專利名稱：β3腎上腺素受體阻滯劑的抗腫瘤用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及信號通路領(lǐng)域，具體涉及β 3腎上腺素受體阻滯劑在制備治療藥物中的新用途。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)的β 3腎上腺素受體主要表達在脂肪細胞，尤其在內(nèi)臟脂肪細胞，促進脂肪分解供能。目前已發(fā)現(xiàn)了多種選擇性作用于該受體的激動劑與阻滯劑。對于β3受體的藥物研究主要基于其促脂解作用，將β 3受體激動劑作為減肥藥。但是，對于β 3受體在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的地位和其潛在治療作用，尚無相關(guān)報道。抑癌基因ΤΡ53是調(diào)控DNA損傷修復(fù)和細胞周期的關(guān)鍵基因，ΤΡ53是一個衰老相關(guān)基因，其抑癌作用與衰老密切相關(guān)。它通過調(diào)節(jié)DNA的損傷、自由基生成與清除等控制細胞衰老，Ρ53過度活躍引起干細胞早衰，ρ53本身的修飾是維持其功能的主要原因。大量研究表明Sirtuin 1 (SIRTl)可通過對ρ53的去乙酰化作用在ρ53介導(dǎo)的老化和抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。酵母沉默信息調(diào)節(jié)因子2 (Silent Information Regulator 2，SIR2) 是依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙?；?，SIRTl是與哺乳動物Sir2同源性最高的家族成員，SIRTl蛋白存在于哺乳動物細胞質(zhì)和細胞核中，對細胞生存、衰老和氧化應(yīng)激等起到十分重要的調(diào)節(jié)作用。SIRTl使p53去乙酰化，抑制其轉(zhuǎn)錄活性。此外SIRTl能通過募集到P53靶啟動子處，導(dǎo)致低乙?；诵◇w轉(zhuǎn)錄沉默。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了 β 3腎上腺素受體(adrenergic beta-3-rec印tor，ADRB3)是調(diào)控 SIRTl，p53，mT0R，MIF和microRNA_16信號通路的重要受體。本發(fā)明公開了 β 3腎上腺素受體阻滯劑的用途，用于治療與mT0R/SIRTl/p53/MIF信號通路相關(guān)的疾病，如心肌肥大、肥厚型心肌病、心肌纖維化、肺動脈高壓、動脈粥樣硬化和惡性腫瘤等。本發(fā)明公開了 β3腎上腺素受體阻滯劑在制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)β 3受體阻滯劑和其siRNA可以減少腫瘤及其外周脂肪組織中的SIRTl表達，導(dǎo)致ρ53乙?；?，提高ρ53的轉(zhuǎn)錄活性，增加腫瘤組織中Ρ53，促進腫瘤細胞衰老、凋亡并阻斷遠處轉(zhuǎn)移。β 3受體阻滯劑還可通過促進自噬，減少腫瘤細胞中線粒體，抑制ATP產(chǎn)生。β 3受體阻滯劑通過上調(diào)白血病細胞HL-60 中miR-16-l和miR-15a，促進細胞凋亡。β 3受體激動劑則可增加心臟、肝臟及大腦組織中 SIRTl表達，減少ρ53，起到抗衰老作用。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)β 3受體阻滯劑減少哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的活性，特別是抑制mTOR-Rictor 復(fù)合物，促進線粒體自噬，減少ATP產(chǎn)生。故β3受體激動劑可以作為mTOR的激動劑，增加胰島素的分泌量，改善胰島素抵抗，促進新胰島細胞的生成?？捎糜诒景l(fā)明的β 3受體阻滯劑沒有特別的限制，所有能夠抑制或阻滯β 3受體的化合物都適用于本發(fā)明。代表性的β 3受體阻滯劑的例子是(但不限于)SR59230A，結(jié)構(gòu)式見圖16。以SR59230A為母核的化合物均適用于本發(fā)明。
本發(fā)明的β 3受體阻滯劑的劑型和制備方法沒有特別限制，可用本領(lǐng)域常規(guī)通用的制法制成片劑、膠囊、顆粒劑、緩釋劑、注射劑等各種劑型。本發(fā)明的β 3受體阻滯劑可以作為治療心肌肥大、心肌病、心肌纖維化、肺動脈高壓、腎功能衰竭和惡性腫瘤的藥物。β 3受體激動劑也可以作為SIRTl的激動劑而用于抗衰
ο此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的以上描述的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。


圖1為SR59230A增加MCF-7細胞中p53的表達；圖2為SR59230A減少MCF-7細胞中SIRTl的表達；圖3為BRL37344減少心衰大鼠心肌凋亡；
圖4為BRL37344減少心肌p53、增加SIRTl ；圖5為BRL37344改善心衰大鼠心功能；圖6為脂肪干細胞中β-半乳糖苷酶染色；圖7為Rictor定量PCR ；圖8為mTOR定量PCR ；圖9為裸鼠腫瘤生長曲線；圖10為SR59230A抑制裸鼠腫瘤；圖11為Armexin V/PI流式細胞檢測圖；圖12為SR59230A增加白血病細胞HL-60、K562中miR-16-l ；圖13為SR59230A增加白血病細胞HL-60、K562中miR_15a ；圖14為SR59230A增加白血病細胞HL-60、K562凋亡率；圖15為SR59230A增加前列腺癌細胞PC-3自噬；圖16為SR59230A結(jié)構(gòu)式。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實施例1
阻滯0 3受體減少1 ^-7細胞中51肌1，增加？53表達。不同濃度的SR59230A處理MCF-7細胞，24h后裂解細胞，提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，取IOug蛋白，10% SDS旻PAGE分離后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含4%脫脂牛奶的TBST (10 mmol/L Tris HCl，pH 7. 5，150 mmol/L NaCl,0. 1% Tween 20)封閉膜 1 h，p53 抗體(1 1000)，SIRTl 抗體(1 1000)，4°C，孵育過夜，洗膜后用二抗孵育1 h，ECL顯色，實驗重復(fù)3次。Fluorchem8900軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值，計算目的條帶與內(nèi)參條帶(GAPDH)的比值。結(jié)果如圖1、2示，隨著SR59230A濃度的增加，p53表達增加，而SIRTl逐漸減少。實施例2
在心肌梗死大鼠模型中，興奮β 3受體可以增加心肌細胞SIRT1，并減少ρ53表達，改善心功能，發(fā)揮抗凋亡作用。結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支，造成心梗模型。腹腔注射BRL37344 lmg/kg/day，4周后做心臟b超。取心臟組織檢測凋亡(tunel法)和SIRTU p53表達(western blot)。取心臟，測量左心室重和全心重比值(LVW/BW)。結(jié)果如圖3 5，BRL37344減少心肌p53，并增加SIRTl，減少心肌細胞凋亡，減少心衰大鼠LVW/BW，逆轉(zhuǎn)心肌肥厚，改善心功能。實施例3
阻滯β 3受體增加脂肪干細胞中β-半乳糖苷酶，促進干細胞老化。采用BRL37344和SR59230A各10〃Μ的處理大鼠脂肪干細胞，24h后，多聚甲醛固定，按照β -半乳糖苷酶染色試劑盒說明染色、攝片。結(jié)果如圖6所示與SR59230A相比，BRL37344減少脂肪干細胞中β-半乳糖苷酶，說明激動脂肪干細胞的β 3腎上腺素受體可以起到抗衰老作用。實施例4
興奮β 3受體可減少心肌細胞mTOR-Rictor復(fù)合物。采用BRL37344和SR59230A各IO-7M的處理大鼠心肌細胞，后，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，做定量PCR，檢測mTOR和Rictor基因表達。結(jié)果如圖7、8所示與對照組相比，BRL37344減少mTOR-Rictor復(fù)合物。實施例5
SR59230A減小MCF-7裸鼠移植瘤體積。5周齡、雌性裸鼠皮下注射IO7 MCF-7細胞，建立移植瘤模型。10天后，腫瘤體積約250mm3，隨機分組，每組8只，治療組給予SR59230A IOOnmol/只，腹腔注射，每2天1次，連用5周；對照組給予相同體積溶劑。每次給藥前后用游標卡尺測腫瘤長、寬、高，計算腫瘤體積。腫瘤生長曲線如圖9所示，與對照組相比，SR59230A組裸鼠移植瘤生長緩慢，治療結(jié)束時腫瘤體積為對照組的42. 03%,抑瘤率為57. 97%，相對腫瘤增殖率T/C (%)為39. 8%。取腫瘤組織石蠟包埋切片和蛋白樣品，免疫組化與免疫印跡測 phospho-p70S6K(Thr389), phospho-4E_BPl (Thr37/46)，phospho-mT0R(Ser2448)的表達。結(jié)果表明，SR59230A抑制mTOR活性，減少phospho_p70S6K、phospho-4E_BPl、phospho-mTOR 表達。實施例6
SR59230A和靶向β 3受體的siRNA促進MCF-7乳腺癌細胞、H1975和H1299肺癌細胞的凋亡。經(jīng)電腦程序從β 3AR基因的DNA序列中挑選出最合理的靶序列，然后人工合成該靶序列的DNA片段，將其克隆到載體上。人源U6啟動子克隆到pcDNA3/ne0載體上，用來克隆shRNA的DNA片段。用lipofectin2000把質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染到細胞中4 后，siRNA在細胞內(nèi)表達，Armexin V/PI雙染色，流式細胞儀檢測凋亡率。如圖11所示，沉默β 3AR后增加MCF-7 細胞凋亡率(51. 1 士9. 3% vs 19. 5士4.4%，P <0. 01)，Gl 期細胞增多(72. 6士4. 2 % vs38. 5 士 3. 5 %, P <0.01)。SR 59230A組凋亡率(32. 0 士4. 9%)較對空白照組也明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.01)。H1975和H1299肺癌細胞也得到類似結(jié)果，均表現(xiàn)為SR59230A和靶向β 3受體的siRNA促進Η1975和Η1299凋亡實施例7
SR59230A通過增加白血病細胞HL-60、Κ562中miR-16-l和miR_15a，促進細胞凋亡。采用KT7M的SR59230A的處理白血病細胞HL_60、K562，他后，提取總microRNA，反轉(zhuǎn)錄后，做定量PCR，檢測miR-16-l和miR-lfe表達。流式細胞術(shù)檢測細胞早期凋亡標記ArmexinV / PI及凋亡率。MitoTracker Red CMXRos線粒體探針檢測線粒體數(shù)量，JCl測線粒體膜電位，單丹磺酰戊二胺(Monodansylcadaverine，MDC)染色測自噬體，透射電鏡觀察自噬體并計數(shù)，ATP試劑盒檢測胞內(nèi)ATP水平。結(jié)果如圖12、13、14所示，同對照組相比，SR59230A明顯增加HL-60、K562的miR-16-l和miR-lfe表達，并增加凋亡率(*P<0. 01 )。SR59230A能夠使HL-60、K562細胞線粒體膜電位下降，誘導(dǎo)線粒體自噬，減少線粒體含量，降低胞內(nèi)ATP水平。實施例8
β 3受體調(diào)控線粒體自噬。采用人前列腺癌細胞PC-3，SR59230A和BRL37344各處理 18h，MDC 和線粒體探針 MitoTracker Red CMXRos，37 "C,標記20min, PBS洗3遍，共聚焦顯微鏡和流式細胞儀檢測熒光。Western blot測LC3
II和Beclin-I。結(jié)果SR59230A明顯減少線粒體，增加自噬小體，增加LC3 II和Beclin-I表達。總結(jié)
本發(fā)明揭示了 β 3腎上腺素受體的信號通路，S卩0 3受體調(diào)控虹(《，51肌1，？53等蛋白的表達和活性，對于腫瘤、代謝性疾病、免疫系統(tǒng)疾病以及衰老相關(guān)性疾病的發(fā)生、發(fā)展有重要意義。β 3受體可作為治療靶點，通過調(diào)控β 3受體，治療以上疾病。靴向β 3腎上腺素受體基因的SiRNA正向序列如SEQ ID NO:廣8所示。5，-ctggctaggttatgccaat-3， SEQ ID NO:1 ；5' -cagctctcttgccccatgg-3' SEQ ID NO:2;
5' -cagctctcttgccccatgg-3' SEQ ID NO:3;5' -taccg ccaacaccagtggg-3' SEQ ID N0:4 ；5' -cgtgttcgtgacttcgctg-3' SEQ ID NO:5;5'_ccgcgctgctgtgccttc_3' SEQ ID N0:6 ；5'-ggggtgcccgcctgcggcc_3' SEQ ID NO:7;5' -caccgggccctg tgcacct_3' SEQ ID NO: 8。
權(quán)利要求
1.β 3腎上腺素受體在調(diào)控SIRTl、mTOR和ρ53信號通路中的應(yīng)用。
2.β 3腎上腺素受體阻滯劑在制備SIRTl、SIRT3和SIRT4抑制劑中的應(yīng)用。
3.β 3腎上腺素受體阻滯劑在制備ρ53激動劑或mTOR抑制劑中的應(yīng)用。
4.β 3腎上腺素受體阻滯劑在制備治療SIRTl，mTOR, p53，MIF和microRNA_16信號通路相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
5.β 3腎上腺素受體阻滯劑在制備治療心肌肥大、肥厚型心肌病、心肌纖維化、肺動脈高壓、阿爾茨海默病和惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
6.β 3腎上腺素受體作為一個治療靶點，通過檢測腫瘤及周邊組織的β 3腎上腺素受體的數(shù)量和活性，采用阻滯β 3腎上腺素受體的治療方法來治療腫瘤。
7.β 3腎上腺素受體阻滯劑在制備腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。
8.β 3腎上腺素受體阻滯劑在制備乳腺癌、白血病、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤藥物中的應(yīng)用。
9.靶向β3腎上腺素受體基因的siRNA在制備乳腺癌、白血病、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌惡性腫瘤藥物中的應(yīng)用；siRNA的正向序列如SEQ ID NO:廣8所示。
10.β 3腎上腺素受體阻滯劑在制備抗動脈粥樣硬化、抗冠狀動脈支架內(nèi)再狹窄或冠狀動脈藥物支架涂層藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了β3腎上腺素受體阻滯劑和靶向β3腎上腺素受體基因的siRNA的用途。經(jīng)過大量實驗證實，β3腎上腺素受體是調(diào)控SIRT1、mTOR和p53的重要因子，因此β3腎上腺素受體阻滯劑和β3腎上腺素受體的siRNA可以用于制備治療SIRT1、mTOR和p53信號通路相關(guān)疾病的藥物，如惡性腫瘤、肥厚型心肌病、類風濕性關(guān)節(jié)炎和腎功能衰竭等。本發(fā)明β3腎上腺素受體阻滯劑和β3腎上腺素受體的siRNA具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A61P11/00GK102552912SQ20121002084
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月30日
發(fā)明者林曙光, 鄭猛 申請人:林曙光, 鄭猛