專利名稱：真菌環(huán)氧二烯煙酸類衍生物在制備促炎介質(zhì)抑制劑的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及真菌環(huán)氧二烯煙酸類衍生物4-NDM(縮寫為4NDM)，尤其是涉及真菌環(huán)氧二烯煙酸類衍生物在制備促炎介質(zhì)抑制劑的應用。
背景技術(shù)：
炎癥反應是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分之一，機體通過多種途徑對其進行精密的調(diào)控。但當炎癥反應不可控時，會導致機體多種疾病，如類風濕性關節(jié)炎 (rtheumatoid arthriti)、炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)、神經(jīng)退化性疾病(neurodegenerative disorder)及胺毒性休克(septic shock syndrome)等等， 長期的炎癥反應刺激還會誘發(fā)機體癌變，這些都嚴重威脅著人們的身心健康(I、Monaco, et al. , Curr Drug Targets Inflamm Allergy, 2004, 3, 35-42 ;2、Schwartsburd et al., Cancer Metastasis Rev，2003，22，95-102)，因此對機體過激的炎癥反應進行有效控制是目前開發(fā)治療這些疾病藥物的主要方向。研究表明，上述疾病中的炎癥反應雖然所表現(xiàn)的癥狀不同，但是介導這些炎癥反應的因子或介質(zhì)是相同的，如腫瘤壞死因子- a (Tumor necrosis factor alpha, TNF-a )、白細胞介素-I (Interleukin-lbeta, IL-1 P )、白細胞介素-6(IL_6)等。一氧化氮(NO)、自由基(free radicals)等毒性分子在炎癥反應中可被誘導表達，從而加劇機體的炎癥程度(3、Heller et al.，Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94,2150-2155 ；4,Feldmann et al. ,Nat Med，2003，9，1245-1250)，因此對這些炎癥因子進行抑制將有助于改善機體的炎癥反應。目前，卩引哚美辛(indometacin)、阿司匹林(aspirin)等非類固醇類抗炎藥物 (Non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)已經(jīng)廣泛地用于治療類風濕性關節(jié)炎等炎癥相關的疾病(5,Day et al. ,Med J Aust，1988，148，195-199)，但是所用的NSAIDs 一般都具有副作用，長期服用后會導致胃腸損傷及腎功能不正常等癥狀(6、LiChtenberger et al.，Nat Med, 1995,1,154-158 ;7、Fernandez et al.，Nat Med, 1995,1,602-603)。因此，需要進一步尋找有效抑制炎癥反應的化合物，為以后開發(fā)低副作用的抗炎藥物提供新的思路。真菌環(huán)氧二烯(Mycoepoxydiene, MED)為廈門大學生命科學學院海洋微生物藥物課題組于2002年從海洋微生物中分離得到。4NDM是以Mycoepoxydiene為先導化合物,利用靶向?qū)蛹夹g(shù)，定向設計抑制Hsp90的MED衍生物，并采用熒光滴定的方法，結(jié)合表面等離子體增強(SPR)等技術(shù)，結(jié)果表明，4NDM與Hsp90的親和力比MED與Hsp90的親和力高約100倍。經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，4NDM具有較好的抗腫瘤活性。MTT法體外檢測抗腫瘤活性得到其對于HeLa細胞株的IC50為4. 7 y M(8、張連茹，易玉婷，陳俊杰等，基于抗腫瘤活性化合物MED煙酸類衍生物的設計及作用靶點[D]，廈門:廈門大學學報，2010，31 (6) 1184-1189 ； 9、沈月毛，張偉，張連茹等，真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM及其合成方法與用途，中國專利號ZL201010150471. 2)，但未報道其具有抗炎癥生理活性。所述4NDM是以Mycoepoxydiene為先導化合物,設計并合成的煙酰胺類衍生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供真菌環(huán)氧二烯煙酸類衍生物在制備促炎介質(zhì)抑制劑的應用，特別是真菌環(huán)氧二烯煙酸類衍生物在制備治療內(nèi)毒素休克等由炎癥因子介導的炎癥性疾病藥物中的應用。本發(fā)明所述真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物為6-[(11 ，65，71 ，85)-8-甲基_9_氧雜雙環(huán) [4，2，I]九-2，4- 二烯-7-基]-5-(吡啶-4-氧基)-5,6- 二氫-2H-吡喃-2-酮，簡稱為 4NDM，其分子式為C19H19NO4，結(jié)構(gòu)式為所述真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物為白色針狀晶體，易溶于甲醇、丙酮、二甲基亞砜等有機溶劑中。經(jīng)藥理實驗證實，所述真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物能有效地抑制炎癥因子如腫瘤壞死因子(TNF-CI)、白細胞介素6(IL-6)和一氧化氮(NO)的表達。所述真菌環(huán)氧二烯煙酸類衍生物可用于制備促炎介質(zhì)抑制劑，特別是真菌環(huán)氧二烯煙酸類衍生物可用于制備治療內(nèi)毒素休克等由炎癥因子介導的炎癥性疾病藥物。所述炎癥性疾病包括風濕性關節(jié)炎、炎癥性腸病、神經(jīng)退化性疾病、膿毒性休克
坐寸O


圖I為MTT法檢測4NDM對RAW264. 7細胞的細胞毒性。在圖I中，橫坐標為4NDM 濃度梯度(nmol/L)，縱坐標為595nm的吸光度值(595nm) ;MTT法實驗結(jié)果表明，4NDM對 RAW264. 7細胞不具有細胞毒性；圖中4NDM濃度為0的組為DMSO空白對照組。圖2為MTT法檢測在細菌脂多糖刺激下4NDM對RAW264. 7細胞的細胞毒性。在圖 2中，橫坐標為4NDM濃度梯度(nmol/L)，縱坐標為595nm的吸光度值(595nm) ；MTT法實驗結(jié)果表明，在細菌脂多糖刺激下4NDM對RAW264. 7細胞不具有細胞毒性；圖中4NDM濃度為 0的組為DMSO空白對照組，LPS濃度均為為100ng/mL。圖3為4NDM對經(jīng)細菌脂多糖刺激的RAW264. 7細胞中前炎癥因子TNF- a表達的影響圖。在圖3中，橫坐標為4NDM濃度(nmol/L)，縱坐標為前炎癥因子TNF-a (pg/ml)。圖4為4NDM對經(jīng)細菌脂多糖刺激的RAW264. 7細胞中前炎癥因子IL-6表達的影響圖。在圖4中，橫坐標為4NDM濃度(nmol/L)，縱坐標為前炎癥因子IL_6 (pg/ml)。圖5為4NDM對經(jīng)細菌脂多糖刺激的RAW264. 7細胞中前炎癥因子IL-I ^表達的影響圖。在圖5中，橫坐標為4NDM濃度(nmol/L)，縱坐標為前炎癥因子IL-I ^ (pg/ml)。圖6為4NDM對不同濃度細菌脂多糖刺激的RAW264. 7細胞中促炎癥介質(zhì)TNF-a表達的影響。在圖6中，橫坐標為細菌脂多糖的濃度梯度(ng/ml)，縱坐標為TNF-a的濃度 (pg/ml)。圖7為4NDM對不同濃度細菌脂多糖刺激的RAW264. 7細胞中促炎癥介質(zhì)IL-6表達的影響。在圖7中，橫坐標為細菌脂多糖的濃度梯度(ng/ml)，縱坐標為IL-6的濃度(pg/ ml) o圖8為4NDM對不同濃度細菌脂多糖刺激的RAW264. 7細胞中促炎癥介質(zhì)IL-I ^ 表達的影響。在圖8中，橫坐標為細菌脂多糖的濃度梯度(ng/ml)，縱坐標為IL-I ^的濃度 (pg/ml)。圖9為4NDM對經(jīng)細菌脂多糖刺激的RAW264. 7細胞中NO表達的影響。在圖9中， 橫坐標為4NDM的濃度梯度(y mol/L)，縱坐標為NO的濃度(y mol/L)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實例進一步闡述本發(fā)明。實施例I 4NDM細胞毒性試驗采用MTT法檢測去乙酰真菌環(huán)氧乙酯的細胞毒性，具體步驟如下將RAW264. 7細胞(4 X IO5個細胞/孔)接入96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜，加入細菌脂多糖(lipopoIysaccharide, LPS) (100ng/ml)及不同濃度的 4NDM(0. 1、2. 5、5、7. 5、10、12、 151111101/1，用01^0作為空白對照)共同作用24h或不同濃度的4NDM(0. 1、2. 5、5、7. 5、10、 12、15 u mol/L，用DMSO作為空白對照)單獨作用24h，然后加入MTT至終濃度0. 5mg/ml作用3h，按IOOu I/孔加入溶解液(10% SDS, 0. 01mol/L HCL)過夜后測定OD5950OD595可反映細胞的生長情況，因此通過比較OD595值來判斷4NDM是否存在細胞毒性。MTT法檢測結(jié)果表明(參見圖1、2) 4NDM在0 15 ii mol/L濃度條件下對 RAW264. 7細胞很可能不具有細胞毒性。實施例2 4NDM在抑制細菌脂多糖誘導的RAW264. 7細胞炎癥反應中的應用通過檢測細胞前炎癥因子的濃度變化，從而判明4NDM是否可以抑制RAW264. 7細胞炎癥反應。具體試驗方法如下I)設置4NDM濃度梯度。將RAW264. 7細胞(4 X IO5細胞/mL)接入12孔培養(yǎng)板，24h后換液一次，l-2h后加入LPS至終濃度為100ng/ml刺激6h，同時加入不同濃度的4NDM (0、0. I、I、5、10 ii mol/L，用DMSO作為空白對照)，觀察4NDM對LPS刺激前炎癥因子表達的影響，提取細胞培養(yǎng)上清液做酶聯(lián)免疫吸附檢測。通過ELISA檢測試劑盒 (購自 eBioscience 公司，Mouse TNF-a (Cat# :88-7324-88, Lot# :E09483_1334)、Mouse IL-6 (Cat# :88-7064-88, Lot# E09362-1631)和 Mouse IL-I ^ (Cat# 14-7012-68A, Lot# E12434-1632)試劑盒各一個，)檢測3種前炎癥介質(zhì)的濃度細胞培養(yǎng)上清液中的腫瘤壞死因子-a (TNF-a)和白介素_6 (IL_6)、細胞裂解液中的IL_1 3。細胞裂解液配方為0. I % triton X-100，ImmoI/L DTT,50mmol/L Tris-HCl(pH8. 0)?，F(xiàn)將eBioscience公司ELISA檢測試劑盒檢測方法列舉如下。(I)包被固定相抗體。使用Corning Costar 9018ELISA酶標板,用包被緩沖液以1/250的比例稀釋固相抗體，混合搖勻后加入IOOii L/孔，將酶標板置于4°C過夜反應。(2)清洗。棄去孔內(nèi)溶液，用清洗緩沖液清洗5次，每次間隔lmin，每次每孔洗液不少于250 y L，棄去洗液后輕輕在吸水紙上敲打以增加清洗效果。(3)封閉。將5X的實驗稀釋液稀釋至IX后，按200 ii L/孔加入酶標板，室溫靜直反應Ih0(4)清洗。同步驟⑵，重復清洗至少5次。(5)加入適當抗原。使用IX實驗稀釋液，稀釋陽性標準品，陽性標準品IOOy L/孔， 每個濃度做兩個平行以保證其準確和可靠。加入稀釋好的抗原樣品(100 i! L/孔)至相應的孔中，蓋上蓋子置于室溫靜置反應2h或置于4°C過夜以便使抗原抗體達到最大結(jié)合度。(6)清洗。同步驟⑵，重復清洗至少5次。(7)加入檢測抗體。使用IX實驗稀釋液以1/250的比例稀釋檢測抗體，混合搖勻后加入100 Ii L/孔,置于室溫靜置反應lh。(8)清洗。同步驟⑵，重復清洗至少5次。(9)加入酶標抗體。使用IX實驗稀釋液以1/250的比例稀釋酶標抗體，混合搖勻后加入100 Ii L/孔,置于室溫靜置反應30min。(10)清洗。同步驟(2)，在此次清洗步驟中，應當間隔l_2min清洗一次，且重復清洗至少7次。(11)加入反應底物。每孔加入底物溶液100 U L，于室溫靜置反應15min。(12)每孔加入終止液50 u L，終體積150 U L，終止反應。(13)將酶標板置于酶標儀450nm處測量其最大吸光值(OD)，并數(shù)據(jù)分析。2)LPS濃度梯度。將RAW264. 7細胞(4X105細胞/mL)接入12孔培養(yǎng)板，24h 后換液一次，l-2h后加入LPS至終濃度為100、1000、10000ng/ml刺激6h，同時加終濃度為10 ii mol/L的4NDM，觀察4NDM對不同濃度的LPS刺激前炎癥因子表達的影響，提取細胞培養(yǎng)上清液做酶聯(lián)免疫吸附檢測。通過ELISA檢測試劑盒(購自eBioscience公司， Mouse TNF-a (Cat# :88-7324-88, Lot# :E09483_1334)、Mouse IL-6(Cat# :88-7064-88, Lot# E09362-1631)和 Mouse IL-1 ^ (Cat# 14-7012-68A, Lot# :E12434_1632)試劑盒各一個，)檢測3種前炎癥介質(zhì)的濃度細胞培養(yǎng)上清液中的腫瘤壞死因子-a (TNF-a )和白介素-6(IL-6)、細胞裂解液中的IL-I ^。3)將RAW264. 7細胞(4X105細胞/mL)接入96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜，然后加入 LPS(100ng/ml)及不同濃度的 4NDM(0. 1,2. 5、5、7. 5、10、12、15 y mol/L，用 DMSO 作為空白對照)刺激24h，收集細胞培養(yǎng)上清液，通過Griess方法(硝酸還原酶法)檢測一氧化氮(NO) 的含量。4冊11對經(jīng)細菌脂多糖刺激的狀1264.7細胞中前炎癥因子丁即-0表達的影響圖參見圖3。在圖3中，4NDM在0. l、ly mol/L濃度下對經(jīng)細菌脂多糖刺激的RAW264. 7細胞中前炎癥因子TNF-a的表達具有明顯的抑制作用；4NDM濃度為0的組為DMSO空白對照組， 其他濃度組分別與DMSO組進行t檢驗；**表示p < 0. 01。4NDM對經(jīng)細菌脂多糖刺激的RAW264. 7細胞中前炎癥因子IL_6表達的影響圖參見圖4，在圖4中，4NDM在3、5、10iinmol/L濃度下對經(jīng)細菌脂多糖刺激的RAW264. 7細胞中前炎癥因子IL-6的表達具有明顯的抑制作用；4NDM濃度為0的組為DMSO空白對照組，其他濃度組分別與DMSO組進行t檢驗；***表示p < 0. 01。4NDM對經(jīng)細菌脂多糖刺激的RAW264. 7細胞中前炎癥因子IL_1 ^表達的影響圖參見圖5，在圖5中，4NDM在l、5iimol/L濃度下對經(jīng)細菌脂多糖刺激的RAW264. 7細胞中前炎癥因子IL-I P的表達具有明顯的抑制作用；4NDM濃度為0的組為DMSO空白對照組，其他濃度組分別與DMSO組進行t檢驗；***表示p < 0. 01。4NDM對不同濃度細菌脂多糖刺激的RAW264. 7細胞中促炎癥介質(zhì)TNF-a表達的影響參見圖6，在圖6中，4NDM在IOii mol/L濃度下對經(jīng)不同濃度的細菌脂多糖刺激的RAW264. 7細胞中促炎癥介質(zhì)TNF-a表達具有明顯的抑制作用。圖中LPS組分別與 LPS+4NDM 組進行 t 檢驗，4NDM 濃度為 10 y mol/L 為 LPS，^■為 LPS+4NDM。4NDM對不同濃度細菌脂多糖刺激的RAW264. 7細胞中促炎癥介質(zhì)IL-6表達的影響參見圖7，在圖7中，4NDM在I Oii mo I/L濃度下對經(jīng)不同濃度的細菌脂多糖刺激的RAW264. 7 細胞中促炎癥介質(zhì)IL-6表達具有明顯的抑制作用。圖中LPS組分別與LPS+4NDM組進行t 檢驗，4NDM 濃度為 10 u mol/L 表示 p < 0. 05 ;|ZZI為 LPS，^為 LPS+4NDM。4NDM對不同濃度細菌脂多糖刺激的RAW264. 7細胞中促炎癥介質(zhì)IL-IP表達的影響參見圖8，在圖8中，4NDM在IOii mol/L濃度下對經(jīng)不同濃度的細菌脂多糖刺激的RAW264. 7細胞中促炎癥介質(zhì)IL-IP表達具有明顯的抑制作用。圖中LPS組分別與 LPS+4NDM 組進行 t 檢驗，4NDM 濃度為 10 y mol/L 為 LPS，^■為 LPS+4NDM。4NDM對經(jīng)細菌脂多糖刺激的RAW264. 7細胞中NO表達的影響參見圖9，在圖9中， 4NDM在1、5 ii mol/L濃度下對經(jīng)細菌脂多糖刺激的RAW264. 7細胞中NO的表達具有明顯的抑制作用；圖中4NDM濃度為0的組為DMSO空白對照組，其他濃度組分別與DMSO組進行t 檢驗；***表示p < 0. 01。實驗結(jié)果(參見圖3 9)表明4NDM可抑制細菌脂多糖誘導的RAW264. 7細胞的炎癥反應。4NDM在制備治療風濕性關節(jié)炎、炎癥性腸病、神經(jīng)退化性疾病和膿毒性休克等由促炎癥因子介導的炎癥性疾病藥物中的具有廣泛的應用。
權(quán)利要求
1.真菌環(huán)氧二烯煙酸類衍生物在制備促炎介質(zhì)抑制劑的應用，所述真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物為6-[(11 ，65，71 ，85)-8-甲基 _9_ 氧雜雙環(huán)[4，2，I]九 _2，4-二烯-7-基]-5-(批啶-4-氧基)-5，6- 二氫-2H-吡喃-2-酮，簡稱為4NDM，其分子式為C19H19NO4,結(jié)構(gòu)式為
2.如權(quán)利要求I所述的真菌環(huán)氧二烯煙酸類衍生物在制備治療內(nèi)毒素休克由炎癥因子介導的炎癥性疾病藥物中的應用。
3.如權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于所述炎癥性疾病包括風濕性關節(jié)炎、炎癥性腸病、神經(jīng)退化性疾病、膿毒性休克。
全文摘要
真菌環(huán)氧二烯煙酸類衍生物在制備促炎介質(zhì)抑制劑的應用，涉及真菌環(huán)氧二烯煙酸類衍生物4-NDM。提供真菌環(huán)氧二烯煙酸類衍生物在制備促炎介質(zhì)抑制劑的應用，特別是真菌環(huán)氧二烯煙酸類衍生物在制備治療內(nèi)毒素休克等由炎癥因子介導的炎癥性疾病藥物中的應用。所述真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物的分子式為C19H19NO4。經(jīng)藥理實驗證實，所述真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物能有效地抑制炎癥因子如腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)和一氧化氮(NO)的表達。所述真菌環(huán)氧二烯煙酸類衍生物可用于制備促炎介質(zhì)抑制劑，特別是真菌環(huán)氧二烯煙酸類衍生物可用于制備治療內(nèi)毒素休克等由炎癥因子介導的炎癥性疾病藥物。
文檔編號A61K31/4433GK102579441SQ201210020358
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月29日
發(fā)明者孫藝飛, 宋思揚, 張連茹, 耿晶, 肖淑燕, 鄭忠輝, 黃耀堅 申請人:廈門大學