專利名稱：依達(dá)拉奉的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及依達(dá)拉奉預(yù)防氧驚厥的用途。
背景技術(shù)：
氧驚厥又名驚厥型氧中毒或急性氧中毒，是人體吸入高分壓氧氣(高于200kPa) 一定時(shí)間后，神經(jīng)細(xì)胞興奮性增加導(dǎo)致的臨床表現(xiàn)類似癲癇大發(fā)作的一種疾病。氧驚厥多發(fā)生在潛水活動(dòng)中，發(fā)作時(shí)潛水員可出現(xiàn)全身強(qiáng)直性收縮以及陣發(fā)性痙攣，意識(shí)喪失，并伴有尿便失禁，潛水員往往失去控制而引起溺水或放漂等潛水事故，嚴(yán)重影響潛水員安全，極大地限制了使用氧氣輕潛水裝具執(zhí)行水下軍事作戰(zhàn)任務(wù)、水下商業(yè)性潛水作業(yè)和科學(xué)考察等活動(dòng)。此外，臨床高壓氧已經(jīng)廣泛應(yīng)用于治療減壓病、一氧化碳中毒、組織壞死和神經(jīng)損傷等疾病，但也存在發(fā)生氧驚厥的風(fēng)險(xiǎn)，特別是對(duì)一些敏感者。因此，有效預(yù)防氧驚厥，最大限度地安全用氧，對(duì)軍事和民用潛水作業(yè)以及臨床高壓氧治療都具有重要意義。但是，目前所能采取的預(yù)防措施相當(dāng)被動(dòng)，主要依靠限制吸氧的壓力和時(shí)程預(yù)防氧驚厥發(fā)生，很大程度上限制了高分壓氧的應(yīng)用。依達(dá)拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，MCI-186)是一種新型強(qiáng)效氧自由基清除劑及抗氧化劑，目前正廣泛用作治療腦卒中的一線急救藥物。至今未見抗氧化劑依達(dá)拉奉用于預(yù)防氧驚厥的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決目前缺乏有效預(yù)防氧驚厥的藥物的技術(shù)問(wèn)題，提供一種依達(dá)拉奉的用途，用于制備預(yù)防氧驚厥的藥物。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種依達(dá)拉奉的用途，用于制備預(yù)防氧驚厥的藥物。所述依達(dá)拉奉的給藥方式包括肌肉注射或靜脈滴注。所述依達(dá)拉奉藥物的劑型包括注射劑。本發(fā)明通過(guò)依達(dá)拉奉對(duì)氧驚厥首次放電潛伏期的影響實(shí)驗(yàn)和依達(dá)拉奉對(duì)大鼠皮層和海馬中生化指標(biāo)的影響實(shí)驗(yàn)證明，依達(dá)拉奉能顯著抑制氧驚厥的發(fā)生，說(shuō)明依達(dá)拉奉可以有效地預(yù)防氧驚厥，適用于開發(fā)氧驚厥的預(yù)防藥物。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。圖1是本發(fā)明的氧驚厥發(fā)病機(jī)理及依達(dá)拉奉對(duì)氧驚厥的作用機(jī)理示意圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例1依達(dá)拉奉對(duì)氧驚厥FED潛伏期的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果及腦電圖示例圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例2中依達(dá)拉奉對(duì)皮層和海馬組織中MDA的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例2中依達(dá)拉奉對(duì)皮層和海馬組織中H2A和NO的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖5是本發(fā)明實(shí)施例2中依達(dá)拉奉對(duì)皮層和海馬組織中抗氧化酶(S0D、GPx、CAT) 的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖6是本發(fā)明實(shí)施例2中依達(dá)拉奉對(duì)皮層和海馬組織中NOS的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式為了尋找有效預(yù)防氧驚厥的藥物，本發(fā)明通過(guò)多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)，終于發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉預(yù)防氧驚厥的新用途。下面對(duì)氧驚厥的發(fā)病機(jī)理及依達(dá)拉奉的作用機(jī)理進(jìn)行簡(jiǎn)要闡述(如圖1所示)。氧驚厥的具體機(jī)制尚未明了，但已明確氧自由基(ROS)是其主要致病因素。氧驚厥的基本發(fā)病機(jī)制可概括如下在持續(xù)的高壓氧(HBO)暴露下，腦組織內(nèi)的氧分壓(PO2)增高。增高的氧分壓一方面引起ROS增多，超過(guò)腦組織內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)和過(guò)氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶的抗氧化能力，神經(jīng)細(xì)胞遭受氧化損傷， N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體受到激活，興奮性遞質(zhì)增多，抑制性遞質(zhì)減少，從而引發(fā)氧驚厥；另一方面，腦組織內(nèi)的氧分壓增高后，一氧化氮合成酶(N0Q活性增高，L-精氨酸 (L-arginine)含量增高，從而導(dǎo)致一氧化氮(NO)含量增高。在NO的作用下，腦血管功能失調(diào)，血管擴(kuò)張，腦血流增大，腦部的氧供增大，進(jìn)一步增加腦內(nèi)的氧分壓，引發(fā)氧驚厥。本發(fā)明經(jīng)下述實(shí)施例證實(shí)，依達(dá)拉奉(Edv)通過(guò)清除R0S、提高抗氧化酶水平和抑制NOS活性，可以有效抑制高壓氧導(dǎo)致的腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，減輕神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷，延長(zhǎng)氧驚厥潛伏期，從而發(fā)揮預(yù)防氧驚厥的效果。本發(fā)明的下述實(shí)施例是在整體動(dòng)物中預(yù)先給予一定量的依達(dá)拉奉，再進(jìn)行氧驚厥造模，觀察依達(dá)拉奉預(yù)防氧驚厥的效果，再進(jìn)一步研究依達(dá)拉奉對(duì)大鼠皮層和海馬組織中的脂質(zhì)過(guò)氧化、ROS、NO、抗氧化酶以及NOS水平的影響。實(shí)施例1依達(dá)拉奉對(duì)氧驚厥首次放電潛伏期的影響實(shí)驗(yàn)1)動(dòng)物準(zhǔn)備健康雄性SD大鼠，購(gòu)于美國(guó)比凱公司，第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供， 飼養(yǎng)至體重250士 IOg用于實(shí)驗(yàn)。2)氧驚厥模型的制備將動(dòng)物放入高壓氧艙后，首先用純氧以lL/s的氣流速度洗艙5min，同時(shí)監(jiān)測(cè)氧氣濃度，待氧氣濃度> 99%后，以lATA/min的速度勻速加壓至6ATA后計(jì)時(shí)，保持壓力穩(wěn)定，加壓及穩(wěn)壓過(guò)程中持續(xù)換氣(0.3L/S)。暴露過(guò)程中，艙底鋪一層鈉石灰，以吸收動(dòng)物呼出的CO2，艙內(nèi)溫度保持在22 ^°C。3)動(dòng)物分組SD大鼠12只，隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組和依達(dá)拉奉:3mg/kg體重組。體重達(dá)標(biāo)準(zhǔn)后用于實(shí)驗(yàn)。4)實(shí)驗(yàn)步驟(1)腦電極植入大鼠腹腔注射戊巴比妥(50mg/kg)，待大鼠完全麻醉后，固定于腦立體定位儀上。使其頭部頂部保持水平，用75%酒精棉球消毒皮膚，剪開頭頂部皮膚，分離皮下組織，剝離、刮掉骨膜，暴露顱骨。分別選定顱骨上適當(dāng)位置，用顱骨鉆鉆出深度為 0. 5mm的小孔皮層電極，前囟后4mm，中線左旁開2mm ；參照電極，前囟后4mm，中線右旁開 2mm。將消毒后的電極短端植入小孔，用調(diào)好的磷酸鋅黏合劑將電極固定于顱骨，縫合皮膚。全過(guò)程均無(wú)菌操作。術(shù)后將大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)3天，溫度對(duì)-261，濕度40-60%，自由進(jìn)水和攝合
P5 O(2)給藥給藥組在高壓氧暴露30min前按;3mg/kg的劑量給予依達(dá)拉奉，腹腔注射。生理鹽水對(duì)照組給予等量的0. 9%生理鹽水，腹腔注射。(3)氧驚厥潛伏期測(cè)量用大鼠固定器將大鼠軀干固定，單獨(dú)置于加壓艙內(nèi)，接好測(cè)腦電圖的電極，其中接地電極導(dǎo)線接于大鼠前額皮毛。打開生理記錄儀(P0WERLAB/8SP， AWnstrument公司，澳大利亞)，運(yùn)行腦電記錄軟件。用純氧洗艙(lL/s)，待測(cè)氧儀顯示艙內(nèi)氧濃度達(dá)到99%以上時(shí)，開始以lATA/min的速度勻速加壓至6ATA，保持壓力穩(wěn)定，開始記錄腦電，持續(xù)暴露至腦電圖上出現(xiàn)首次放電(FED)及驚厥大發(fā)作，記錄FED出現(xiàn)的時(shí)間。 艙內(nèi)溫度維持在22 ^°C。暴露結(jié)束后，以lATA/min的速度勻速減壓至常壓，出艙。結(jié)果如圖2所示，依達(dá)拉奉顯著延長(zhǎng)FED潛伏期，表明依達(dá)拉奉可有效預(yù)防氧驚厥的發(fā)作。實(shí)施例2依達(dá)拉奉對(duì)大鼠皮層和海馬中生化指標(biāo)的影響實(shí)驗(yàn)1)動(dòng)物準(zhǔn)備及分組健康雄性SD大鼠，購(gòu)于美國(guó)比凱公司，第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)至體重250士 IOg用于實(shí)驗(yàn)。將動(dòng)物隨機(jī)分配到三組中，分別為正常對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組和依達(dá)拉奉組。正常對(duì)照組不做任何處理，生理鹽水組腹腔注射與依達(dá)拉奉等量的生理鹽水后進(jìn)行高壓氧暴露，依達(dá)拉奉組腹腔注射依達(dá)拉奉(3mg/kg)后進(jìn)行高壓氧暴露。高壓氧暴露生理鹽水組和依達(dá)拉奉組動(dòng)物給藥30min后進(jìn)艙，洗艙、加壓及穩(wěn)壓過(guò)程同“實(shí)施例1”。暴露時(shí)間為20min。暴露結(jié)束后，以lATA/min的速度勻速減壓至常壓， 出艙。2)取材大鼠出艙后，腹腔注射過(guò)量戊巴比妥(100mg/kg)使大鼠安樂(lè)死，迅速斷頭，取出皮層和海馬組織，液氮冷凍后放入-80 V冰箱保存。3)腦組織中丙二醛(MDA)的測(cè)定取適當(dāng)凍存的皮層和海馬，用Western及IP細(xì)胞裂解液(碧云天公司，江蘇)進(jìn)行勻漿，組織重量占裂解液的比例為10%。勻漿完畢后用 BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天公司，江蘇)測(cè)定樣品的蛋白濃度。準(zhǔn)備好MDA檢測(cè)試劑盒(碧云天公司，江蘇)后，在離心管內(nèi)加入0. Iml勻漿液、裂解液或PBS等適當(dāng)溶液作為空白對(duì)照，加入0. Iml不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，加入0. Iml樣品用于測(cè)定；隨后加入0. 2ml MDA檢測(cè)工作液?；靹蚝螅?00°C或沸水浴加熱15min。水浴冷卻至室溫，IOOOg 室溫離心lOmin。取200 μ 1上清加入到96孔板中，隨后用酶標(biāo)儀在532nm測(cè)定吸光度。計(jì)算出樣品溶液中的MDA含量后，通過(guò)單位重量的蛋白含量來(lái)表示樣品中的MDA含量。結(jié)果表明依達(dá)拉奉可顯著降低腦組織中MDA的水平(見圖幻，說(shuō)明依達(dá)拉奉可抑制高壓氧導(dǎo)致的脂質(zhì)氧化損傷。4)腦組織中H2A和NO的測(cè)定①H2A的測(cè)定取皮層和海馬，按照每IOmg組織加入200微升Wfestern及IP細(xì)胞裂解液(碧云天公司，江蘇)的比例進(jìn)行勻漿。4°C約12000g 離心5min，取上清。先把過(guò)氧化氫檢測(cè)試劑在冰上或冰水浴上融解，在檢測(cè)孔或檢測(cè)管內(nèi)加入50 μ 1樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，然后在每個(gè)孔內(nèi)加入100 μ 1過(guò)氧化氫檢測(cè)試劑。輕輕振蕩或敲打混勻，室溫放置30min。然后立即測(cè)定A560，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中過(guò)氧化氫的濃度。②NO的測(cè)定將組織樣品勻漿，12000g離心5min，取上清。用勻漿液把IOmmol/L KNO2稀釋成2、5、10、20、50ymol/L。準(zhǔn)備好NO測(cè)定試劑盒(碧云天公司，江蘇)，按照說(shuō)明書依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和檢測(cè)試劑，室溫(25°C)孵育IOmin后測(cè)定A540。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線計(jì)算出樣品中NO的濃度。結(jié)果表明依達(dá)拉奉可顯著降低腦組織H2A和NO水平(見圖4)，說(shuō)明依達(dá)拉奉可抑制高壓氧導(dǎo)致的脂質(zhì)氧化損傷。5)腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)和過(guò)氧化氫酶 (CAT)三種抗氧化酶的測(cè)定①SOD的檢測(cè)動(dòng)物用生理鹽水(含0. 16mg/ml肝素鈉)灌流清除血液后獲取皮層和海馬。取適量組織加入碧云天的Western及IP細(xì)胞裂解液(碧云天公司，江蘇)在冰浴中進(jìn)行勻漿(組織濃度為10%)，4°C離心取上清。準(zhǔn)備好SOD檢測(cè)試劑盒(碧云天公司，江蘇)，在96孔板中加入樣品和各種空白對(duì)照孔，加入酶工作液后充分混勻。37°C孵育20min，然后在450nm測(cè)定吸光度，計(jì)算出SOD酶活力。②GI3x的檢測(cè)樣品準(zhǔn)備同SOD檢測(cè)。準(zhǔn)備好試劑盒后，在離心管中依次加入檢測(cè)緩沖液、待測(cè)樣品和GI5x檢測(cè)工作液，混勻。加入4微升15mmol/L過(guò)氧化物試劑溶液后，用振蕩器適當(dāng)混勻。在25°C下測(cè)定A340，每隔30秒測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定:3min。計(jì)算GPx酶活力。③CAT的測(cè)定取皮層和海馬，用Western及IP細(xì)胞裂解液(碧云天公司，江蘇)裂解組織(組織濃度為10%)，再加入等體積的過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液稀釋樣品。準(zhǔn)備好CAT檢測(cè)試劑盒(碧云天公司，江蘇)，先測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。參考試劑盒說(shuō)明書，取10 μ 1樣品至1. 5ml塑料離心管中，加入過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液至體積為40微升，混勻。再加入10微升250mmol/L過(guò)氧化氫溶液，用移液器迅速混勻。25°C反應(yīng):3min。結(jié)束后加入450 μ 1過(guò)氧化氫酶反應(yīng)終止液，顛倒混勻以終止反應(yīng)。立即在另一塑料離心管內(nèi)加入40 μ 1過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液，再加入10 μ 1已終止并混勻的上述反應(yīng)體系，混勻，從中取10 μ 1加入到96孔板中的一個(gè)孔內(nèi)。加入200 μ 1 顯色工作液。25°C孵育20min后測(cè)定A520，計(jì)算CAT活性。結(jié)果表明，和對(duì)照組相比，依達(dá)拉奉可顯著提高腦組織中S0D、GPx、CAT三種抗氧化酶的水平(見圖幻，減輕神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷。6)腦組織中一氧化氮合成酶(NOS)的測(cè)定動(dòng)物用生理鹽水(含0. 16mg/ml肝素鈉)灌流清除血液后獲取皮層和海馬。取0. Ig組織加9倍的生理鹽水0. 9ml制備成10% 組織勻漿，3000rpm離心lOmin。取上清50 μ 1測(cè)NOS活力。準(zhǔn)備好NOS測(cè)定試劑盒(南京建成公司，南京)，Stnos(Snos)空白管、tnos測(cè)定管、iNos(誘導(dǎo)型nos)空白管和iNos 測(cè)定管，在測(cè)定管中加入雙蒸水、上清液和各種試劑，混勻，在530nm處測(cè)定各管的吸光度值，計(jì)算TNOS和iNOS值，cN0S(結(jié)構(gòu)型N0S)值即為TNOS值與iNOS值之差。結(jié)果表明依達(dá)拉奉可顯著降低腦組織的TNOS和cNOS水平(見圖6)，減輕神經(jīng)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)， 在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種依達(dá)拉奉的用途，其特征在于，用于制備預(yù)防氧驚厥的藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述依達(dá)拉奉的給藥方式包括肌肉注射或靜脈滴注。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物的劑型包括注射劑。
全文摘要
本發(fā)明公開一種依達(dá)拉奉的用途，用于制備預(yù)防氧驚厥的藥物。本發(fā)明依達(dá)拉奉能有效提高抗氧化酶水平、清除氧自由基、抑制一氧化氮合酶活性，降低一氧化氮含量，從而有效預(yù)防氧驚厥的發(fā)生，適用于開發(fā)氧驚厥的預(yù)防藥物。
文檔編號(hào)A61P25/08GK102552249SQ20121000227
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月5日
發(fā)明者劉書林, 徐偉剛, 李昱, 李潤(rùn)平, 蔡志宇 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)