專利名稱：抑制流感病毒復(fù)制的宿主相關(guān)基因及其篩選方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及抑制流感病毒復(fù)制的宿主相關(guān)基因及其篩選方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
病毒感染宿主后需要利用宿主細(xì)胞的代謝過程完成病毒自身的復(fù)制，在這一過程病毒必然會調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)基因組的表達(dá)，抑制抗病毒基因表達(dá)，增強對病毒復(fù)制有益的基因表達(dá)。因此，病毒感染宿主細(xì)胞后，宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)變化的這些基因往往和病毒復(fù)制有密切的關(guān)系。通過生物學(xué)手段篩選宿主細(xì)胞內(nèi)這些基因，具有機體針對病毒免疫和病毒復(fù)制機制的研究價值，同時具有潛在預(yù)防和治療流感病毒感染的應(yīng)用價值。病毒入侵宿主過程伴隨著宿主基因表達(dá)變化，最終決定感染細(xì)胞和病毒各自的命運。DNA微陣列技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)的數(shù)據(jù)分析方法，為研究細(xì)胞基因表達(dá)譜變化提供了前所未有的高通量的研究工具。微陣列已廣泛的應(yīng)用于人、小鼠和大鼠基因表達(dá)領(lǐng)域的研究，高密度微陣列已越來越多的用來分析病毒感染宿主誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞基因表達(dá)差異，例如，艾滋 病病毒(Human immunodeficiency virus, HIV) (Solis etal.(2006) Virology.352(1):86-99)登革熱病毒(Dengue virus, DV) (Fink et al.(2007)PLoS Negl Trop Dis.1(2):e86)麻疫病毒(Measles virus, MV) (Sato et al.(2008)Virology.375(2):321-330)、狂犬病病毒(Rabies virus, RV)(UboI et al.(2005)Microbiol Immunol.49 (5):423-431)和猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiencyvirus, SIV) (George et al.(2003)Virology.312(1):84-94)。由于動物基因組信息數(shù)據(jù)庫的不完善，應(yīng)用特異性的動物基因組微陣列研究一直滯后于人或小鼠相關(guān)領(lǐng)域的進(jìn)展。早期曾用人基因組的微陣列(AffymetrixHuman GeneChip )研究牛、豬和犬等的基因表達(dá)情況(Ji et al.(2004) Int JCancer.112(5):803-814 ;Shah et al.(2004)Clin Transplant.Suppl 12:76-80)，直到Qiagen公司研制的(Qiagen_NRSP8 array)第一代大規(guī)模的豬基因表達(dá)譜分析芯片出現(xiàn)，微陣列上固定了 13297cDNAs和ESTs數(shù)據(jù)庫中挑選的豬基因組探針(Zhao et al.(2005)Genomics.86(5):618-625)?，F(xiàn)在使用的Affymetrix豬全基因組芯片廣泛用來研究豬全基因組轉(zhuǎn)錄譜，獲得了眾多研究成果(Tsai et al.(2004) J Virol.78(20):11360-11370 ；Shiet al.2009)J Genvirol.90(Pt 7):1670-1680)。流感病毒為正粘病毒科流感病毒屬分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA病毒。病毒粒子剛分尚時呈多晶形，在體內(nèi)傳代后變成球形，直徑80-120nm(PaleSe，et al.，2007)。病毒粒子由質(zhì)量比分別是0.8-1 %的RNA、70-75 %的蛋白質(zhì)、20 %的脂類和5_8 %的糖類組成。流感病毒分為A、B、C三型，其中A型(甲型)最為重要。甲型流感病毒能引起人類、豬、馬和各種禽類的自然感染和發(fā)病。由于其表面抗原HA和NA容易變異，已知HA有16個亞型(H1-H16)，NA有9個亞型(N1-N9)，它們之間的不同組合，使甲型流感病毒有許多亞型(如H1N1、H2N2、H3N2、H5N1等)，在豬體中主要流行HlNl和H3N2亞型。一般來說，流感病毒具有宿主種的適應(yīng)性。在同種動物的個體之間容易發(fā)生傳播。不同動物有不同的流感病毒，如豬流感、人流感、馬流感，一般情況下這些流感只感染各自的本屬動物。但是流感病毒有個特性是不同動物的流感間可以互相組合，形成感染多種動物的新流感病毒。另一個特點是豬這種動物比較特殊，豬對其它動物的流感病毒也易感，這是其它動物不具有的特性。所以一旦豬同時感染了人流感、豬流感、禽流感等，這多種病毒會在豬體內(nèi)發(fā)生重組，可能就會出來一種既能感染豬、人、禽的流感病毒。所以狹義的豬流感不是人獸共患病。流感在人與人之間傳播范圍很有限，跟流感的傳播途徑有關(guān)。比如2009年甲型流感，就是人流感、豬流感、禽流感共同感染豬后產(chǎn)生的新流感病毒，最開始感染的人基本都是接觸過或跟豬關(guān)系密切的人感染了。人類發(fā)展史上流感病毒的大爆發(fā)都給社會經(jīng)濟發(fā)展、人類健康帶來重大危害。為預(yù)防和治療流感，各國都投入了大量人力物力，不斷研究治療方法和藥物。近年來，從宿主細(xì)胞內(nèi)尋找具有抗病毒功能的基因或蛋白是一個熱門領(lǐng)域。以細(xì)胞內(nèi)功能分子作為抗病毒治療的靶點具有廣譜抗病毒、不易產(chǎn)生耐藥毒株的優(yōu)勢，逐漸成為研究開發(fā)抗病毒治療藥物的熱點途徑。近年來國際高水平論文多次報道在宿主細(xì)胞內(nèi)信號通路中篩選具有潛在抗病毒功能的分子取得突破性成就。例如，鋅指抗病毒蛋白(Zinc-finger antiviral protein, ZAP)能通過降解特異病毒RNA進(jìn)而抑制鼠白血病病毒等多種病毒的復(fù)制，被證明是一種重要的抗病毒因子(Chen etal.(2008) Proc.Natl.Acad.Sc1.U S A.105，4352-4357)。利用鋅指蛋白為載體攜帶特異的酶阻斷T細(xì)胞中的CCR5表達(dá)，可促進(jìn)T細(xì)胞清除HIV病毒(Holt et al.(2010)Nat.Biotechnol.28，839-847)。E3泛素連接酶RNF5定位于線粒體，通過泛素化修飾MITA (也稱為STING)并引起其降解而負(fù) 調(diào)控病毒感染后I型干擾素表達(dá)(Zhong et al.(2009)Immunity.30,397-407)。Tetherin(宿主細(xì)胞蛋白)以二聚體錨定HIV在其復(fù)制的細(xì)胞膜上，阻斷病毒從胞漿膜出芽釋放(Perez-Caballero et al.(2009)Cell.139，499-511)。AP0BEC3G(Apolipoprotein BmRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G)可誘導(dǎo) HIV 基因變(Perez-Caballeroet al.(2009) Cell.139，499-511)，使病毒不能復(fù)制(Shirakawa et al.(2008) Nat.Struct.Mol.Biol.15，1184-1191)。目前細(xì)胞周期素依賴激酶、前列腺素、熱休克蛋白作為藥靶分子廣泛用于如，HCMV、HIV、HSV、腺病毒和乳頭狀瘤等病毒病治療。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是，針對現(xiàn)有流感病毒感染后篩選宿主體內(nèi)表達(dá)量發(fā)生改變基因的方法和手段的缺陷和不足，提供一種高通量，高效率的篩選抑制流感病毒復(fù)制相關(guān)基因的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:本發(fā)明的技術(shù)方案之一是:一種篩選抑制流感病毒復(fù)制相關(guān)基因的方法，包括從感染流感病毒的組織或者細(xì)胞中提取總mRNA，用基因組表達(dá)譜芯片篩選出表達(dá)量和未感染流感病毒細(xì)胞相比較上升或者下降的基因。其中，所述的組織或細(xì)胞是離體培養(yǎng)的組織或細(xì)胞,或者是從感染流感病毒的動物上取下來的組織或細(xì)胞，優(yōu)選后者。所述的組織或細(xì)胞可以是感染流感病毒的動物的任何組織或細(xì)胞，組織如肺臟、心肌等，細(xì)胞如血細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等，優(yōu)選肺臟巨噬細(xì)胞。所述的動物可以是各種能夠感染流感病毒的動物，優(yōu)選哺乳動物或者禽類，更優(yōu)選如人、豬、雞等，最優(yōu)選豬。其中，所述的流感病毒選自己知的各型流感病毒，包括A、B、C型流感病毒，也包括各種亞型流感病毒，優(yōu)選HlNl和H3N2亞型，該兩亞型流感病毒是在豬中主要流行的流感病
毒亞型。其中，所述的表達(dá)量的比較是比較基因的mRNA濃度，優(yōu)選表達(dá)量升高或者下降2倍以上的基因為抑制病毒復(fù)制相關(guān)基因。本發(fā)明中所述的“以上”包括本數(shù)。本發(fā)明更優(yōu)選表達(dá)量升高或降低2-5倍以上的基因為抑制病毒復(fù)制相關(guān)基因。研究發(fā)現(xiàn)，并不是倍數(shù)變化越高，抑制病毒功能越強。有些非常重要的基因并不需要變化太多倍數(shù)就能有顯著抑制作用，抑制病毒作用與這個基因在細(xì)胞中發(fā)揮的功能有關(guān)。其中，所述的基因組表達(dá)譜芯片是常規(guī)的基因組表達(dá)譜芯片，優(yōu)選豬基因組表達(dá)譜芯片，更優(yōu)選豬全基因組表達(dá)譜芯片。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是:選自表I和表2中所述的基因在篩選或制備抗流感藥物中的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案之 三是:一種篩選抗流感藥物的方法，包括:(I)使候選藥物與感染流感病毒的細(xì)胞接觸，所述的細(xì)胞是表達(dá)選自表I和表2中所述的基因的細(xì)胞:(2)測試流感病毒滴度；(3)選擇使流感病毒滴度下降的候選藥物。其中，所述的篩選抗流感藥物的方法中，對于表達(dá)選自表I第I組的56個基因的細(xì)胞，優(yōu)選所述基因表達(dá)被抑制的細(xì)胞。其中，所述的基因表達(dá)被抑制的細(xì)胞優(yōu)選通過使該細(xì)胞含有所述SiRNA或者是含有編碼有所述SiRNA的重組載體使該基因沉默。其中，所述的篩選抗流感藥物的方法中，對于表達(dá)選自表I第2組的99個基因的細(xì)胞，優(yōu)選過表達(dá)所述基因的細(xì)胞。其中，所述的過表達(dá)基因的細(xì)胞優(yōu)選通過增加細(xì)胞內(nèi)該基因的拷貝數(shù)或者改良該基因的調(diào)控元件，如使用強啟動子，或者使用增強子的方法，使該基因過表達(dá)。本發(fā)明的技術(shù)方案之四是:一種抑制流感病毒復(fù)制的方法，包括利用分子生物學(xué)方法使宿主細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)基因過表達(dá)，所述的相關(guān)基因選自表I第I組的56個基因中的一種或多種；或者使宿主細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)基因沉默或敲除，所述的相關(guān)基因選自表2第2組的99個基因中的一種或多種。其中，所述的基因優(yōu)選第I組中的轉(zhuǎn)錄因子A基因和對氧磷酸酶3基因。其中，所述的基因優(yōu)選第2組中的小窩蛋白2基因和表面活性蛋白D基因。其中，所述的基因過表達(dá)方法是常規(guī)方法，優(yōu)選通過增加細(xì)胞內(nèi)該基因的拷貝數(shù)或者改良該基因的調(diào)控元件，如使用強啟動子，或者使用增強子的方法，使基因過表達(dá)。其中，所述的基因沉默或敲除的方法也是常規(guī)方法，優(yōu)選通過使宿主細(xì)胞含有所述基因的小干擾RNA (SiRNA)或者是含有編碼有所述小干擾RNA的重組載體使該基因沉默，或者利用基因打靶技術(shù)將目標(biāo)基因敲除。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。
相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下:本發(fā)明中的篩選方法可以大規(guī)模，高通量篩選流感病毒感染后宿主體內(nèi)表達(dá)量發(fā)生改變的基因，并分別得到表達(dá)量上調(diào)和下調(diào)2倍的兩組基因。通過該方法，一方面我們可以更加深刻了解宿主對流感病毒的免疫機制 ’另一方面，我們可以利用這種方法開發(fā)更好的抗流感藥物。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1是Western-blot檢測沉默犬腎細(xì)胞中小窩蛋白2表達(dá)的結(jié)果，其中1:siRNA-小窩蛋白2 ；2 =SiRNA-小窩蛋白2對照；3:未接毒對照；4:正常細(xì)胞。圖2是Western-blot檢測沉默犬腎細(xì)胞中表面活性蛋白D表達(dá)的結(jié)果，其中1:siRNA-表面活性蛋白D ；2 =SiRNA-表面活性蛋白D對照；3:未接毒對照；4:正常細(xì)胞。圖3是沉默犬腎細(xì)胞中小窩蛋白2表達(dá)后流感病毒滴度圖。圖4是沉默犬腎細(xì)胞中表面活性蛋白D表達(dá)后流感病毒滴度圖。圖5是構(gòu)建的p⑶NA 3.1-轉(zhuǎn)錄因子A載體圖譜。圖6是構(gòu)建的p⑶NA 3.1-對氧磷酸酶3載體圖譜。圖7是細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子A和對氧 磷酸酶3免疫印跡檢測結(jié)果，其中1:pCDNA 3.1-轉(zhuǎn)錄因子A ；2:pCDNA 3.1空載體對照；3:正常細(xì)胞4:pCDNA 3.1-對氧磷酸酶3 ；5:pCDNA 3.1空載體對照；6:正常細(xì)胞。圖8是外源提高表達(dá)犬腎細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子A后流感病毒滴度結(jié)果。圖9是外源提高表達(dá)犬腎細(xì)胞中對氧磷酸酶3后流感病毒滴度結(jié)果。圖10是小窩蛋白2沉默的犬腎細(xì)胞中加入金剛烷胺后流感病毒滴度圖。圖11是表面活性蛋白D沉默的犬腎細(xì)胞中加入金剛烷胺后流感病毒滴度圖。圖12是外源提高轉(zhuǎn)錄因子A表達(dá)的犬腎細(xì)胞中加入金剛烷胺后流感病毒滴度圖。圖13是外源提高對氧磷酸酶3表達(dá)的犬腎細(xì)胞中加入金剛烷胺后流感病毒滴度圖。
具體實施例方式本發(fā)明人利用基因組表達(dá)譜芯片，將病毒感染前后的細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，篩選表達(dá)量改變的基因，并對這些基因進(jìn)行了進(jìn)一步的抗流感病毒功能驗證，發(fā)現(xiàn)這些流感病毒復(fù)制相關(guān)基因，進(jìn)而提供了這些基因用于抗流感病毒藥物的篩選和制備的方法，從而完成了本發(fā)明。篩選抑制流感病毒復(fù)制相關(guān)基因的方法本發(fā)明提供一種篩選抑制流感病毒復(fù)制相關(guān)基因的方法，包括從感染流感病毒的組織或者細(xì)胞中提取總mRNA，用豬基因組表達(dá)譜芯片篩選出表達(dá)量和未感染流感病毒細(xì)胞相比較上升或者下降的基因。本發(fā)明通過將感染流感病毒細(xì)胞和未感染流感病毒細(xì)胞進(jìn)行比較，比較這些細(xì)胞中的各基因的表達(dá)量變化來篩選相關(guān)基因。流感病毒感染細(xì)胞后，直接或間接地影響細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)及蛋白質(zhì)的生成。通過對宿主被流感病毒感染前后兩組樣品進(jìn)行表達(dá)譜生物芯片檢測，可以反映出流感病毒作用后相應(yīng)組織或細(xì)胞中基因表達(dá)譜及蛋白質(zhì)等的變化，從而篩選出抑制病毒復(fù)制相關(guān)基因。其中，所述的組織或細(xì)胞可以是離體培養(yǎng)的組織或細(xì)胞，也可以是從感染流感病毒的動物身上取出來的組織或細(xì)胞，優(yōu)選后者。所述的組織或細(xì)胞可以是感染流感病毒的動物的任何組織或細(xì)胞，組織如肺臟、心肌等，細(xì)胞如血細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等，優(yōu)選肺臟巨噬細(xì)胞。流感病毒主要引起呼吸系統(tǒng)感染，肺臟是流感病毒聚集的器官，肺泡巨噬細(xì)胞是流感很易感的細(xì)胞，比較有代表性。其它組織類型也可選擇，氣管、支氣管這些氣管上皮細(xì)胞也是流感病毒非常易感細(xì)胞。所述的動物可以是各種能夠感染流感病毒的動物，優(yōu)選哺乳動物或者禽類，更優(yōu)選如人、豬、雞等，最優(yōu)選豬。其中，所述的流感病毒選自己知的各型流感病毒，包括A、B、C型流感病毒，也包括各種亞型流感病毒，優(yōu)選HlNl和H3N2亞型，該兩亞型流感病毒是在豬中主要流行的流感病
毒亞型。其中，所述的表達(dá)量的比較是比較基因的mRNA濃度，優(yōu)選表達(dá)量升高或者下降2倍以上的基因為抑制病毒復(fù)制相關(guān)基因。本發(fā)明中所述的“以上”包括本數(shù)。本發(fā)明更優(yōu)選表達(dá)量升高或降低2-5倍以上的基因為抑制病毒復(fù)制相關(guān)基因。其中，提取總mRNA的方法是常規(guī)技術(shù)，一般可以采用商品試劑盒，用Trizol法提取。其中采用的基因組表達(dá)譜芯片是常規(guī)的基因組表達(dá)譜芯片，是指采用光導(dǎo)原位合成或微量點樣等方法，將基因組所有的轉(zhuǎn)錄子序列以陣列式有序地固化于支持物(玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜 等載體)的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號的強度進(jìn)行檢測分析來判斷樣品中靶分子的種類和數(shù)量，從而實現(xiàn)對mRNA的檢測。較佳的如Affymetrix公司生產(chǎn)的豬全基因組表達(dá)譜芯片。本發(fā)明利用基因組表達(dá)譜對感染流感病毒前后的細(xì)胞的表達(dá)譜進(jìn)行分析。該方法將樣品制備、生化反應(yīng)和結(jié)果檢測3個部分有機的結(jié)合起來，具有快速、高通量、高信息量、平行化、集約化、微型化、自動化、成本低、污染少等優(yōu)點。本發(fā)明從感染流感病毒的豬中提取總mRNA，用基因組芯片篩選出表達(dá)量和未感染流感病毒細(xì)胞相比較上升或者下降2倍的基因。這些基因如表I和表2中所示。其中，第I組(表I)中共56個基因是豬感染流感病毒后表達(dá)倍數(shù)升高2倍以上的基因，第2組(表2)中共99個基因是豬感染流感病毒后表達(dá)倍數(shù)下降2倍以上的基因。本發(fā)明利用分子生物學(xué)方法調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)這些基因或包括這些基因的一組基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)可以抑制宿主細(xì)胞內(nèi)流感病毒復(fù)制，因此這些基因是抑制流感病毒復(fù)制相關(guān)基因。所述的分子生物學(xué)方法是常規(guī)方法，包括使宿主細(xì)胞過表達(dá)基因，可以通過增加細(xì)胞內(nèi)該基因的拷貝數(shù)或者改良該基因的調(diào)控元件，如使用強啟動子，或者使用增強子的方法，使該基因過表達(dá)。還包括使宿主細(xì)胞中該基因的表達(dá)被抑制，可以通過使宿主細(xì)胞含有所述基因的小干擾RNA(SiRNA)或者是含有編碼有所述小干擾RNA的重組載體使該基因沉默。表I (第I組)基因信息
權(quán)利要求
1.一種篩選抑制流感病毒復(fù)制相關(guān)基因的方法，其特征在于，包括從感染流感病毒的組織或者細(xì)胞中提取總mRNA，用基因組表達(dá)譜芯片篩選出表達(dá)量和未感染流感病毒細(xì)胞相比較上升或者下降的基因。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞是從感染流感病毒的動物上取下來的肺臟巨噬細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的動物是哺乳動物或者禽類。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的動物是豬。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表達(dá)量的比較是比較基因的mRNA濃度，選擇表達(dá)量升高或者下降2倍以上的基因。
6.選自表I和表2中所述的基因在篩選或制備抗流感藥物中的用途。
7.一種篩選抗流感藥物的方法，其特征在于，包括: (1)使候選藥物與感染流感病毒的細(xì)胞接觸，所述的細(xì)胞是表達(dá)選自表I和表2中所述的基因的細(xì)胞； (2)測試流感病毒滴度； (3)選擇使流感病毒滴度下降的候選藥物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的篩選抗流感藥物的方法中，對于表達(dá)選自表I第I組的56個基因的細(xì)胞，該細(xì)胞是所述基因表達(dá)被抑制的細(xì)胞；對于表達(dá)選自表2第2組的99個基因的細(xì)胞，該細(xì)胞是過表達(dá)所述基因的細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的基因表達(dá)被抑制的細(xì)胞是通過使該細(xì)胞含有siRNA或者是含有編碼siRNA的重組載體使該基因沉默；所述的過表達(dá)基因的細(xì)胞是通過增加細(xì)胞內(nèi)該基因的拷貝數(shù)或者改良該基因的調(diào)控元件使該基因過表達(dá)。
10.一種抑制流感病毒復(fù)制的方法，其特征在于，包括利用分子生物學(xué)方法使宿主細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)基因過表達(dá)，所述的相關(guān)基因選自表I第I組的56個基因中的一種或多種；或者使宿主細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)基因沉默，所述的相關(guān)基因選自表2第2組的99個基因中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明公開了抑制流感病毒復(fù)制的宿主相關(guān)基因及其篩選方法和應(yīng)用。本篩選抑制流感病毒復(fù)制相關(guān)基因的方法，包括從感染流感病毒的組織或者細(xì)胞中提取總mRNA，用基因組表達(dá)譜芯片篩選出表達(dá)量和未感染流感病毒細(xì)胞相比較上升或者下降的基因。本發(fā)明還提供了將所得基因應(yīng)用于篩選或制備抗流感藥物以及抑制流感病毒復(fù)制的方法。
文檔編號A61P31/16GK103215345SQ20121001973
公開日2013年7月24日 申請日期2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月20日
發(fā)明者馬志永, 史子學(xué), 魏建超, 邵東華, 王少輝, 李蓓蓓, 晏文君, 朱紫祥 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所