專利名稱：硫氧還蛋白在治療膿毒血癥并預(yù)防其導(dǎo)致的mods藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用小分子蛋白質(zhì)藥物治療疾病領(lǐng)域，更具體地說，涉及人源性硫氧還蛋白在發(fā)揮器官保護(hù)作用而治療或預(yù)防膿毒血癥導(dǎo)致的MODS的應(yīng)用及其機(jī)制。
背景技術(shù)：
膿毒血癥是一種常見而且致命的疾病，其實(shí)質(zhì)是一種被惡性擴(kuò)大的炎癥反應(yīng)。雖然人們認(rèn)識(shí)炎癥反應(yīng)已有數(shù)十年，但最初對(duì)于這種炎癥反應(yīng)的定義千變?nèi)f化。直到1992 年，美國(guó)胸內(nèi)科醫(yī)師學(xué)會(huì)(American College of Chest physicians, ACCP)和危癥監(jiān)護(hù)醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)(Society for Critical Care Medicine, SCCM)將其統(tǒng)一定義為全身炎癥反應(yīng)綜合癥(Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)，并在此基礎(chǔ)上衍生膿毒血癥(s印sis)、重癥膿毒血癥(severe sepsis)和膿毒癥性休克(Sepsis shock)。隨著膿毒血癥的進(jìn)一步發(fā)展，往往會(huì)引起機(jī)體各個(gè)臟器的功能不全，出現(xiàn)多臟器功能障礙綜合征 (Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS)。由于人口的老齡化，介入性治療及有創(chuàng)性監(jiān)護(hù)增多，濫用抗生素使耐藥菌增多，腫瘤、糖尿病、化療、放療、免疫抑制劑的應(yīng)用，以及醫(yī)院內(nèi)感染增多等，使得膿毒血癥的發(fā)病率也逐年攀升。膿毒血癥是當(dāng)今創(chuàng)傷外科和危重病醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中研究的熱點(diǎn)課題。膿毒血癥是一類與休克和感染等應(yīng)激打擊關(guān)系密切，很可能是由失控的全身炎癥和細(xì)胞氧化代謝障礙所致的急性器宮損傷。因此膿毒血癥和MODS密不可分，長(zhǎng)久以來其發(fā)病率和死亡率一直居高不，尤其是在重癥監(jiān)護(hù)室，膿毒血癥、MODS是引起死亡主要的原因之一，因此有關(guān)于膿毒血癥的研究成了醫(yī)學(xué)界一個(gè)挑戰(zhàn)。目前缺少非常有效治療膿毒癥尤其是伴有MODS的方法，主要是對(duì)膿毒癥發(fā)病機(jī)制還沒有完全了解，因此建立一個(gè)合理的動(dòng)物膿毒血癥模型，有助于了解膿毒血癥的發(fā)生過程，以及發(fā)展成MODS的過程，并為臨床上解決膿毒血癥提供有力的幫助。正是由于膿毒血癥的高發(fā)病率、高死亡率，2002年10月歐美國(guó)家多個(gè)組織共同發(fā)起并簽署了“巴塞羅那宣言”，呼吁全球醫(yī)務(wù)人員、專業(yè)組織、政府、衛(wèi)生機(jī)構(gòu)甚至公眾對(duì)該行動(dòng)的支持，力爭(zhēng)5年內(nèi)將膿毒癥的病死率減少25%。因此，人們對(duì)于這種疾病治療的研究一直沒有停止過。近來出現(xiàn)許多干預(yù)措施來治療膿毒血癥，如早期目標(biāo)導(dǎo)向治療(Early goal-directed therapy, EGDT)、激素(corticosteroid)以及重組人活化蛋白 C(recombinant human activated protein C，rhAPC)等等，但這些治療都存在一定的局限性。在E⑶T問世4年后，Reuben等人調(diào)查了英國(guó)173個(gè)急救部門的實(shí)施情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有18. 8%的急救部門才能完整采取EGDT措施。至于激素的使用，一直存在爭(zhēng)議，有研究者認(rèn)為即使能短期改善患者的呼吸機(jī)使用天數(shù)或者減少ICU的天數(shù)，但這并不意味能夠降低死亡率。rhAPC用于膿毒血癥已有一段時(shí)間，雖然著名的PR0TOSS和ADDRESS臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)能夠降低膿毒血癥的死亡率，但是亞組分析顯示，在低危人群中(APACHE II<20)rhAPC沒有治療上的益處。正是由于目前的治療還不足以解決膿毒血癥的一系列問題，所以迫切需要新的治療方法來干預(yù)疾病的進(jìn)程，改善膿毒血癥的預(yù)后。之所以出現(xiàn)上述治療上的困難，主要由于目前對(duì)于膿毒血癥的發(fā)病機(jī)制還不是最明確，往往認(rèn)為其和內(nèi)毒素(多由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生)相關(guān)。但臨床事實(shí)是，近一半的患者血培養(yǎng)陰性，因?yàn)槟摱狙Y還可以繼發(fā)于各種創(chuàng)傷、燒傷、胰腺炎等。即，對(duì)于膿毒血癥導(dǎo)致的MODS，經(jīng)過抗生素治療可在疾病前期搶的關(guān)鍵治療時(shí)間窗，而在病程發(fā)展中，細(xì)菌或病灶內(nèi)細(xì)菌會(huì)釋放出大量?jī)?nèi)毒素至血液，而對(duì)于此部分的損傷，抗生素治療無效。細(xì)菌內(nèi)毒素具有十分復(fù)雜的生物學(xué)活性，可引起一系列病理生理改變，包括休克、彌散性血管內(nèi)凝血 (DIC)、引起或加重MODS至多器官衰竭(MFS)等。因此，拮抗內(nèi)毒素及阻斷或減弱其介導(dǎo)的損傷對(duì)膿毒血癥及其導(dǎo)致的MODS具有重要臨床意義。脂多糖(LPQ是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成部分，包括脂質(zhì)A(Lipid Α)、核心多糖、特異性多糖三個(gè)成分。習(xí)慣上即將LPS稱為內(nèi)毒素，其中由脂質(zhì)A發(fā)揮內(nèi)毒素活性，氧化應(yīng)激及其后的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)被證實(shí)是LPS 致死的重要原因。到目前為止，由于MODS的復(fù)雜病因及LPS所導(dǎo)致的廣泛器官、組織損傷， 目前其治療主要以支持療法為主，包括抗生素和補(bǔ)液及升壓藥的使用。盡管近30年以來， 抗生素一代一代地更新，但膿毒血癥及其導(dǎo)致的MODS的病死率并無明顯下降。我們可以客觀地評(píng)價(jià)，應(yīng)用抗生素殺菌抑菌，以及一切常規(guī)治療和支持治療，并不能改善膿毒血癥預(yù)后，我們必須探尋治療的新對(duì)策。多粘菌素B(polymyxin B, PMB)雖能夠滅活內(nèi)毒素和抑制革蘭陰性細(xì)菌，但由于其對(duì)腎有毒副作用，以及難以從血液中清除，因此血液給PMB治療 MODS受到限制。因此，亟需開發(fā)一類效果可靠、副反應(yīng)較少、應(yīng)用簡(jiǎn)單的藥物填補(bǔ)這一領(lǐng)域的空白。硫氧還蛋白(Trx)系統(tǒng)，包括Trx、Trx還原酶(TrxR)、NADPH和Trx過氧化物酶 (TrxP)，是一個(gè)控制細(xì)胞氧化/還原(redox)狀態(tài)和細(xì)胞增殖/生存的、在細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)的氧化還原酶系統(tǒng)。在Trx的催化中心含有兩個(gè)氧化還原敏感的胱氨酸組成的保守序列 胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸-胱氨酸，即Trx的活性中心。Trx可以還原狀態(tài)(硫氫鍵)或氧化狀態(tài)(二硫鍵)存在，該活性中心硫氫鍵和二硫鍵的可逆轉(zhuǎn)換參與細(xì)胞內(nèi)的氧化/還原過程。因此，Trx系統(tǒng)被認(rèn)為是除谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)系統(tǒng)之外的另一內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)。除了氧化/還原酶的活性之外，Trx可通過調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞活性及遷移而發(fā)揮抗炎作用。重組人源性硫氧還蛋白(rhTrx)可治療一些伴有白細(xì)胞浸潤(rùn)的疾病，包括細(xì)胞因子或抗癌藥物誘導(dǎo)的肺損傷、短暫定位性腦缺血、自體免疫性心肌炎等。然而，rhTrx可否用于治療動(dòng)物MODS在國(guó)內(nèi)外卻鮮有報(bào)道。因此，本發(fā)明擬闡述的內(nèi)容是確認(rèn)rhTrx在治療或預(yù)防動(dòng)物MODS時(shí)的療效并解釋其具體作用機(jī)制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于確認(rèn)人源性硫氧還蛋白對(duì)動(dòng)物膿毒血癥的治療效果或預(yù)防效果、尤其是其對(duì)伴發(fā)MODS的動(dòng)物的被損傷器官的修復(fù)作用，以及對(duì)可能伴發(fā)MODS的動(dòng)物的器官的保護(hù)作用，并解釋其具體作用機(jī)制，以期為應(yīng)用小分子蛋白質(zhì)藥物治療或預(yù)防疾病領(lǐng)域，如膿毒血癥，提供直接依據(jù)。本發(fā)明公開了人源性硫氧還蛋白在制備治療動(dòng)物膿毒血癥的藥物中的應(yīng)用，特別是在制備治療動(dòng)物膿毒血癥引發(fā)的MODS的藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于在患有膿毒血癥的動(dòng)物中，可減輕動(dòng)物的心臟損傷、肺損傷、肝臟損傷、腎損傷，其中人源性硫氧還蛋白的有效劑量為0. 5mg/kg動(dòng)物體重。本發(fā)明還公開了人源性硫氧還蛋白在制備預(yù)防動(dòng)物膿毒血癥引發(fā)的MODS的藥物中的應(yīng)用，所述藥物保護(hù)可能患有膿毒血癥動(dòng)物的器官免于受損，其中人源性硫氧還蛋白的有效劑量為0. 5mg/kg動(dòng)物體重。上述應(yīng)用中，所述動(dòng)物為豬或人。本發(fā)明還公開了一種用于治療或預(yù)防動(dòng)物膿毒血癥引發(fā)的MODS的藥物組合物或藥用制劑，其包含治療有效劑量的人源性硫氧還蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。其中，用腹腔注射0. 5mg/Kg的人源性硫氧還蛋白治療動(dòng)物膿毒血癥導(dǎo)致的MODS 時(shí)，顯著提高了危重膿毒血癥的生存率。人源性硫氧還蛋白治療動(dòng)物膿毒血癥導(dǎo)致的MODS時(shí)，可顯著降低血清Trop I、 mb、CKmb含量，即減輕膿毒血癥模型的心臟損傷。人源性硫氧還蛋白治療動(dòng)物膿毒血癥導(dǎo)致的MODS時(shí)，可顯著降低每分呼吸次數(shù)， 并減少肺部滲出，從而防止呼吸窘迫并降低肺損傷。人源性硫氧還蛋白治療動(dòng)物膿毒血癥導(dǎo)致的MODS時(shí)，可顯著降低血清AST/ALT、 AST及血清總膽紅素濃度，從而減輕致死性膿毒血癥模型的肝臟損傷，提高危重膿毒血癥的生存率。人源性硫氧還蛋白治療動(dòng)物膿毒血癥導(dǎo)致的MODS時(shí)，可顯著降低血清肌酐、尿素含量，即顯著降低腎損傷，可維護(hù)血液各細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，即降低血細(xì)胞損傷。本發(fā)明的研究表明，人重組硫氧還蛋白分子量小，生物學(xué)活性強(qiáng)，而且給藥后反應(yīng)迅速，生物利用度好，有著很好的臨床應(yīng)用前景。申請(qǐng)人:還發(fā)現(xiàn)1.在用腹腔注射2. 0mg/Kg的LPS制作豬膿毒血癥導(dǎo)致的MODS模型時(shí)，可使心、 肺、肝、腎等重要器官發(fā)生損傷，并出現(xiàn)功能障礙。且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在損傷后8小時(shí)內(nèi)全部死亡。2. Trx可以治療豬膿毒血癥導(dǎo)致的MODS在于可以在在體情況下與LPS發(fā)生特異性
纟口口?？傊鲜鲅芯孔C實(shí)，硫氧還蛋白可以明顯減輕膿毒血癥癥狀，還可以保護(hù)膿毒血癥動(dòng)物的器官，如減輕心臟損傷、防止呼吸窘迫、降低肺損傷、減輕肝臟損傷、降低腎損傷等。當(dāng)可能導(dǎo)致膿毒血癥的感染源進(jìn)入了動(dòng)物體，給予該動(dòng)物體硫氧還蛋白后，可以避免膿毒血癥及其導(dǎo)致的MODS的發(fā)生，提升動(dòng)物的生存率。本發(fā)明的使用對(duì)象是發(fā)生膿毒血癥和/或伴發(fā)MODS、尤其是心肺損傷癥狀嚴(yán)重的患者。本發(fā)明簡(jiǎn)單易行，且無特殊禁忌癥，可在大醫(yī)院、小診所等廣泛使用。


圖1腹腔注射2. 0mg/kg的LPS，可成功建立豬膿毒血癥導(dǎo)致的MODS模型，以心肺損傷最為明顯，并使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部死亡；A 2. 0mg/kg的LPS使得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部死亡；B 2. 0mg/kg的LPS可造成心臟損傷；C 2. 0mg/kg的LPS造成呼吸窘迫及肺部滲出；D 2. 0mg/kg的LPS造成肝功能受損；
E 2. Omg/kg的LPS造成腎功受損；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后，用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，* control vs. 2. Omg/kg ；# control vs. 1. 5mg/kg ； Δ :1. 5mg/kg vs. 2. Omg/kg 氺，ρ < 0. 05 ；氺氺，ρ < 0. 01 ；氺氺氺，ρ < 0. 001。圖2給予Trx治療，可以減輕動(dòng)物膿毒血癥損傷，以心肺保護(hù)作用最為明顯，并顯著提高動(dòng)物生存率；A =Trx治療顯著模型生存率；B =Trx治療顯著減輕心臟損傷；C =Trx治療顯著環(huán)節(jié)呼吸窘迫并減少肺部滲出；D =Trx治療顯著減輕肝臟損傷；E =Trx治療顯著降低腎臟損傷；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后，用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，* control vs. LPS ；# control vs. LPS+Trx ； Δ :LPS vs. LPS+Trx。氺，ρ < 0. 05 ；ρ < 0. 01 ；氺氺氺，ρ < 0. 001ο圖3給予Trx治療，可以減輕動(dòng)物MODS時(shí)血細(xì)胞損傷；A =Trx維持嗜堿粒細(xì)胞絕對(duì)值；B =Trx穩(wěn)定紅細(xì)胞計(jì)數(shù)；C =Trx穩(wěn)定血細(xì)胞比容；D =Trx穩(wěn)定血小板計(jì)數(shù)；E:Trx穩(wěn)定白細(xì)胞計(jì)數(shù)；F =Trx穩(wěn)定嗜堿粒細(xì)胞百分率；G =Trx穩(wěn)定紅細(xì)胞分布寬度CV ；H =Trx 穩(wěn)定紅細(xì)胞分布寬度 SD ；* :control vs. LPS ；# :control vs. LPS+Trx ； Δ LPS vs. LPS+Trx。氺，ρ < 0. 05 ；氺氺，ρ < 0. 01 ；氺氺氺，ρ < 0. 001。圖4豬MODS模型血清中，LPS可以與Trx特異性結(jié)合的免疫共沉淀檢測(cè)圖。以下結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式1.建立動(dòng)物MODS模型及研究方案用脂多糖(LPS，2. Omg/kg)處理成年小香豬，檢測(cè)機(jī)體多個(gè)器官的損傷情況，并觀察動(dòng)物存活時(shí)間。其中，在給予LPS處理后全程采用床旁監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè)動(dòng)物生命體征，并在 LPS后1、2、4、6小時(shí)，檢測(cè)心損三項(xiàng)、肝功七項(xiàng)、腎功兩項(xiàng)、血常規(guī)等血清學(xué)指標(biāo)，每次抽取血液12ml，并在6小時(shí)時(shí)行X線平片觀察肺部損傷。1)豬MODS模型的建立及Trx治療體重為15到20公斤的雄性小香豬，隨機(jī)分組， 每組動(dòng)物6-8只。動(dòng)物禁食12h，自由飲水，肌肉注射戊巴比妥(3%，0.8ml/kg)予以鎮(zhèn)靜。 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，消毒備皮，并使用小棉被為動(dòng)物保暖。使用22G靜脈留置針建立耳緣靜脈通路，予鹽酸氯胺酮10mg/kg/h和芬太尼5 μ g/kg/h持續(xù)鎮(zhèn)靜麻醉，并隨時(shí)根據(jù)動(dòng)物麻醉情況進(jìn)行調(diào)整。使用微量注射泵輸注乳酸林格氏液補(bǔ)液，補(bǔ)液量按照每個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的血液損失量進(jìn)行。動(dòng)物監(jiān)護(hù)及處理情況以臨床護(hù)理5歲兒童為參考進(jìn)行。2)股動(dòng)脈有創(chuàng)血壓監(jiān)測(cè)消毒備皮股動(dòng)脈搏動(dòng)處，鈍性分離股動(dòng)脈，結(jié)扎股動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，置肝素化后的4FrPiCC0動(dòng)脈導(dǎo)管穿刺入股動(dòng)脈，供抽取動(dòng)脈血標(biāo)本用并縫線固定。肝素化生理鹽水浸潤(rùn)Picco重癥監(jiān)護(hù)儀上的血管能量轉(zhuǎn)換器，并連接動(dòng)脈導(dǎo)管。觀察是否有隨脈搏一致的管內(nèi)血液波動(dòng)情況，如果沒有，說明并未連接成功，繼續(xù)調(diào)整或重新穿刺。3)檢測(cè)動(dòng)物一般情況將Picco重癥監(jiān)護(hù)儀數(shù)值調(diào)零，監(jiān)測(cè)動(dòng)物心率、血壓(收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓)、體溫、血氧飽和度、呼吸等各項(xiàng)生理指標(biāo)。平衡15-30分鐘，待各項(xiàng)指標(biāo)趨于平穩(wěn)。4)使用LPS按2. Omg/kg劑量腹腔注射建立豬MODS模型LPS (Sigma, L28801)，使用生理鹽水稀釋到8ml，然后行腹腔注射。使用Trx進(jìn)行治療時(shí)，在LPS腹腔注射后，立即在腹腔另一側(cè)按照0. 5mg/kg的劑量注射。5)血清樣本采集在LPS損傷后1、2、4、6小時(shí)，和/或給予1Trx治療后1、2、4、6、 12、24、48、72、120、168小時(shí)進(jìn)行采集，對(duì)照組血清樣本采集時(shí)間同Trx治療組。樣本分別用于心損三項(xiàng)、肝功七項(xiàng)、腎功兩項(xiàng)、血常規(guī)、內(nèi)毒素含量檢測(cè)、其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)所用的血清樣本量，每次約12ml。6)肺濕干比重處死動(dòng)物后，用組織鉗夾住右肺中葉，取出整個(gè)右側(cè)肺葉。擦干凈表面血液后，稱重。放入80攝氏度烘箱內(nèi)，烘干3天至重量不再變化。7) X線胸腹平片采集在處理后6小時(shí)時(shí)，將動(dòng)物捆綁成仰臥位，并保持持續(xù)麻醉狀態(tài)，行X線胸腹部平片拍攝。8)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11. 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，測(cè)定結(jié)果均采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間統(tǒng)計(jì)采用雙因素方差分析結(jié)果腹腔注射2. Omg/kg的LPS，可成功建立豬MODS模型。如圖1所示，2. Omg/ kg的LPS使得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部死亡。2. Omg/kg的LPS可造成心臟損傷、造成呼吸窘迫及肺部滲出、造成肝功能受損、造成腎功受損，其中，以心肺損傷最為明顯。2、對(duì)患有MODS的動(dòng)物給予人源性硫氧還蛋白通過基因重組的方法獲得人源性硫氧還蛋白。對(duì)患有MODS的動(dòng)物給予人源性硫氧還蛋白(0. 5mg/kg)，檢測(cè)機(jī)體多個(gè)器官的損傷情況，并觀察動(dòng)物存活時(shí)間。在LPS腹腔注射后，立即使用0. 5mg/kg的Trx注射入腹腔。為確定Trx最低有效劑量的數(shù)值，我們采用了 0. 5mg/kg、2mg/kg兩種治療劑量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組治療結(jié)果之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(數(shù)據(jù)未顯示)。檢測(cè)方法及指標(biāo)同上。從圖2中可以看出，給予人源性硫氧還蛋白治療后，可以減輕豬MODS損傷。人源性硫氧還蛋白治療顯著減輕心臟損傷，顯著緩解呼吸窘迫并減少肺部滲出，顯著減輕肝臟損傷，顯著降低腎臟損傷，其中，以心肺保護(hù)作用最為明顯，并顯著提高了動(dòng)物生存率。3、進(jìn)一步試驗(yàn)，用免疫共沉淀檢測(cè)LPS與Trx的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)Trx治療MODS時(shí)可與LPS發(fā)生結(jié)合。1)用預(yù)冷所需工具，準(zhǔn)備干冰，切IOOmg組織；2)加入預(yù)冷的 RIPA Buffer ；3)將組織裂解并把懸液轉(zhuǎn)到1. 5EP管中，4°C，緩慢晃動(dòng)15min (EP管插冰上，置水平搖床上)；
4) 40C，14000g離心15min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中；5)準(zhǔn)備ftOtein A agarose，用PBS洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠；6)每 Iml 總蛋白中加入 100 μ 1 Protein A 瓊脂糖珠(50% )，4°C搖晃 IOmin (EP 管插冰上，置水平搖床上)，以去除非特異性雜蛋白，降低背景；7)4°C，14000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，去除ftx)tein A珠子；8)Bradf0rd法做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定蛋白濃度，測(cè)前將總蛋白至少稀釋1 10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響(定量，分裝后，可以在-20°C保存一個(gè)月)；9)用PBS將總蛋白稀釋到約1 μ g/μ 1，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高(如IOyg/μ 1)；10)加入一定體積的兔抗到500μ 1總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異；11)4°C緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過夜或室溫池，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用 2h室溫孵育；12)加入ΙΟΟμΙ Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復(fù)合物，4°C緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過夜或室溫lh，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μ 1 “過渡抗體”(兔抗鼠 IgG)；13) HOOOrpm瞬時(shí)離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的 RIPA buffer洗3遍，800 μ 1/遍，RIPA buffer有時(shí)候會(huì)破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用PBS;14)用60μ 1 2Χ上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定(60 μ 1足夠上三道)；15)將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時(shí)凍-20°C，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5min變性。16)行SDS-PAGE變性膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，并使用Trx抗體、LPS抗體進(jìn)行檢測(cè)。4、Trx藥代動(dòng)力學(xué)、一般藥理、動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)、用藥部位刺激和注射用藥過敏試驗(yàn)研究采用小鼠、大鼠、家兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行毒性、過敏原、半衰期、藥物代謝途徑、 動(dòng)物行為及一般情況等。其中小鼠、大鼠采用肌肉注射給藥方式，給藥量2. 0mg/kg;家兔采用肌肉注射給藥方式，給藥量同上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)Trx的藥代動(dòng)力學(xué)研究采用雙抗體夾心ELISA法，代謝方式符合一室 (im)開放模型，呈一級(jí)動(dòng)力學(xué)消除。肌注絕對(duì)生物利用度為70.0% (小鼠)；腎、肺組織中分布最高；半衰期在小鼠體內(nèi)是1小時(shí)；藥物以降解產(chǎn)物形式主要通過尿液排泄。對(duì)Trx的一般藥理研究發(fā)現(xiàn)對(duì)大鼠自發(fā)性活動(dòng)、平衡和一般行為無影響；對(duì)心率、 心電圖、血壓、呼吸頻率及幅度無影響。Trx動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠、大鼠的最大耐受量分別為人臨床擬用量的675 和253倍，說明本品對(duì)小鼠、大鼠均不能引出急性毒性反應(yīng)。rhTrx毒性太低，無法測(cè)得 LD50。Trx用藥部位刺激和注射用藥過敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)家兔肌肉注射無刺激性，組織大體解剖觀察及病檢均未見異常，不引起過敏反應(yīng)。2.研究結(jié)果1)外源性給予動(dòng)物2. Omg/kg的LPS處理，可機(jī)體重要器官發(fā)生損傷即誘發(fā)MODS， 并造成生存率急劇下降；2)給予Trx治療可以顯著降低心、肺、肝、腎等重要臟器的損傷，并提高動(dòng)物生存率。綜上所述，申請(qǐng)人利用動(dòng)物膿毒血癥誘導(dǎo)MODS模型研究發(fā)現(xiàn)，該模型小香豬心、 肺、肝、腎功能均受到嚴(yán)重?fù)p傷，并且使得動(dòng)物生存率急劇降低。而給予Trx治療之后，不僅避免了膿毒血癥動(dòng)物MODS的發(fā)生，而且使得動(dòng)物生存率大大提升。Trx治療機(jī)制與內(nèi)毒素通過糖基化反應(yīng)和Trx結(jié)合有關(guān)，從而明顯減輕膿毒血癥及其引發(fā)的MODS癥狀，有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。膿毒血癥可以出現(xiàn)在多系統(tǒng)的多種疾病中，發(fā)生率也相對(duì)較高。除導(dǎo)致致死性休克、彌漫性血管內(nèi)凝血等，膿毒血癥通常還會(huì)直接或間接損害心、肺、肝、腎等重要臟器，誘發(fā)MODS，病死率極高。因此膿毒血癥的主要治療原則之一減少內(nèi)毒素的產(chǎn)生和吸收，申請(qǐng)人則在國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白可通過糖基化反應(yīng)中和內(nèi)毒素，從而減輕機(jī)體重要臟器損傷，促進(jìn)各個(gè)器官功能回復(fù)，在膿毒血癥中發(fā)揮器官保護(hù)作用；且人源性重組硫氧還蛋白分子量小，生物利用度好；相比于動(dòng)物源性制劑，免疫原性??；腹腔注射，簡(jiǎn)單方便。因此，它在膿毒血癥及其引發(fā)的MODS的治療方面有著良好的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.人源性硫氧還蛋白在制備治療動(dòng)物MODS(Multiple Organ Dysfunction Syndrome, MODS)的藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于在患有MODS的動(dòng)物中，可降低血清Trop I、mb、CKmb 含量，即減輕患有MODS疾病的動(dòng)物的心臟損傷；可降低每分鐘呼吸次數(shù)，并減少肺部滲出， 從而防止呼吸窘迫并降低肺損傷；可降低血清AST/ALT、AST及血清總膽紅素濃度，從而減輕由致死性膿毒血癥引起的肝臟損傷，提高危重膿毒血癥的生存率；可降低血清肌酐、尿素含量，即降低腎損傷，可維護(hù)血液各細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，即降低血細(xì)胞損傷。
2.人源性硫氧還蛋白在制備預(yù)防動(dòng)物MODS的藥物中的應(yīng)用，所述藥物保護(hù)可能患有 MODS的動(dòng)物的器官免于受損。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述器官為心臟、肺、肝臟、腎臟。
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述動(dòng)物為豬。
5.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述動(dòng)物為人。
6.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于其中人源性硫氧還蛋白的有效劑量為0. 5mg/kg動(dòng)物體重。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人源性小分子抗氧化抗炎蛋白質(zhì)一硫氧還蛋白(Trx)在制備治療膿毒血癥及預(yù)防其導(dǎo)致的多器官功能障礙(MODS)中的應(yīng)用；硫氧還蛋白可以明顯減輕膿毒血癥癥狀，還可以保護(hù)患有膿毒血癥疾病動(dòng)物的器官，防治MODS的發(fā)生，如減輕心臟損傷、防止呼吸窘迫、降低肺損傷、減輕肝臟損傷、降低腎損傷等。當(dāng)可能導(dǎo)致膿毒血癥的感染源進(jìn)入了動(dòng)物體，給予該動(dòng)物體硫氧還蛋白后，可以避免MODS的發(fā)生，提升動(dòng)物的生存率。
文檔編號(hào)A61P7/00GK102552887SQ20121000673
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者劉靜祎, 屈延, 許愛斌, 陶凌 申請(qǐng)人:陶凌