專利名稱：一種含有vegf拮抗劑的滴眼液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥制劑領(lǐng)域，具體涉及一種含有VEGF拮抗劑的滴眼液。
背景技術(shù)：
角膜新生血管、新生血管性青光眼、翼狀胬肉、慢性結(jié)膜炎等眼表病的發(fā)病均與新生血管的產(chǎn)生有一定的關(guān)系，VEGF的過度表達可以誘導眼表新生血管形成。其中角膜新生血管不是一種獨立的角膜病，而是一種病理改變。導致角膜新生血管的原因很多，免疫炎癥性、感染性、變性、外傷性、隱形眼鏡的不當使用，醫(yī)源性疾病等。上述原因?qū)е碌慕悄ば律苋绻患皶r治療，最終會導致角膜盲。角膜新生血管為世界范圍視力喪失和失明的主要原因，在美國約4.14%的眼科患者患有角膜新生血管，美國每年有140萬新增角膜新生血管患者，其中12%的會導致視力下降，在美國每年有約17萬新增視力下降的角膜新生血管患者。中國尚沒有關(guān)于角膜新生血管的流行病學調(diào)查，如果按照美國角膜新生血管占眼科患者4 %，其中12 %會導致視力下降來計算，2009年全國眼科患者為6283萬，國內(nèi)每年約有30萬的新增患者因角膜新生而影響視力?；颊呓悄ば律苓M展會導致視力的進一步惡化，最終需要角膜移植才能恢復視力。因此此類患者需要進行有效的抗新生血管治療，以防止視力進一步喪失，同時避免進行角膜移植，醫(yī)生對于角膜新生血管沒有有效的治療手段。生物藥物，尤其是重組類蛋白許多特性完全不同于小分子化學分子，其發(fā)生不穩(wěn)定降解反應是一個多步驟反應。限于目前分析方法的局限，發(fā)生于高級結(jié)構(gòu)的這些飽含多個步驟的降解也很難精確測量到，其穩(wěn)定性，尤其在常規(guī)條件下的保存就是一個很大的挑戰(zhàn)。眼睛是人體最重要的器官之一:大腦的近80%的信息來自眼睛；同時眼睛由于其特殊的生理構(gòu)造，是比較柔弱的組織，對粘度，滲透壓等要求都非常高。因此對于眼用制劑，尤其是有外傷時候采用的眼用制劑要求異常嚴格。VEGF(血管內(nèi)皮細胞生長因子)的生物學效應均是通過其特異性受體VEGFR(血管內(nèi)皮細胞生長因子受體)介導來實現(xiàn)的，VEGFR可導致由配體介導的二聚體化，受體的二聚體化促使相鄰受體亞基自身磷酸化和去磷酸化，從而觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導。VEGFR均為酪氨酸蛋白激酶，按其功能和結(jié)構(gòu)分為:fins_樣酪氨酸激酶-1 (VEGFR-1/Flt-l)、激酶插入?yún)^(qū)受體(VEGFR-2/Flk-l/KDR)、fins-樣酪氨酸激酶-4 (VEGFR_3/Flt_4)及一些低相對分子質(zhì)量VEGFR(neuropilin-1)。Flt-1和KDR主要分布于血管內(nèi)皮細胞上，F(xiàn)lt_4則主要分布于淋巴管內(nèi)皮細胞上。與VEGF相結(jié)合的主要為Flt-1和KDR，F(xiàn)lt-1與VEGF的結(jié)合力較KDR高，他們都是糖基化的跨膜受體，直接參與VEGF進入細胞內(nèi)的信號傳遞。Flt-1與VEGF結(jié)合后能促使血管內(nèi)皮細胞的形成和調(diào)節(jié)血管滲透性；KDR與VEGF結(jié)合后則能促進血管內(nèi)皮細胞的增生及成熟。VEGF拮抗劑，尤其是一類人工設(shè)計的靶向基因工程蛋白，如Lucentis、Avastin、VEGF-trap等 等，它們能有效地阻斷由血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)介導的信號傳遞，抑制病變新生血管的生長，并用于治療腫瘤、眼睛等由新生血管引起的疾病，但是上述藥物的已上市的制劑形式為注射劑，其給藥方式為玻璃體直接注射或全身給藥，其制劑形式對于患者而言，其依從性差，且存在諸多不便。因此，研究者開始研究一種患者依從性好，且方便有效的含有VEGF拮抗劑的藥物制劑形式，US7303748公開了一種含有VEGF-trap的滴眼液，其制劑處方:39.4-103.06mg/ml VEGF-trap, 5mM磷酸，5mM檸檬酸，IOOmM氯化鈉，0.005%吐溫-20。但是該滴眼液濃度較大，由于生物制劑一般都存在不穩(wěn)定的問題，目前眼表的抗血管治療患者很多都不愿住院治療，高濃度的生物制劑很容易造成保存和使用的不便，同時眼表給藥是一個特殊的給藥途徑，對pH、滲透壓和局部刺激性，不能添加抑菌劑和抗菌劑等，上述問題使得用于眼表抗新生血管治療藥物的成本昂貴，效果有限。因此，提供一種濃度低，抑制新生血管療效確切的滴眼液，并將其用于治療角膜新生血管、新生血管性青光眼、翼狀胬肉、慢性結(jié)膜炎等多種眼表疾病，對于滿足臨床需求具有顯著的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決技術(shù)問題之一是提供一種濃度小但是療效確切的含有VEGF拮抗劑的滴眼液。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案:本發(fā)明一方面提供了一種含有VEGF拮抗劑的滴眼液，該滴眼液中含有0.05-9.0mg/ml的VEGF拮抗劑；優(yōu)選含有0.1-1.0mg/ml的VEGF拮抗劑；更優(yōu)選含有0.5mg/ml的VEGF拮抗劑；其中所述VEGF拮抗劑優(yōu)選為含有FLT-1和KDR的片斷的融合蛋白。上述VEGF拮抗劑優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)之一的融合蛋白:a.FPl，由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和KDR的第3免疫球蛋白樣區(qū)域與人免疫球蛋白Fe片段融合而成的蛋白:FLTd2-KDRd3-Fc ；b.FP2，由KDR的第I免疫球蛋白樣區(qū)域，F(xiàn)LT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和KDR的第3免疫球蛋白樣區(qū)域與人免疫球蛋白Fe片段融合而成的蛋白: KDRdl-FLTd2-KDRd3-Fc ；c.FP3，由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和KDR的第3_4免疫球蛋白樣區(qū)域與人免疫球蛋白Fe片段融合而成的蛋白:FLTd2-KDRd3，4-Fc ；d.FP4，由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域，KDR的第3免疫球蛋白樣區(qū)域和FLT-1的第4免疫球蛋白樣區(qū)域與人免疫球蛋白Fe片段融合而成的蛋白:FLTd2-KDRd3-FLTd4-Fc ；e.FP5，由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和KDR的第3_5免疫球蛋白樣區(qū)域與人免疫球蛋白Fe片段融合而成的蛋白:FLTd2-KDRd3，4，5-Fc ;或f.FP6，由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域，KDR的第3免疫球蛋白樣區(qū)域和FLT-1的第4-5免疫球蛋白樣區(qū)域與人免疫球蛋白Fe片段融合而成的蛋白:FLTd2-KDRd3-FLTd4,5_Fc ；g.FP7，由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和KDR的第3_4免疫球蛋白樣區(qū)域融合而成的蛋白:FLTd2-KDRd3，4 ；h.FP8，由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和KDR的第3免疫球蛋白樣區(qū)域融合而成的蛋白:FLTd2-KDRd3。以上FLT-1和KDR免 疫球蛋白樣區(qū)域的氨基酸FLT-1D2、FLT-1D4、KDRDl、KDRD3、KDRD4見序列表1-5，F(xiàn)P3蛋白的氨基酸序列見序列表6、FP1蛋白的氨基酸序列見序列表7，F(xiàn)P7蛋白的氨基酸序列見序列表8，F(xiàn)P8蛋白的氨基酸序列見序列表9。本發(fā)明提供的滴眼液中，還可以含有以下組分的一種或多種:(a)5_100mM緩沖液，其中的酸選自Tris_HCl，檸檬酸，磷酸、磷酸氫鈉，磷酸二氫鈉，醋酸，丁二酸，鹽酸中的一種或多種；(b) 5-500mM堿性氨基酸選自賴氨酸，精氨酸，和組氨酸中的一種或其組合；(c) 0.1-30 %鹽滲透壓劑調(diào)節(jié)劑，其中的糖選自蔗糖，海藻糖，甘露醇，甘油，丙二醇，山梨酯醇中的一種或多種，鹽選自氯化鈉或其它藥學上可以接受的鹽中的一種或其組合；(d)0.005-0.1 %的一種或多種表面活性劑或助溶劑，選自聚乙二醇，吐溫20，吐溫80，丙二醇，二甲基亞砜或其它藥學上可以接受的表面活性劑中的一種或多種；上述組分之一或多種配成的溶液pH為6 8.3。上述滴眼液中所述的VEGF拮抗劑最優(yōu)選為如SEQ ID No:6的融合蛋白。本發(fā)明還進一步提供了含有如下組分的滴眼液，具體組分如下:(a)0.05-9mg/ml 的如 SEQ ID No:6 的融合蛋白；(b) 5-250mM 的檸檬酸；(c) 5-500mM的精氨酸或組氨酸的一種或兩種；(d) 4-30 %的蔗糖或海藻糖；(e)0.01-0.1 %的表面活性劑或助溶劑，選自聚乙二醇或吐溫20的一種或兩種；(f)調(diào)節(jié) pH 為 7.5 8.3。本發(fā)明再進一步提供了含有如下組分的滴眼液，具體組分如下:(a)0.1-lmg/ml 的如 SEQ ID No:6 的融合蛋白；(b) IO-5OmM 的檸檬酸；(c) 50-100mM的精氨酸或組氨酸的一種或兩種；(d) 5-20% 的蔗糖；(e)0.01-0.1 %的表面活性劑或助溶劑，選自聚乙二醇或吐溫20的一種或兩種；(f)調(diào)節(jié) pH 為 7.5 8.3。本發(fā)明更進一步提供了含有如下組分的滴眼液，具體組分如下:(a) 0.5mg/ml 的如 SEQ ID No:6 的融合蛋白；(b) 50mM 的檸檬酸；(c) 250mM 的精氨酸；(d) 12.5% 的蔗糖；(e)0.05% 的吐溫-20 ;(f)調(diào)節(jié) pH 為 7.5 8.3。本發(fā)明還提供了上述滴眼液在制備治療由血管新生或生長引起的眼表疾病的藥物中的用途；優(yōu)選為眼表疾病為角膜移植術(shù)后新生血管、角膜新生血管、眼表新生血管或翼狀胬肉的任一種或其并發(fā)癥。中國專利ZL200510073595.4和ZL200610066257.2公開的技術(shù)內(nèi)容作為本申請的參考；中國未公開專利 CN 201010267503.7的技術(shù)內(nèi)容也作為本申請的參考。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比其優(yōu)勢在于:滴眼液中融合蛋白的含量極低、且療效確切，在低濃度滴眼液較高的穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上能夠大幅度節(jié)約生產(chǎn)成本。
具體實施例方式以下實施例僅作為對本發(fā)明的進一步解釋，不能作為是對本發(fā)明保護范圍的限制。實施例1、康柏西普滴眼液對堿燒傷致角膜新生血管研究藥品:鹽酸金霉素眼膏，規(guī)格批號:2.0g/支，411002，有效期至2014.12，重慶科瑞制藥有限責任公司；鹽酸利多卡因注射液，規(guī)格批號:5ml/支，0.1g/支，有效期至2012.04.，天津藥物焦作有限公司。試劑:氫氧化鈉(NaOH)，規(guī)格批號:500g/瓶，20091223，成都市科龍化工試劑廠。受試樣品:A,康柏西普滴眼液(按照實施例3制備)10mg/ml,無色透明液體，Iml/支,批號:FRl 108001，保存于2 8°C，使用時滴加入眼睛表面；B,康柏西普滴眼液(按照實施例3制備)9mg/ml,無色透明液體，Iml/支,批號:FRl 108002，保存于2 8°C，使用時滴加入眼睛表面；C，地塞米松，無色透明液體，Iml/支，批號:FR1108003，保存于2 8°C，使用時滴加入眼睛表面；D,康柏西普滴眼液(按照實施例3制備)0.lmg/ml,無色透明液體,Iml/支,批號:FRl 108004，保存于2 8°C，使用時滴加入眼睛表面；E，不含康柏西普制劑緩沖液(buffer)(按照實施例16制備)，無色透明液體，Iml/支，批號:FR1108005，保存于2 8°C，使用時滴加入眼睛表面；F,康柏西普滴眼液(按照實施例3制備)5mg/ml,無色透明液體,Iml/支,批號:FRl 108006，保存于2 8°C，使用時滴加入眼睛表面；均由康弘藥業(yè)集團企業(yè)技術(shù)中心中化藥研究部制劑室提供。實驗方法及結(jié)果:取健康無眼疾病新西蘭兔48只，稱其體重，用3%戊巴比妥鈉麻醉(lml/kg)，并于眼睛表面施予局麻藥鹽酸利多卡因液，劑量為20 Ul/眼；制備9mm直徑濾紙片，浸泡于ImoI/LNaOH溶液中約10s，用鑷子將濾紙片放置于干燥的濾紙上吸去多余的NaOH溶液，將浸有NaOH的濾紙片置于家兔雙眼眼角膜正中60s后取下，迅速取洗瓶用約20ml生理鹽水沖洗角膜，并給予預防抗生素防止感染(鹽酸金霉素眼膏)，3次/2天。造模后隨即分為燒傷、A (康柏西普滴眼液(按照實施例3制備)10mg/ml)、B (康柏西普滴眼液(按照實施例3制備)9mg/ml)、C (地塞米松)、D (康柏西普滴眼液(按照實施例3制備)0.lmg/ml)、E(不含康柏西普的制劑緩沖溶液(按照實施例16制備))和F(康柏西普滴眼液(按照實施例3制備)5mg/ml)七個組，造模當天為O天，從第I天開始，A F組給予相應藥物，給藥頻率6次/天，給藥劑量每次50 u I/眼，連續(xù)給藥10天，另取2只新西蘭兔設(shè)為正常組。每天給藥同時，觀察眼角膜NV生長狀態(tài)及眼部是否有炎癥反應。于給藥第10天，以3%戊巴比妥鈉溶液麻醉動物(lml/kg)，并于眼睛表面施予局麻藥鹽酸利多卡因液， 劑量為20iU/眼，在裂隙燈10倍物鏡下觀察兔眼角膜NV鐘點方向，同時在10倍和16倍物鏡下照相。采集圖像在Photoshop CS進行鐘點數(shù)校正，角膜新生面積采用Image Pro Plus處理；面積公式:S = C/12X3.1416X [R2-(R-L)2]，C表示在圖片中角膜邊緣從有NV到無NV生長時點所占的鐘點數(shù)，R表示在圖片中從角膜與鞏膜接觸的邊緣到角膜中心的長度，L表示在圖片中從角膜與鞏膜接觸邊緣NV的根部到角膜中NV的末端NV長度，每個鐘點中取最長的一根血管長度。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用T檢驗方差分析。數(shù)據(jù)以J ±s表不,是平均值，s是標準偏差。通過一般眼表觀察發(fā)現(xiàn)，燒傷第1，2天各組燒傷眼角膜邊緣血管網(wǎng)充血明顯；燒傷第3天，角膜邊緣有NV生長；第5天康柏西普滴眼液5mg/ml和不含康柏西普的制劑緩沖溶液眼角膜表面NV生長明顯,地塞米松、康柏西普滴眼液10mg/ml、康柏西普滴眼液9mg/ml和康柏西普滴眼液0.lmg/ml組NV生長不明顯；第7天各組眼角膜表面NV生長明顯，燒傷組和不含康柏西普的制劑緩沖溶液組角膜NV向燒傷角膜生長，部分NV已生長到燒傷角膜邊緣，而地塞米松、康柏西普滴眼液10mg/ml、康柏西普滴眼液9mg/ml、康柏西普滴眼液5mg/ml和康柏西普滴眼液0.lmg/ml組很少有NV生長到燒傷角膜邊緣；第10天時燒傷組和不含康柏西普的制劑緩沖溶液組已有NV長入燒傷角膜內(nèi)，而地塞米松、康柏西普10mg/ml、康柏西普滴眼液9mg/ml、康柏西普5mg/ml和康柏西普0.lmg/ml組NV長入燒傷角膜較少。角膜新生血管面積影響 第10天角膜NV面積數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知，與堿燒傷組和不含康柏西普的制劑緩沖溶液組相比，地塞米松、康柏西普10mg/ml、康柏西普滴眼液9mg/ml、康柏西普5mg/ml和康柏西普0.lmg/ml能夠明顯抑制角膜NV生長,減少NV面積,具有統(tǒng)計學意義(P < 0.05)，其中地塞米松與康柏西普0.lmg/ml抑制NV生長最佳(P < 0.01)。雖然不含康柏西普的制劑緩沖溶液無抑制角膜新生血管生長作用，且NV面積大于燒傷組，但無顯著性差異。結(jié)果如表I。表I各藥物對堿燒傷致兔眼角膜NV的影響(I ± J)
權(quán)利要求
1.一種含有VEGF拮抗劑的滴眼液，其特征在于該滴眼液中含有0.05-9.0mg/ml的VEGF拮抗劑；優(yōu)選含有0.1-1.0mg/ml的VEGF拮抗劑；更優(yōu)選含有0.5mg/ml的VEGF拮抗劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滴眼液，其特征在于所述的VEGF拮抗劑為含有FLT-1和KDR的片斷的融合蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滴眼液，其特征在于所述的VEGF拮抗劑具有如下結(jié)構(gòu)之一: a.FPl，由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和KDR的第3免疫球蛋白樣區(qū)域與人免疫球蛋白Fe片段融合而成的蛋白:FLTd2-KDRd3-Fc ； b.FP2，由KDR的第I免疫球蛋白樣區(qū)域，F(xiàn)LT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和KDR的第3免疫球蛋白樣區(qū)域與人免疫球蛋白 Fe片段融合而成的蛋白: KDRdl-FLTd2-KDRd3-Fc ； c.FP3，由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和KDR的第3_4免疫球蛋白樣區(qū)域與人免疫球蛋白Fe片段融合而成的蛋白:FLTd2-KDRd3，4-Fc ； d.FP4，由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域，KDR的第3免疫球蛋白樣區(qū)域和FLT-1的第4免疫球蛋白樣區(qū)域與人免疫球蛋白Fe片段融合而成的蛋白:FLTd2-KDRd3-FLTd4-Fc ； e.FP5，由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和KDR的第3_5免疫球蛋白樣區(qū)域與人免疫球蛋白Fe片段融合而成的蛋白:FLTd2-KDRd3，4，5-Fc ;或 f.FP6，由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域，KDR的第3免疫球蛋白樣區(qū)域和FLT-1的第4-5免疫球蛋白樣區(qū)域與人免疫球蛋白Fe片段融合而成的蛋白:FLTd2-KDRd3-FLTd4，5-Fc ； g.FP7，由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和KDR的第3_4免疫球蛋白樣區(qū)域融合而成的蛋白:FLTd2-KDRd3，4 ； h.FP8，由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和KDR的第3免疫球蛋白樣區(qū)域融合而成的蛋白:FLTd2-KDRd3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的滴眼液，其特征在于所述滴眼液中還可以含有以下組分的一種或多種: (a)5-100mM緩沖液，其中的酸選自Tris-HCl，檸檬酸，磷酸、磷酸氫鈉，磷酸二氫鈉，醋酸，丁二酸，鹽酸中的一種或多種； (b)5-500mM堿性氨基酸選自賴氨酸，精氨酸，和組氨酸中的一種或其組合； (c)0.1-30 %鹽滲透壓劑調(diào)節(jié)劑，其中的糖選自蔗糖，海藻糖，甘露醇，甘油，丙二醇，山梨酯醇中的一種或多種，鹽選自氯化鈉或其它藥學上可以接受的鹽中的一種或其組合； (d)0.005-0.1 %的一種或多種表面活性劑或助溶劑，選自聚乙二醇，吐溫20，吐溫80，丙二醇，二甲基亞砜或其它藥學上可以接受的表面活性劑中的一種或多種； 上述組分之一或多種配成的溶液pH為6.0 8.3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的滴眼液，其特征在于所述的VEGF拮抗劑為如SEQIDNo:6的融合蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的滴眼液，其特征在于含有如下組分: (a)0.05-9mg/ml 的如 SEQ ID No:6 的融合蛋白；(b)5-250mM的朽1檬酸； (c)5-500mM的精氨酸或組氨酸的一種或兩種； (d)4-30%的蔗糖或海藻糖； (e)0.01-0.1 %的表面活性劑或助溶劑，選自聚乙二醇或吐溫20的一種或兩種； (f)調(diào)節(jié)pH為7.5 8.3。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的滴眼液，其特征在于含有(a)0.1-lmg/ml 的如 SEQ ID No:6 的融合蛋白； (b)10-50mM的朽1檬酸； (c)50-100mM的精氨酸或組氨酸的一種或兩種； (d)5-20%的蔗糖； (e)0.01-0.1 %的表面活性劑或助溶劑，選自聚乙二醇或吐溫20的一種或兩種； (f)調(diào)節(jié)pH為7.5 8.3。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的滴眼液，其特征在于含有 (a)0.5mg/ml的如SEQ ID No:6的融合蛋白； (b)50mM的檸檬酸； (c)250mM的精氨酸； (d)12.5%的蔗糖；(e)0.05% 的吐溫-20 ； (f)調(diào)節(jié)pH為7.5 8.3。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的滴眼液，其特征在于在制備治療由血管新生或生長引起的眼表疾病的藥物中的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的滴眼液，其特征在于所述眼表疾病為角膜移植術(shù)后新生血管、角膜新生血管、眼表新生血管或翼狀胬肉的任一種或其并發(fā)癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有VEGF拮抗劑的滴眼液，該滴眼液中含有低濃度的VEGF拮抗劑，尤其是含有0.05-9.0mg/ml的VEGF拮抗劑，本發(fā)明滴眼液在確保安全穩(wěn)定的基礎(chǔ)上其療效顯著。
文檔編號A61P27/02GK103212075SQ20121001789
公開日2013年7月24日 申請日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者柯瀟, 鄭強 申請人:成都康弘生物科技有限公司