專利名稱：一種絞股藍葉提取物及其制備治療腫瘤藥物的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種富含達木林A、達木林B、gypenoside L和gypenoside LI的絞股藍(Gynostemma pentaphyllum)葉提取物，該提取物的制備方法，以及該提取物和這4種皂苷類化合物在制備治療腫瘤藥物中的用途。
背景技術：
絞股藍為葫蘆科(Cucurbitaceae)絞股藍屬(Gynostemma)絞股藍Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino的全草[1]，具有清熱解毒，止咳祛痰功能。又稱“七葉膽”、 “蛇王”、“甘茶蔓”、“公羅鍋底”、“小苦藥”等?！侗静菥V目》中對絞股藍有如下記載“五葉藤治瘡癤、蟲咬、涼血解毒、利小便”。由于絞股藍含有與人參相似的達瑪烷類皂苷，又被冠予 “南方人參”、“第二人參”的美譽[2][5_7]，此外，絞股藍還含有多糖類[3’4]、黃酮類成分[8]、氨基酸[9]、無機鹽_等。現(xiàn)代藥理學表明，絞股藍具有抗癌作用、抗氧化作用、降血糖作用[11]、 降血脂作用[11’12]、增強免疫作用等。國內主要是生長在長江以南，中國的陜西，云南，湖北， 湖南，廣東，廣西，福建等地。目前國內有絞股藍茶、絞股藍濃縮汁、絞股藍龍須茶、富硒養(yǎng)生茶等多個系列產品。絞股藍中最主要的藥效成分是皂苷類成分。研究表明，人參屬植物中抗癌活性與低極性、稀有或微量人參皂苷直接相關，如稀有人參皂苷他2、Rg3、Rb3等藥效更為珍貴，在某些難治性疾病腫瘤治療方面顯示獨特的療效[13’14]。但是在天然植物中人參皂苷Rbl含量較高，而Rg3、I h2、Compand K等含量甚微。對于有些有較強活性的稀有皂苷，來源有限而且存在于植物內含量較低，用傳統(tǒng)的分離方法，不但需要大量的藥用資源，而且得率也低。因此，如何提高稀有活性成分的含量或獲得更有活性的成分成為現(xiàn)代藥學研究的重點。利用高溫高壓方法，絞股藍熱處理產物與原植物相比，具有更強的抗腫瘤活性。熱加工后的絞股藍提取物為抗癌藥提供理論依據(jù)。參考文獻[1]梁啟成，鐘鳴，中國狀藥學[M]，廣西民族出版社，2005.[2]張濤，袁弟順.中國絞股藍種質資源研究進展[J].云南農業(yè)大學學報，2009， 24(3) :459-469.[3] Yin F, Zhang YN, Yang ZY, et al. Nine new dammarane saponins from Gynostemma pentaphyllum[J]. Chem Biodivers,2006,3(7) :771-782.[4]Huang TH, Li Y, Razmovski-Naumovski V,et al. Gypenoside XLIX isolated from Gynostemma pentaphyllum inhibits nuclear factor-kappaB activation via a PPAR-alpha-d印endent pathway[J]. J Biomed Sci,2006,13(4) :535-548.[5]Liu X,Ye W,Mo Z,et al. Three dammarane-type saponins from Gynostemma pentaphyllum[J], Planta Med，2005，71(9) :880-884.[6]Hu JH, Li Q W, Zhang T, et al. Effect of Gynostemma Pentaphyllum polysaccharide on boar spermatozoa quality following freezing-thawing[J].Cryobiology，2009，59(3) :244-249.[7]Yang X，Zhao Y，Yang Y，et al. Isolation and characterization of immunostimulatory polysaccharide from an herb tea， Gynostemma pentaphyllum Makino[J] .J Agric Food Chem，2008，56(16) :6905-6909.[8]Kao TH, Huang SC, Inbaraj BS, et al. Determination of flavonoids and saponins in Gynostemma pentaphylIum (Thunb. )Makino by Iiquid chromatography-mass spectrometry[J]. Anal Chim Acta，2008，626(2) :200-211.[9]徐翠鳳，羅嘉梁，王碧蘭，et al.絞股藍化學成分分析[J].林產化工通訊， 1994,2(3-6.[10]彭小列，劉世彪.有開發(fā)前景的植物性飼料添加劑-絞股藍[J].河北畜牧獸醫(yī)，2005，21 (8) :40-41.[ll]Megalli S, Davies NM, Roufogalis BD. Anti-hyperlipidemic and hypoglycemic effects of Gynostemma pentaphyllum in the Zucker fatty rat[J]. J Pharm Pharm Sci，2006，9(3) :281-291.[12]Huang TH, Tran VH, Roufogalis BD, et al. Gypenoside XLIX, a naturally occurring PPAR-alpha activator, inhibits cytokine-induced vascular cell adhesion molecule-1 expression and activity in human endothelial cells [J]. Eur J Pharmacol,2007,565(1-3) :158-165.[13]李學哲，樸惠順.人參皂苷含量測定方法及藥理作用研究現(xiàn)狀[J].延邊大學醫(yī)學學報,2009，32 O) :153-156.[14]Wang CZ, Xie JT, Fishbein A, et al. Antiproliferative effects of different plant parts of Panax notoginseng on SW480human colorectal cancer cells[J], Phytother Res,2009,23(1) :6-13.

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提出一種富含達木林A(damulin A)、達木林B (damulan B)、 gypenoside LiPgypenoside LI 的絞股藍(Gynostemma pentaphyllum)葉提取物，該提取物的制備方法，以及該提取物和這4種皂苷類化合物在制備治療腫瘤藥物中的用途。本發(fā)明的絞股藍葉提取物的制備方法如下取絞股藍葉在80_140°C、0. 08-0. 50MPa的高溫高壓條件進行熱處理1_10小時，將處理后的絞股藍葉用3-12倍量(V/w，mL/g)的50% -95%乙醇回流提取1_5次，每次l_10h。 將熱處理絞股藍葉的乙醇提取液減壓濃縮，干燥得到絞股藍葉熱處理產物醇提物。優(yōu)選的提取方法如下取絞股藍葉在125°C、0. 24MPa的高溫高壓條件進行熱處理3小時，將處理后的絞股藍葉用8倍量(v/w，mL/g)的80%乙醇回流提取3次，每次池。將熱處理絞股藍葉的乙醇提取液減壓濃縮，干燥得到絞股藍葉熱處理產物醇提物。本發(fā)明通過NMR及LC/MS技術手段，根據(jù)文獻，鑒定了所制備的絞股藍葉提取物中的 4個有效成分達木林A(damulin A)、達木林B (damulan B)、gypenoside L禾口 gypenoside Li。并HPLC-MS分析方法，對該提取物中的各有效成分進行了含量測定。其中
所述的化合物占絞股藍葉提取物的重量比為damulin A不少于Hmg/g、damulin B 不少于 5mg/g、gypenoside L 不少于 3mg/g、gypenoside LI 不少于 2mg/g。優(yōu)選，所述的化合物占絞股藍葉提取物的重量比為damulin A不少于18mg/g、 damulin B 不少于 5. 5mg/g、gypenoside L 不少于 5mg/g、gypenoside LI 不少于 2. 5mg/g。更為優(yōu)選，所述的化合物占絞股藍葉提取物的重量比為damulin A 18_30mg/g、 damulin B 5. 5_30mg/g、gypenoside L 5_20mg/g、gypenoside LI 2.5_10mg/go所述絞股藍葉提取物中有效成分的分離及鑒定如下用2倍樹脂床體積(2BV)的乙醇，以2BV/h的流速通過HP-20大孔樹脂層，并保持液面高度，浸泡過夜。用乙醇以2BV/h的流速通過樹脂層，洗至流出液加水不呈白色渾濁為止。取乙醇洗脫液適量，在200-400nm范圍內掃描紫外圖譜，在250nm左右無明顯紫外吸收。 用去離子水以2BV/h的流速通過樹脂層，洗凈乙醇。用2BV 4%的HCl溶液，以5BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡3小時，而后用去離子水以同樣流速洗至水洗液呈中性(pH試紙檢測 pH = 7)。用2. 5BV4%的NaOH溶液，以5BV/h的流速通過樹脂層并浸泡3小時，而后用去離子水以同樣流速洗至水洗液呈中性(PH試紙檢測pH = 7)。將絞股藍熱處理產物醇提物用水超聲混懸倒入大孔樹脂HP20中，以5BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡、吸附過夜。洗脫流速為2BV/h，分別用20 %，50 %，75 %，95 %，100 %乙
醇醇溶液洗脫。對上述95 %乙醇洗脫液進行硅膠柱色譜法、反相C18色譜法，分離得到4個化合物，用NMR及LC/MS技術手段，根據(jù)文獻，最終被鑒定為絞股藍皂苷gypenosdie L、 gypenoside Li、達木林A、達木林B (表1、

圖1、圖2)。表1絞股藍熱處理產物有效成分的核磁共振譜數(shù)據(jù)
權利要求
1.一種絞股藍葉提取物，其特征在于，所述的絞股藍葉提取物中含有以下化合物
2.如權利要求1所述的絞股藍葉提取物，其特征在于，所述的化合物占絞股藍葉提取物的重量比為damulin A不少于14mg/g、damulin B不少于5mg/g、gypenoside L 不少于3mg/g、gypenoside LI不少于^ig/g。優(yōu)選的，所述的化合物占絞股藍葉提取物的重量比為damulin A 不少于 18mg/g、damulin B 不少于 5. 5mg/g、gypenoside L 不少于 5mg/g、 gypenoside LI不少于2. 5mg/g。更為優(yōu)選的，所述的化合物占絞股藍葉提取物的重量比為damulin A18_30mg/g、damulin B 5. 5_30mg/g、gypenoside L 5_20mg/g、gypenoside LI 2. 5-10mg/g。
3.如權利要求1-2任一項所述的絞股藍葉提取物，其特征在于，所述的絞股藍葉提取物的制備方法包括以下步驟取絞股藍葉在80-140°C、0. 08-0. 50MPa的高溫高壓條件進行熱處理1-10小時，將處理后的絞股藍葉用3-12倍量(V/w，mL/g)的50% -95%乙醇回流提取1-5次，每次l-10h，將熱處理絞股藍葉的乙醇提取液減壓濃縮，干燥得到絞股藍葉提取物。
4.如權利要求3所述的絞股藍葉提取物，其特征在于，所述的絞股藍葉提取物的制備方法包括以下步驟取絞股藍葉在125°C、0. 24MI^的高溫高壓條件進行熱處理3小時，將處理后的絞股藍葉用8倍量(V/w，mL/g)的80%乙醇回流提取3次，每次池，將熱處理絞股藍葉的乙醇提取液減壓濃縮，干燥得到絞股藍葉提取物。
5.權利要求1-2任一項所述的絞股藍葉提取物的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟取絞股藍葉在80-140°C、0. 08-0. 50MPa的高溫高壓條件進行熱處理1_10小時， 將處理后的絞股藍葉用3-12倍量(v/w，mL/g)的50% -95%乙醇回流提取1_5次，每次 l-10h，將熱處理絞股藍葉的乙醇提取液減壓濃縮，干燥得到絞股藍葉提取物。
6.如權利要求5所述的絞股藍葉提取物的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟取絞股藍葉在125°C、0. 24MI^的高溫高壓條件進行熱處理3小時，將處理后的絞股藍葉用8倍量(V/w，mL/g)的80%乙醇回流提取3次，每次池，將熱處理絞股藍葉的乙醇提取液減壓濃縮，干燥得到絞股藍葉提取物。
7.權利要求1-4任一項所述的絞股藍葉提取物在制備治療癌癥藥物中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的癌癥選自肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌或白血病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種富含達木林A、達木林B、gypenoside L和gypenoside LI的絞股藍(Gynostemma pentaphyllum)葉提取物，該提取物的制備方法，以及該提取物和這4種皂苷類化合物在制備治療腫瘤藥物中的用途，所述的癌癥選自肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌或白血病。
文檔編號A61P35/00GK102552371SQ20121001148
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月16日 優(yōu)先權日2012年1月16日
發(fā)明者樸香蘭 申請人:中央民族大學