述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗。具體的，是將上述的片段I和片段2混合，熱變性使各自成為單鏈DNA，由于片段1、2有18個(gè)堿基的重疊DNA序列，因此可互補(bǔ)成為雙鏈，再通過(guò)PCR法可擴(kuò)增獲得片段(1+2)的片段，再與片段3混合，熱變性成為單鏈，由于片段2和片段3有24個(gè)堿基的重疊DNA序列，因此可互補(bǔ)成為雙鏈，經(jīng)PCR可擴(kuò)增獲得片段(1+2+3)，即嵌合了 4個(gè)T細(xì)胞表位的HIV-1病毒衣殼蛋白p24外源目的基因。進(jìn)一步的， 以SEQ ID NO: 13所示的p24Fl引物序列和SEQ ID NO: 14所示的p24F2引物序列通過(guò)PCR擴(kuò)增片段I。
進(jìn)一步的，以SEQ ID NO: 15所示的ρ24Τ1引物序列和SEQ ID NO: 16所示的ρ24Τ2引物序列通過(guò)PCR擴(kuò)增片段2。進(jìn)一步的，以SEQ ID NO: 17所示的p24Rl引物序列和SEQ ID NO: 18所示的p24R2引物序列通過(guò)PCR擴(kuò)增片段3。進(jìn)一步的，用SEQ ID NO: 13所示的p24Fl引物序列和SEQ ID NO: 18所示的p24R2引物序列以片段1、2、3混合、變性、彼此互補(bǔ)連接后的基因?yàn)槟０?，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增嵌合了 4個(gè)T細(xì)胞表位的HIV-1衣殼蛋白p24外源目的基因；進(jìn)一步的，嵌合了 4個(gè)T細(xì)胞表位的p24外源目的基因和插入載體的酶切位點(diǎn)分別為NheI和EcoRI位點(diǎn)。進(jìn)一步的，其抗原來(lái)自結(jié)核分枝桿菌H37Rv株和人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1NL4-3株。進(jìn)一步的，所述的載體選自pcDNA3.1質(zhì)粒、或pVAXl質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，含有有效量的上述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗。
進(jìn)一步的，還含有藥學(xué)上可接受的載體或者賦形劑。本發(fā)明還提供了上述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗在制備治療或者預(yù)防結(jié)核病以及艾滋病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)DNA預(yù)測(cè)軟件，從結(jié)核分枝桿菌H37Rv株的已知的4種關(guān)鍵抗原MPT64、Ag85A、Ag85B和TB10.4中各自篩選了一個(gè)T細(xì)胞表位，共4個(gè)T細(xì)胞表位，擬構(gòu)建含有4個(gè)T細(xì)胞表位的結(jié)核基因疫苗。由于表位的氨基酸序列僅有9個(gè)，結(jié)構(gòu)太小和簡(jiǎn)單，免疫原性很弱，通常不能誘導(dǎo)很強(qiáng)的免疫應(yīng)答。因此擬挑選一種載體基因，將4個(gè)T細(xì)胞表位插入載體基因中，共同構(gòu)成結(jié)核外源目的基因。本發(fā)明選擇人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1NL4-3株來(lái)源的衣殼蛋白p24作為嵌入T細(xì)胞表位的基因載體。P24是HIV-1的衣殼蛋白(衣殼蛋白p24是不是本領(lǐng)域的人都知道的？)。全長(zhǎng)693bp，編碼231個(gè)氨基酸，分子量24kD。p24蛋白在病毒顆粒成熟等過(guò)程中起著重要的作用，抑制了 P24的功能能夠產(chǎn)生抗HIV-1的作用。另外p24是一個(gè)良好的免疫原性蛋白，含有多個(gè)T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，能夠有效激活抗原特異性的CD4+/CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答；將結(jié)核T細(xì)胞表位插入到p24的非關(guān)鍵結(jié)構(gòu)部位，不僅能夠使結(jié)核表位被支撐而獲得天然構(gòu)象、從而更好地被識(shí)別從而產(chǎn)生應(yīng)答，還能產(chǎn)生針對(duì)HIV-1抗原p24的應(yīng)答。本發(fā)明選擇的4個(gè)T細(xì)胞表位來(lái)自以下4種結(jié)核抗原:1)MPT64，蛋白質(zhì)全長(zhǎng)205個(gè)氨基酸，分子量24KD，又稱(chēng)MPB64、Rvl980c，是結(jié)核菌培養(yǎng)濾液中的一種分泌蛋白。MPT64可激發(fā)T細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生T細(xì)胞增殖反應(yīng)，并誘導(dǎo)CD8+CTL產(chǎn)生特異性殺傷反應(yīng)，對(duì)結(jié)核產(chǎn)生保護(hù)性應(yīng)答。2)Ag85A,蛋白質(zhì)全長(zhǎng)295個(gè)氨基酸。結(jié)核菌的培養(yǎng)濾液中分泌蛋白的一個(gè)主要成分是Ag85復(fù)合體(antigen 85 complex),由Ag85A、Ag85B、Ag85C組成的相對(duì)分子質(zhì)量為38000蛋白家族。Ag85A可刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，也可激發(fā)Thl型細(xì)胞免疫，誘導(dǎo)⑶8+T細(xì)胞增殖和IL-2及IFN- Y等上升。3) Ag85B，蛋白質(zhì)全長(zhǎng)285個(gè)氨基酸，分子量34.6KD,又稱(chēng)MPT59、Rvl886，是一種分枝桿菌轉(zhuǎn)移酶，與細(xì)菌細(xì)胞壁合成有關(guān)，具有多個(gè)T細(xì)胞表位，能誘導(dǎo)Thl反應(yīng)、IFN- Y的產(chǎn)生。4) TB10.4，蛋白質(zhì)全長(zhǎng)96個(gè)氨基酸，分子量10.4KD,又稱(chēng)Rv0288，是結(jié)核菌早期分泌的致病因子，屬于ESAT-6家族。TB10.4是具有高免疫原性的蛋白，能夠誘導(dǎo)很強(qiáng)的T細(xì)胞應(yīng)答并釋放大量IFN- Y，能夠在抗結(jié)核菌感染中起到保護(hù)作用。本發(fā)明通過(guò)BLAST網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)、DNAstar生物軟件分析以及親疏水性、柔軟性、抗原指數(shù)、表面可及性等參數(shù)的分析，選擇各類(lèi)參數(shù)均較好的結(jié)構(gòu)區(qū)域作為候選疫苗表位區(qū)段；然后通過(guò)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.syfpeith1.com/scripts/MHCServer.dll/home, htm)分析預(yù)測(cè)這些區(qū)段中存在的T細(xì)胞抗原表位、同時(shí)與HLA 1、11類(lèi)分子可高親和力結(jié)合的表位。經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)分子預(yù)測(cè)最后獲得的來(lái)源于結(jié)核分枝桿菌H37Rv株的4個(gè)T細(xì)胞表位分別是:MPT64蛋白的76 84位基因(MPT6476_84) ;Ag85A蛋白的242 250位基因(Ag85A242_250) ；Ag85B 蛋白的 184 192 位基因(Ag85B184_192)TB10.4 蛋白的 74 82 位基因(TB10.474_82)。分別插入到p24基因的第I位堿基前、第273位堿基、第303位堿基和第441位堿基后，構(gòu)建pP24-Mtb雙功能結(jié)核基因疫苗。本發(fā)明在pcDNA3.1或pVAXl質(zhì)粒中，插入一段HIV_lp24外源目的基因，并在該外源目的基因中的4個(gè)非關(guān)鍵結(jié)構(gòu)位置嵌合入4個(gè)結(jié)核T細(xì)胞表位，經(jīng)分析，4個(gè)表位的嵌入不會(huì)影響P24本身的正常三級(jí)、四級(jí)空間結(jié)構(gòu)，因此將這一嵌合有4個(gè)T細(xì)胞表位的p24基因的結(jié)核基因疫苗稱(chēng)為pP24-Mtb結(jié)核基因疫苗。本發(fā)明中，所述的真核表達(dá)質(zhì)粒載體，包括任何可以轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的高效真核表達(dá)質(zhì)粒載體，包括但不限于:pcDNA3.UpVAX以及常見(jiàn)和市售的真核質(zhì)粒載體。本發(fā)明中，p24蛋白編碼基因和4個(gè)T細(xì)胞表位的獲得，可以通過(guò)多種方式獲得，包括但不限于:1)化學(xué)合成DNA ；2)通過(guò)適當(dāng)引物以PCR技術(shù)擴(kuò)增得到DNA。本發(fā)明中，將pP24_Mtb基因疫苗注射小鼠的方法采用肌肉注射方式，以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行:以注射器吸取50 μ I質(zhì)粒(PBS)直接注射小鼠脛骨前肌肉。除注射器外，也可選用其他有效的借助于市售儀器的基因免疫的方式，包括但不限于:基因槍技術(shù)、電穿孔輔助技術(shù)等。本發(fā)明中，“藥學(xué)上可接受的”成分是適用于人和動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激、變態(tài)反應(yīng))、有合理效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。本發(fā)明中，“藥學(xué)上可接受的載體”成分是用于將具有活性的有效成分傳送給人或動(dòng)物的藥學(xué)上可接受的溶劑、懸浮劑和賦形劑。所述的載體可以是液體、固體或半固體。載體包括但不限于:水、PBS緩沖液、生理鹽水、葡萄糖、甘油、疊氮鈉及其組合。本發(fā)明的藥物組合物，還含有上述有效成分和藥學(xué)上可接受的載體。通常將其配制于無(wú)毒、中性、惰性和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，pH值通常約6-8。
本發(fā)明和與已有技術(shù)相對(duì)照，其效果是積極和明顯的。本發(fā)明的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗是一種質(zhì)粒DNA疫苗，其中插入的外源目的基因是嵌合有4個(gè)結(jié)核T細(xì)胞表位的HIV-1來(lái)源p24基因，它們各自均可誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞應(yīng)答，而嵌合表位不會(huì)影響P24蛋白的空間結(jié)構(gòu)。因此理論上這一基因疫苗同時(shí)可誘導(dǎo)結(jié)核和HIV-1特異性抗原，可強(qiáng)有效地激活針對(duì)結(jié)核和HIV-1的特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答。而p24是一個(gè)大的抗原，除含有T西北表位，還含有B西北表位，因此還可誘導(dǎo)HIV-lp24特異性血清IgG抗體應(yīng)答，而抗體具有中和HIV病毒的潛能。通過(guò)將本發(fā)明的雙功能基因疫苗肌肉注射免疫小鼠，證實(shí)可誘導(dǎo)針對(duì)HIV-lp24抗原的特異性抗體應(yīng)答以及T細(xì)胞應(yīng)答，同時(shí)還能誘導(dǎo)較強(qiáng)的針對(duì)結(jié)核T細(xì)胞表位的特異性Thl型免疫應(yīng)答和CTL殺傷應(yīng)答，分泌高水平IFN Y，因此是一種潛在的可預(yù)防和治療結(jié)核病同時(shí)具有一定抗HIV功能的雙功能疫苗。


圖1顯示了本發(fā)明的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗的外源目的基因(嵌合了4個(gè)結(jié)核T細(xì)胞表位的HIV-lp24蛋白基因)插入pcDNA3.1載體質(zhì)粒的構(gòu)建模式圖。圖2顯示了該質(zhì)粒的構(gòu)建方法:通過(guò)F1/F2、T1/T2、R1/R2三對(duì)引物，以HIV-lp24DNA為模板，分別擴(kuò)增得到雙鏈DNA片段I (l_351bp)、片段2 (333_567bp)、片段3(543-801bp)，而后通過(guò)彼此重疊的18個(gè)或24個(gè)堿基互補(bǔ)相連得到的嵌合4個(gè)T細(xì)胞表位的p24全長(zhǎng)基因，其中，粗斜體的序列是插入的4個(gè)T細(xì)胞表位序列。圖3顯示了本發(fā)明的具有抗HIV-1潛能的雙功能的多表位結(jié)核基因疫苗的質(zhì)粒PCR (圖3A)及部分測(cè)序鑒定結(jié)果(圖3B)。圖4顯示了本發(fā)明的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)的特異性IgG抗體，圖4A顯示p24抗原特異性IgG的水平；圖4B顯示p24抗原特異性IgG效價(jià)；圖4C顯示p24抗原特異性抗體亞類(lèi)。圖5顯示了本發(fā)明的具有抗HIV-1病毒的 結(jié)核基因疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)的結(jié)核抗原特異性IFN Y +T細(xì)胞(圖5A)及HIV-1抗原特異性IFN y +T細(xì)胞應(yīng)答(圖5B)。圖6顯示了本發(fā)明的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)的結(jié)核抗原特異性(圖6A)及HIV-lp24抗原特異性細(xì)胞因子分泌水平(圖6B)。圖7顯示了本發(fā)明的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)的結(jié)核及HIV-1抗原特異性淋巴細(xì)胞增殖(圖7A)及殺傷活性(圖7B)。圖8顯示了本發(fā)明的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗免疫小鼠產(chǎn)生的抗結(jié)核菌攻擊的保護(hù)作用。圖A顯示了肺部HE染色病理情況；圖B顯示了肺臟結(jié)核桿菌菌落計(jì)數(shù)。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述的實(shí)施例是用于描述本發(fā)明的使用和用途，而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例中采用的質(zhì)粒、菌種、細(xì)胞、動(dòng)物及試劑如下:質(zhì)粒、菌種、細(xì)胞、動(dòng)物。質(zhì)粒pcDNA3.1㈠、pET32a、宿主細(xì)菌DH5 α、BL21 (Invitrogen公司購(gòu)買(mǎi))。結(jié)核分枝桿菌H37Rv株由上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)防科提供，人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1NL4-3株來(lái)自哪里？，基因合成委托上海賽百盛公司。4-6周齡雌性BALB/c (H-2Kd)小鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物中心。分子生物學(xué)試劑:限制性核酸內(nèi)切酶Nhe 1、EcoR I (TaKaRa公司)、T4DNA連接酶(MBI 公司)；Taq DNA 聚合酶(Promega 公司)；RNase A (Ameresco 公司)；dNTP (Promega 和華美生物公司)；LB培養(yǎng)基(英國(guó)OXOID公司)，瓊脂粉、瓊脂糖、SDS、EB (上海化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站)，Tris (USB公司)，瓊脂糖膠回收試劑盒(上海華舜生物制品公司)，大量質(zhì)粒抽提試劑盒(Qiagen公司)。 免疫學(xué)試劑和材料:HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG多克隆抗體(Sant Clous公司)；FITC-CD4抗體、FITC-CD8抗體、PE-1FN Y抗體、Brefeldin A (高爾基阻斷劑)購(gòu)自BD公司；2ml和Iml無(wú)菌注射器(米沙瓦醫(yī)科工業(yè)有限公司)。實(shí)施例1:pcDNA3-P24-Mtb基因疫苗的目的抗原基因的預(yù)測(cè)通過(guò)BLAST網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)、DNAstar生物軟件、網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.syfpeith1.com/scripts/MHCServer.dll/home, htm)分析,綜合親疏水性、柔軟性、抗原指數(shù)、表面可及性、與HLA1、II類(lèi)分子結(jié)合、等參數(shù)，預(yù)測(cè)獲得4個(gè)來(lái)源于結(jié)核分枝桿菌H37Rv株的T細(xì)胞表位:MPT64蛋白的76 84位基因(MPT6476_84) ；Ag85A蛋白的242 250位基因(Ag85A242_250) ；Ag85B 蛋白的 184 192 位基因(Ag85B184_192) ；TB10.4 蛋白的 74 82 位基因(TB10.474_82)。如圖1所示，以pcDNA3.1或pVAX為質(zhì)粒載體，以人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV_lp24基因作為嵌合表位的基因載體，在計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，在其中不影響關(guān)鍵結(jié)構(gòu)的位置第I位堿基前插入MPT6476_84表位基因、第273位堿基后插入Ag85A242_25(l表位基因、第303位堿基后插入Ag85B184_192表位基因、第441位堿基后插入TB10.474_82表位基因。實(shí)施例2 pcDNA3-P24_Mtb結(jié)核基因疫苗的構(gòu)建為了不在p24基因和結(jié)核T細(xì)胞表位基因之間引入酶切位點(diǎn)，本發(fā)明利用DNA引物直接合成和PCR的方法，從5’和3’端依次擴(kuò)增三段彼此有18個(gè)或24個(gè)堿基重疊的包含部分p24基因和結(jié)核T細(xì)胞表位的基因片段，變性后通過(guò)彼此重疊的互補(bǔ)序列連接，最后用5’和3’兩端p24上、下引物PCR擴(kuò) 增出嵌合有4個(gè)結(jié)核T細(xì)胞表位的HIV_lp24全長(zhǎng)基因。同時(shí)在基因兩端分別帶上Nhe I和EcoR I酶切位點(diǎn)，經(jīng)雙酶切后可連接入經(jīng)同樣雙酶切的真核表達(dá)載體PCDNA3.1(_)或原核表達(dá)載體pET32a。首先以HIV-1衣殼蛋白p24基因(SEQ ID NO:2)為模板，分別以引物Fl (SEQ IDNO:13)和F2引物(SEQ ID NO:14)通過(guò)PCR擴(kuò)增片段I (如圖2所示Fl和F2相對(duì)，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的l_351bp雙鏈DNA片段)，所述的片段I的雙鏈DNA的序列為:atgaagttcc tcagcgcggc aacatcgtcc cctatagtgc agaacctcca ggggcaaatgtacttcaagg agtcgcgccg ttgtagcagg ggatatcacg tcttggaggt ccccgtttacgtacatcagg ccatatcacc tagaacttta aatgcatggg taaaagtagt agaagagaagcatgtagtcc ggtatagtgg atcttgaaat ttacgtaccc attttcatca tcttctcttcgctttcagcc cagaagtaat acccatgttt tcagcattat cagaaggagc caccccacaacgaaagtcgg gtcttcatta tgggtacaaa agtcgtaata gtcttcctcg gtggggtgttgatttaaata ccatgctaaa cacagtgggg ggacatcaag cagccatgca aatgttaaaactaaatttat ggtacgattt gtgtcacccc cctgtagttc gtcggtacgt ttacaattttgagaccatca atgaggaagc tgcagaatgg gatagattgc atccagtgca tgcagggcctctctggtagt tactccttcg acgtcttacc ctatctaacg taggtcacgt acgtcccggaattaagctga tcgccaacaa cacccgcgtc gcaccaggcc agatgagaga accataattcgact agcggttgtt gtgggcgcag cgtggtccgg tctactctct tggt以p24基因(SEQ ID NO:2)作為模板，以Tl引物(SEQ ID N0:15)和T2引物(SEQ ID NO:16)通過(guò)PCR擴(kuò)增片段2 (如圖2所示Tl引物和T2相對(duì)，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的333-567bp雙鏈DNA片段)，所述片段2的雙鏈DNA的序列為:ggccagatga gagaaccaag gggaatctac gccggctcgc tgtcggccct gagtgacata
ccggtctact ctcttggttc cccttagatg cggccgagcg acagccggga ctcactgtatgcaggaacta ctagtaccct tcaggaacaa ataggatgga tgacacataa tccacctatccgtccttgat gatcatggga agtccttgtt tatcctacct actgtgtatt aggtggatagccagtaggag aaatctataa aagatggata atcctgggat taaataaaat agtaagaatgggtcatcctc tttagatatt ttctacctat taggacccta atttatttta tcattcttactatagcccta gcacccatga agccaacacc atggcgacca gcattctgga cataatatcgggat cgtgggtact tcggttgtgg taccgctggt cgtaagacct gtat以p24 基因(SEQ ID NO:2)作為模板，以 Rl 引物(SEQ ID NO: 17)和 R2 引物(SEQID NO:18)通過(guò)PCR擴(kuò)增片段3(如圖2所示Rl引物和R2引物相對(duì)，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的543-801bp雙鏈DNA片段)，所述的片段3的雙鏈DNA的序列為:atggcgacca gcattctgga cataagacaa ggaccaaagg aaccctttag agactatgtataccgctggt cgtaagacct gtattctgtt cctggtttcc ttgggaaatc tctgatacatgaccgattct ataaaactct aagagccgag caagcttcac aagaggtaaa aaattggatgctggctaaga tattttg·aga ttctcggctc gttcgaagtg ttctccattt tttaacctacacagaaacct tgttggtcca aaatgcgaac ccagattgta agactatttt aaaagcactgtgtctttgga acaaccaggt tttacgcttg ggtctaacat tctgataaaa ttttcgtgacggaccaggag cgacactaga agaaatgatg acagcatgtc agggagtggg gggacccggccctggtcctc gctgtgatct tctttactac tgtcgtacag tccctcaccc ccctgggccgcataaagcaa gagttttgta agtatttcgtt ctcaaaacat t將上述的片段I和片段2混合，變性使各自成為單鏈DNA，由于片段1、2有18個(gè)堿基的重疊DNA序列，因此可互補(bǔ)成為雙鏈，再以Fl (SEQ ID NO:13)和T2 (SEQ ID NO:16)引物通過(guò)PCR法可擴(kuò)增獲得片段(1+2)的片段，再與片段3混合，變性成為單鏈，由于片段2和片段3也有24個(gè)堿基的重疊DNA序列，因此可互補(bǔ)成為雙鏈，以Fl (SEQ ID NO:13)和R2引物(SEQ ID NO: 18)作為引物，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增獲得獲得片段(1+2+3)，即嵌合了 4個(gè)結(jié)核T細(xì)胞表位的HIV-lp24目的基因，即P24-Mtb編碼基因，長(zhǎng)度為801bp (如圖2所示)。該P(yáng)24-Mtb編碼基因經(jīng)電泳證實(shí)為801bp，如圖3A所示。再將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Nhe I和EcoR I雙酶切，回收酶切片段，與經(jīng)相應(yīng)酶切的載體pcDNA3.1 (-)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，氨芐青霉素篩選轉(zhuǎn)化菌落。經(jīng)測(cè)序鑒定序列正確(圖3Β)，提示成功構(gòu)建了pcDNA3-P24-Mtb真核表達(dá)質(zhì)粒。這樣4個(gè)結(jié)核表位基因就以沒(méi)有酶切位點(diǎn)的方式插入p24基因了。將重組質(zhì)粒pP24_Mtb轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)LB (AmplOO μ g/ml)液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)15h，收集菌體，按照QIAGEN Plasmid Mega Kit去除雜蛋白、細(xì)菌內(nèi)毒素，得到純化質(zhì)粒。實(shí)施例3 pET32a-P24_Mtb原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)純化為獲得大量的p24或P24_Mtb蛋白抗原，將p24及擴(kuò)增得到的P24_Mtb編碼基因用NheI和EcoRI雙酶切，與經(jīng)相應(yīng)酶切的原核表達(dá)載體pET32a連接，構(gòu)建了 pET32a_p24和pET32a-P24-Mtb原核表達(dá)質(zhì)粒。將pET32a-P24_Mtb或pET32a_p24分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，篩選陽(yáng)性克隆。經(jīng)LB(AmplOOy g/ml)液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)至A600達(dá)到0.75左右，加入異丙基硫代半糖苷(IPTG)至終濃度為0.1mM。繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6小時(shí)，4000r/min離心20min收集菌體，IXPBS重懸后超聲破碎，12000r/min于4°C離心20min，分別收獲上清和沉淀。上清過(guò)親和層析柱，以不同濃度洗脫液洗脫，收集每Iml洗脫液，保存A280大于1.0的洗脫液，最后經(jīng)12% SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)的蛋白。最后得到純化融合蛋白p24或P24-Mtb。實(shí)施例4 pP24_Mtb基因疫苗免疫小鼠將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.l_P24_Mtb溶解于無(wú)菌、無(wú)熱源的PBS中，濃度調(diào)為I μ g/μ I。6-8周齡雌性BALB/c (H_2d)健康小鼠18只，分為3組:(l)pcDNA3.1空質(zhì)粒對(duì)照；(2)pcDNA3.1-ρ24質(zhì)粒組；(3)pcDNA3.l_P24_Mtb質(zhì)粒。采用肌肉注射法免疫:在BALB/c小鼠脛骨前肌肉正中注射50 μ g質(zhì)粒，每只小鼠各50 μ g/ μ I。于O周、2周、4周、6周肌注免疫小鼠四次。每?jī)芍芙?jīng)眼眶采血，血樣4°C過(guò)夜，6000轉(zhuǎn)/min離心15min獲得血清，_20°C凍存。實(shí)施例5 pcDNA3.l-P24_Mtb基因疫苗誘導(dǎo)的特異性抗體應(yīng)答間接ELISA法檢測(cè)免疫小鼠血清中HIV_lp24特異性IgG。以實(shí)施例3獲得的純化的P24蛋白10 μ g/ml包被聚苯乙烯微孔板4°C過(guò)夜，100 μ I/孔。以封閉液(5%脫脂奶粉、0.05% Tween-20、PBS)封閉板，200 μ I/孔，37°C 2h?？寡褰?jīng) I: 100 稀釋后，100 μ I/孔，37°C lh，洗滌后加入I: 5000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，37°C 45min，洗板后以TMB顯色20min，終止反應(yīng)后測(cè)A45tl值。如圖4A顯示:pcDNA3.l_P24_Mtb基因疫苗免疫四次以后在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了P24特異性IgG，血清IgG滴度在第10周時(shí)達(dá)到最高，達(dá)1: 4000 (如圖4B)，而空質(zhì)粒注射組無(wú)特異性抗體生成。且pcDNA3.1-P24-Mtb基因疫苗可以產(chǎn)生較高的IgG2a(如圖4C)，提示Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答?？傊琾cDNA3.1-P24-Mtb疫苗肌肉注射免疫小鼠誘導(dǎo)了較強(qiáng)的HIV-lp24抗原特異性抗體應(yīng)答。實(shí)施例6 pcDNA3.l_P24_Mtb基因疫苗誘導(dǎo)的IFN Y +T細(xì)胞應(yīng)答小鼠免疫第8周處死，取脾細(xì)胞，去除紅細(xì)胞后洗滌2次，以3X IO6細(xì)胞/孔加入24孔板，分別加入4個(gè)混合結(jié)核抗原多肽(20 μ g/ml)或純化的p24蛋白(20 μ g/ml)，37°C、5% CO2培養(yǎng)。4小時(shí)后，加入高爾基阻斷體BFA，繼續(xù)培養(yǎng)2h，收集細(xì)胞，用FITC-⑶4抗體、FITC-CD8抗體及PE-1FN Y抗體進(jìn)行表面和胞內(nèi)染色。洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分泌IFN Y的T細(xì)胞。如圖5所示，與對(duì)照組相比，若經(jīng)HIV-lp24蛋白抗原刺激，pcDNA3.l_P24_Mtb和pcDNA3.1-P24基因免疫均顯著誘導(dǎo)了 p24特異性分泌IFN Y的⑶4+T和⑶8+T細(xì)胞(如圖5B);若以4混合多肽刺激細(xì)胞，則僅有pcDNA3.l_P24_Mtb免疫組誘導(dǎo)了分泌IFNy的CD4+T (2.3% )和CD8+T細(xì)胞(2.57% )(是不是應(yīng)該是5.57% )應(yīng)答(如圖5A)，顯著高于pcDNA3.1-P24和pcDNA3.1組(p < 0.01)。證明該雙功能基因疫苗能同時(shí)誘導(dǎo)較強(qiáng)的針對(duì)結(jié)核及HIV-lp24抗原的Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答。實(shí)施例7 pcDNA3.l_P24_Mtb基因疫苗誘導(dǎo)高水平IFNy分泌小鼠免疫第8周處死，取脾細(xì)胞，去除紅細(xì)胞后洗滌2次，以5X IO6細(xì)胞/孔加入12孔板,分別加入4個(gè)混合結(jié)核抗原多肽(10 μ g/ml)或純化的p24蛋白(10 μ g/ml)，37°C、5% CO2培養(yǎng)。72小時(shí)后，收集上清，用ELISA方法檢測(cè)IFN Y、TNFa、IL-4、IL-10細(xì)胞因子的水平。如圖6所示，pcDNA3.1-P24-Mtb基因免疫組能夠顯著增強(qiáng)IFNy和TNFa的分泌，顯著高于對(duì)照組，提示該基因疫苗可有效激活結(jié)核T細(xì)胞表位及HIV-lp24抗原特異性T細(xì)胞分泌IFNy。實(shí)施例8 pcDNA3.l-P24_Mtb基因疫苗誘導(dǎo)的特異性增殖和殺傷效應(yīng)小鼠免疫第8周處死，取脾細(xì)胞，去除紅細(xì)胞后洗滌2次，以5X IO5細(xì)胞/孔加入96孔板，分別加入4個(gè)混合結(jié)核抗原多肽(20 μ g/ml)或純化的p24蛋白(20 μ g/ml)，37°C、5% CO2培養(yǎng)。72小時(shí)后，加入00(-8試劑，1(^1/孔，371:、5% CO2培養(yǎng)6小時(shí)后，用酶標(biāo)儀讀取0D450值。以各數(shù)值除以空白對(duì)照，得到增殖的刺激指數(shù)，如圖7A，pcDNA3.l_P24_Mtb免疫組淋巴細(xì)胞增殖能力顯著高于對(duì)照組，發(fā)生特異性激活和增殖。在淋巴細(xì)胞殺傷試驗(yàn)中，以2X107細(xì)胞/孔加入6孔板中，以結(jié)核抗原多肽混合物或P24蛋白刺激，并加入50U/ml的IL-2，培養(yǎng)6天后作為效應(yīng)細(xì)胞，以結(jié)核混合多肽或p24蛋白刺激的SP2/0細(xì)胞作為靶細(xì)胞，以25: I的效靶比混合加入96孔板，37 °C作用4小時(shí)后收集細(xì)胞，加入CCK-8試劑，37 °C培養(yǎng)3h，用酶標(biāo)儀讀取0D450值，計(jì)算殺傷百分比。不同質(zhì)粒免疫小鼠淋巴細(xì)胞的特異性殺傷情況如圖7B所示，經(jīng)結(jié)核抗原肽刺激后，pcDNA3.1-P24-Mtb基因免疫組殺傷率均達(dá)到45%以上，顯著高于pcDNA3.1-P24(5% )和pcDNA3.1(3% )對(duì)照組，證明該基因疫苗能誘導(dǎo)較強(qiáng)的結(jié)核抗原特異性殺傷應(yīng)答；而以P24蛋白刺激后，pcDNA3.1-P24疫苗誘導(dǎo)了一定的p24特異性殺傷(32% )，但pcDNA3.l_P24_Mtb基因免疫誘導(dǎo)的特異性殺傷(51% )仍顯著(p < 0.01)高于pcDNA3.1-P24疫苗。提示該雙功能基因疫苗具有抵抗結(jié)核分枝桿菌及HIV-1感染的功倉(cāng)泛。實(shí)施例9 pcDNA3.l-P24_Mtb基因疫苗產(chǎn)生抗結(jié)核保護(hù)性效果最后一次免疫小鼠后2周,用I X IO7BCG (北點(diǎn)生物制品所)通過(guò)滴鼻方式給小鼠攻毒。攻毒后4周處死小鼠，取脾臟和肺臟勻漿，均勻涂布在結(jié)核分枝桿菌固體培養(yǎng)基7H11上。4周后，對(duì)平板上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。如圖所示，pcDNA3.1-P24-Mtb基因免疫組其肺臟菌落數(shù)(1045)均明顯少 于對(duì)照組(106)(圖SB)，證明該雙功能基因疫苗能更好地保護(hù)小鼠抵抗結(jié)核分枝桿菌的感染。而肺部HE染色病理結(jié)果證實(shí)，pcDNA3.1-P24和pcDNA3.1對(duì)照組不能保護(hù)小鼠，其肺部出現(xiàn)結(jié)核病灶，同時(shí)有顯著炎癥浸潤(rùn)和肺泡細(xì)胞壁增厚。而pcDNA3.1-P24-Mtb基因免疫組肺臟病理程度很輕，接近正常肺臟細(xì)胞，提示較好的免疫保護(hù)作用(圖8A)。
權(quán)利要求
1.一種具有抗Hiv-1病毒的結(jié)核基因疫苗，由一個(gè)載體構(gòu)成，在所述的載體中插入有一段外源目的基因，其特征在于:所述的外源目的基因包括一個(gè)人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1NL4-3株來(lái)源的衣殼蛋白p24的全長(zhǎng)基因，在所述的人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1NL4-3株來(lái)源的衣殼蛋白P24的全長(zhǎng)基因中嵌合有來(lái)自結(jié)核桿菌抗原的4個(gè)T細(xì)胞表位多肽基因，所述的4個(gè)T細(xì)胞表位分別是結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的MPT64蛋白的76 84位基因，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的Ag85A蛋白的242 250位基因，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的Ag85B蛋白的184 192位基因，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的TB10.4蛋白的74 82位基因，從人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1NL4-3株來(lái)源的衣殼蛋白p24全長(zhǎng)基因的5’開(kāi)始，在第I位堿基前插入結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的MPT64蛋白的76 84位基因，在第273位堿基后插入結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的Ag85A蛋白的242 250位基因，在第303位堿基后插入結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的Ag85B蛋白的184 192位基因，在第441位堿基后插入結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的TB10.4蛋 白的74 82位基因，所述的人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1NL4-3株來(lái)源的衣殼蛋白p24全長(zhǎng)基因的DNA序列如SEQ IDNO:2所示，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的MPT64蛋白的76 84位基因的DNA序列如SEQ ID NO:4所示，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的Ag85A蛋白的242 250位基因的DNA序列如SEQ ID NO:6所示，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的Ag85B蛋白的184 192位基因的DNA序列如SEQ ID NO:8所示，所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的TB10.4蛋白的74 82位基因的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗，其特征在于:嵌合了結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的4個(gè)T細(xì)胞表位基因的人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1NL4-3株來(lái)源的衣殼蛋白P24全長(zhǎng)基因所構(gòu)成的外源目的基因的DNA序列如SEQ ID N0:12所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗，其特征在于:所述的載體為真核表達(dá)質(zhì)粒，所述的真核表達(dá)質(zhì)粒選自pcDNA3.1質(zhì)?；騪VAXl質(zhì)粒中的任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗，其特征在于:所述的人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1NL4-3株來(lái)源的衣殼蛋白p24的氨基酸序列SEQ ID如NO:1所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗，其特征在于:所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的MPT64蛋白的76 84位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所/Jn ο
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗，其特征在于:所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的Ag85A蛋白的242 250位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗，其特征在于:所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的Ag85B蛋白的184 192位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗，其特征在于:所述的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的TB10.4蛋白的74 82位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗，其特征在于:嵌合了結(jié)核分枝桿菌H37Rv株來(lái)源的4個(gè)T細(xì)胞表位基因的人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1株來(lái)源的衣殼蛋白p24的全長(zhǎng)基因所構(gòu)成的外源目的基因蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:11所示。
10.權(quán)利要求1所述的具有抗Hiv-1病毒的結(jié)核基因疫苗的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)提取HIV-1NL4-3株DNA作為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1株衣殼蛋白P24的編碼基因； 2)以HIV-1衣殼蛋白p24基因作為模板，分別通過(guò)PCR擴(kuò)增彼此有18個(gè)堿基重疊的雙鏈DNA片段1、片段2及彼此有24個(gè)堿基重疊的雙鏈DNA片段3，所述的片段I的雙鏈DNA的序列為 atgaagttcc tcagcgcggc aacatcgtcccctatagtgcagaacctccaggggcaaatg tacttcaagg agtcgcgccg ttgtagcaggggatatcacgtcttggaggtccccgtttac gtacatcagg ccatatcacc tagaactttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaag catgtagtcc ggtatagtgg atcttgaaatttacgtacccattttcatcatcttctcttc gctttcagcc cagaagtaat acccatgttttcagcattatcagaaggagccaccccacaa cgaaagtcgg gtcttcatta tgggtacaaaagtcgtaatagtcttcctcggtggggtgtt gatttaaata ccatgctaaa cacagtggggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaa ctaaatttat ggtacgattt gtgtcacccccctgtagttcgtcggtacgtttacaatttt gagaccatca atgaggaagc tgcagaatgggatagattgcatccagtgcatgcagggcct ctctggtagt tactcctteg acgtcttaccctatctaacgtaggtcacgtacgtcccgga attaagctga tcgccaacaa cacccgcgtcgcaccaggccagatgagagaacca taattcgact agcggttgtt gtgggcgcagcgtggtccggtctactctcttggt 所述的片段2的雙鏈DNA的序列為 ggccagatga gagaaccaag gggaatctacgccggctcgctgtcggccctgagtgacata ccggtctact ctcttggttc cccttagatgcggccgagcgacagccgggactcactgtat gcaggaacta ctagtaccct tcaggaacaaataggatggatgacacataatccacctatc cgtccttgat gatcatggga agtccttgtttatcctacctactgtgtattaggtggatag ccagtaggag aaatctataa aagatggataatcctgggattaaataaaatagtaagaatg ggtcatcctc tttagatatt ttctacctattaggaccctaatttattttatcattcttac tatagcccta gcacccatga agccaacaccatggcgaccagcattctggacata atatcgggat cgtgggtact tcggttgtggtaccgctggtcgtaagacctgtat 所述的片段3的雙鏈DNA的序列為 atggcgacca gcattctgga cataagacaaggaccaaaggaaccctttagagactatgta taccgctggt cgtaagacct gtattctgttcctggtttccttgggaaatctctgatacat gaccgattct ataaaactct aagagccgagcaagcttcacaagaggtaaaaaattggatg ctggctaaga tattttgaga ttctcggctcgttcgaagtgttctccattttttaacctac acagaaacct tgttggtcca aaatgcgaacccagattgtaagactattttaaaagcactg tgtctttgga acaaccaggt tttacgcttgggtctaacattctgataaaattttcgtgac ggaccaggag cgacactaga agaaatgatgacagcatgtcagggagtggggggacccggc cctggtcctc gctgtgatct tctttactactgtcgtacagtccctcacccccctgggccgcataaagcaa gagttttgta agtatttcgtt ctcaaaacat t 3)將上述的3段片段混合，變性成為單鏈，通過(guò)彼此重疊的18個(gè)或24個(gè)堿基互補(bǔ)連接，以此作為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增獲得嵌合了 4個(gè)T細(xì)胞表位的人類(lèi)免疫缺陷病毒衣殼蛋白p24外源目的基因，將目的基因經(jīng)雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的載體連接，獲得權(quán)利要求I所述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗。
11.如權(quán)利要求10所述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗的制備方法，其特征在于:以SEQ ID NO:13所示的p24Fl引物和SEQ ID NO: 14所示的p24F2引物通過(guò)PCR擴(kuò)增片段
12.如權(quán)利要求10所述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗的制備方法，其特征在于:以SEQ ID NO:15所示的引物ρ24Τ1序列和SEQ ID NO: 16所示的引物p24T2序列通過(guò)PCR擴(kuò)增片段2。
13.如權(quán)利要求10所述的 具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗的制備方法，其特征在于:以SEQ ID NO:17所示的引物p24Rl序列和SEQ ID NO: 18所示的p24R2引物序列通過(guò)PCR擴(kuò)增片段3。
14.如權(quán)利要求10所述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗的制備方法，其特征在于:用SEQ ID NO:13所示的p24Fl引物和SEQ ID NO:18所示的p24R2引物以片段1、2、3混合并變性為單鏈、互補(bǔ)連接后的基因?yàn)槟０?，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增嵌合了 4個(gè)T細(xì)胞表位的HIV-1衣殼蛋白p24外源目的基因。
15.如權(quán)利要求10所述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗的制備方法，其特征在于:嵌合了 4個(gè)T細(xì)胞表位的p24外源目的基因和插入載體的酶切位點(diǎn)分別為NheI和EcoRI位點(diǎn)。
16.如權(quán)利要求10所述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗的制備方法，其特征在于:抗原來(lái)自結(jié)核分枝桿菌H37Rv株和人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1NL4-3株。
17.如權(quán)利要求10所述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗的制備方法，其特征在于:所述的載體選自pcDNA3.1質(zhì)粒、或pVAXl質(zhì)粒。
18.—種藥物組合物，其特征在于:含有有效量的權(quán)利要求1所述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗。
19.如權(quán)利要求18所述的一種藥物組合物，其特征在于:還含有藥學(xué)上可接受的載體或者賦形劑。
20.權(quán)利要求1所述的具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗在制備治療或者預(yù)防結(jié)核病以及艾滋病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種具有抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗，由一個(gè)載體構(gòu)成，在載體中插入有外源目的基因，外源目的基因包括一個(gè)HIV-1NL4-3株來(lái)源的衣殼蛋白p24的基因，在衣殼蛋白p24的基因中嵌合有來(lái)自結(jié)核桿菌抗原的T細(xì)胞表位多肽基因MPT6476-84、Ag85A242-250、Ag85B184-192和TB10.474-82。本發(fā)明還公開(kāi)了這種抗HIV-1病毒的結(jié)核基因疫苗的制備方法和應(yīng)用。通過(guò)將基因疫苗肌肉注射免疫小鼠，可誘導(dǎo)針對(duì)結(jié)核抗原的分泌高水平IFNγ的Th1型免疫應(yīng)答和特異性殺傷應(yīng)答，同時(shí)還可誘導(dǎo)針對(duì)HIV-1抗原p24特異性血清IgG及T細(xì)胞免疫應(yīng)答，是一種可預(yù)防結(jié)核病和抗HIV的疫苗。
文檔編號(hào)A61P31/06GK103191442SQ20121000046
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2012年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月4日
發(fā)明者熊思東, 徐薇, 李曉嫚 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)