專利名稱：用于組織修復(fù)和生物人造組織工程的細(xì)胞片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞片和制備所述細(xì)胞片的方法，以及使用所述細(xì)胞片促進(jìn)組織修復(fù)和生物人造組織工程的方法。發(fā)明背景
肌肉骨骼病和結(jié)締組織病對(duì)社會(huì)造成破壞性影響。它們是嚴(yán)重的慢性長(zhǎng)期疼痛和體力活動(dòng)能力喪失的最常見(jiàn)原因，影響所有年齡段的人并給社會(huì)帶來(lái)巨大費(fèi)用負(fù)擔(dān)。每3位50歲以上的婦女中就有一位患有骨質(zhì)疏松引起的骨折。每年全世界有兩千三百萬(wàn)至三千四百萬(wàn)人在道路交通事故中受傷。背部疼痛是職業(yè)病假的第二大原因。高達(dá)80%的人在一生中患有背部疼痛。骨關(guān)節(jié)炎在世界范圍內(nèi)影響超過(guò)一億三千五百萬(wàn)人。骨關(guān)節(jié)炎是女性健康問(wèn)題的第4大常見(jiàn)原因，男性健康問(wèn)題的第8大常見(jiàn)原因。全世界每年發(fā)生約3 千萬(wàn)肌腱和韌帶損傷(Maffulli et al. ,Clin Sports Med 2003;22:675-692)。在世界范圍內(nèi)，慢性肌腱病占所有運(yùn)動(dòng)相關(guān)損傷的30-50%，并且?guī)缀跽妓新殬I(yè)病的一半。皮膚疾病、肌肉骨骼系統(tǒng)疾病和結(jié)締組織疾病是住院的主要原因。在美國(guó)，每年進(jìn)行約2X IO5次肌腱和韌帶修復(fù)(Pennisi. Science 2002 ;295 :1011)。前交叉韌帶(ACL)重建在整形外科常進(jìn)行的手術(shù)中排名第6 (Garrett et al. , J Bone Joint Surg Am 2006 ；88 :660-667),并且在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)手術(shù)中排名第I。損傷后的組織修復(fù)非常緩慢且效率低下。例如，在損傷后，肌腱并非通過(guò)再生過(guò)程愈合而是通過(guò)形成機(jī)械強(qiáng)度降低的纖維化瘢痕而愈合，這會(huì)導(dǎo)致明顯的功能障礙和能力喪失。肌腱和骨的手術(shù)復(fù)位經(jīng)常失敗，并且由于缺少填補(bǔ)再生而對(duì)腱骨愈合的造成困難。據(jù)報(bào)道，肩袖修復(fù)術(shù)的失敗率為20%-94%。同樣，ACL在損傷后不會(huì)自然愈合。ACL重建需要將肌腱移植物置于骨隧道內(nèi)，根據(jù)所用評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的不同，ACL重建的失敗率為10% -25%。在老年個(gè)體中，骨質(zhì)疏松的骨的骨折后愈合能力下降。目前，骨關(guān)節(jié)炎無(wú)法治愈。熱損傷或外科手術(shù)損傷后繼發(fā)形成的皮膚增生性瘢痕導(dǎo)致受累組織的瘢痕攣縮和功能受限、兒童生長(zhǎng)受限和外觀容貌問(wèn)題。因此，急性和慢性組織損傷都難以治療，并且能導(dǎo)致長(zhǎng)期的功能性殘疾和疼痛，這給健康護(hù)理系統(tǒng)帶來(lái)長(zhǎng)期負(fù)擔(dān)。通常對(duì)組織損傷進(jìn)行保守治療或外科手術(shù)治療。例如，類固醇注射以及諸如低強(qiáng)度脈沖超聲、震蕩波和理療的物理方法是肌腱/韌帶損傷的常用保守治療。這些治療的效果有時(shí)僅是緩解性的，且治療時(shí)間通常較長(zhǎng)。如果保守治療失敗，則需要進(jìn)行外科手術(shù)來(lái)修復(fù)受損組織。如果損傷非常嚴(yán)重，則可能需要自體移植物、同種異體移植物、異種移植物和假體裝置來(lái)修復(fù)或置換受損的組織，但已經(jīng)證明這些方法的成功是有限的。這些方法都具有一些不可避免的缺點(diǎn)，例如供體部分患病、疾病傳播和組織排斥風(fēng)險(xiǎn)以及長(zhǎng)期功能I耐久性有限。因此，組織工程作為治療組織損傷的潛在策略，其受到的關(guān)注日益增加。組織工程曾經(jīng)列為生物材料下的學(xué)科，但是近些年來(lái)，其范圍和重要性已得到提升，現(xiàn)在組織工程自身已成為?？祁I(lǐng)域。組織工程被定義為使用細(xì)胞、生物材料和合適的生物化學(xué)和/或物理化學(xué)因子的組合來(lái)修復(fù)或置換生物組織。使用組織工程方法研發(fā)臨床用途的功能性置換組織具有促進(jìn)組織修復(fù)、改善組織功能全部恢復(fù)的愈合質(zhì)量以及減少組織再損傷的潛力。細(xì)胞和支架是組織工程的兩個(gè)最基本的組成部分。在可用于組織工程的不同細(xì)胞來(lái)源中，通常使用來(lái)源于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC) (BMSC) (Chong et al.，J Bone JointSurg Am 2007 ；89 :74-81 ；Hankemeier et al. , Arch Orthop Trauma Surg 2007 ； 127 (9)815-821)，這是因?yàn)檫@些細(xì)胞保持了一定程度的自我更新潛能并能分化成多種間充質(zhì)譜系細(xì)胞。這些細(xì)胞的合成和增殖能力也非常強(qiáng)(Liu et al. , Biomaterials 2008 ；29 1443-1453 ；Ge et al. ,Cell Transplant 2005;14:573-583)。盡管這些發(fā)現(xiàn)很鼓舞人心，但是MSC也可能不向目標(biāo)組織類型分化或可能誘導(dǎo)腫瘤形成。例如，據(jù)報(bào)道，將BMSC移植到兔肌腱缺損中會(huì)在構(gòu)建體中形成異位骨并表達(dá)堿性磷酸酶活性(Awad et al. ,J OrthopRes 2003 ；21 :420-431 ； Harr is et al.，J Orthop Res 2004 ；22 :998-1003)。據(jù)報(bào)道，在某些特定環(huán)境下，未分化的BMSC會(huì)誘導(dǎo)腫瘤(Tasso et al. , Carcinogenesis 2009 ；30 (I)150-157)。在移植前，使干細(xì)胞體外分化為組織特異性譜系可能是促進(jìn)組織愈合同時(shí)最小化錯(cuò)誤細(xì)胞分化和腫瘤誘導(dǎo)幾率的良好策略。然而，控制MSC分化成目標(biāo)祖細(xì)胞的方法仍然是巨大的挑戰(zhàn)，這阻礙了 MSC的應(yīng)用。盡管分離自不同組織的干細(xì)胞共有許多重要的干細(xì)胞特征，但是干細(xì)胞的某些特性受到它們來(lái)源的影響(Sakaguchi et al. ,Arthritis Rheum2005 ；52 :2521-2529)。選擇合適的細(xì)胞來(lái)源對(duì)于成功的組織工程是重要的。最近，已經(jīng)在肌腱中分離到干細(xì)胞(Bi etal. , Nat Med 2007 ; 13 (10) 1219-1227)。本發(fā)明人首次報(bào)道了從大鼠中分離并表征肌腱來(lái)源的干細(xì)胞(TDSC) (Rui et al.，Tissue Eng Part A 2010 ；16(5) : 1549-1558。肌腱干細(xì)胞為修復(fù)損傷的組織和生物人造組織工程提供了新的機(jī)遇。
如上文所述，在移植之前，使MSC體外分化為組織特異性祖細(xì)胞是避免錯(cuò)誤的細(xì)胞分化和腫瘤形成問(wèn)題同時(shí)促進(jìn)組織再生的可能方法。據(jù)報(bào)道，不同的因素對(duì)細(xì)胞分化具有影響，所述因素包括生長(zhǎng)因子、機(jī)械刺激、生物材料的組成和解剖學(xué)位置因素、與組織特異性細(xì)胞類型的共培養(yǎng)以及基因修飾。因此，它們可能適合于使MSC體外分化為組織特異性祖細(xì)胞。用作組織修復(fù)支架的生物材料的組成和特性可以顯著地影響新組織的再生。用于組織工程的支架材料有不同類型聚酯、多糖和膠原蛋白衍生物以及磷酸鈣衍生物。諸如聚乙酸醇(PGA)、聚乳酸(PLA)和它們的共聚物聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)的合成支架已經(jīng)用于骨和肌腱的組織工程。它們受到關(guān)注是因?yàn)樗鼈兊慕到猱a(chǎn)物乙醇酸和乳酸是天然代謝物，并且它們具有良好的機(jī)械特性以及突出的可加工性。由于它們是由化合物制備而來(lái)的，因此，它們?cè)试S更好地控制化學(xué)和物理特性以及由此能更好地控制質(zhì)量。然而，這些合成支架的生物相容性非常差，因?yàn)樗鼈儾恢С指咚降募?xì)胞粘附(Zhu et al. ,JBiomed Mater Res 2002 ;62 :532-539)，并且天然代謝物在高濃度時(shí)是酸性的，這可以導(dǎo)致局部炎性反應(yīng)。另一方面，生物支架是高度生物相容的，并且也表現(xiàn)出優(yōu)越的生物功能性，所述生物支架例如相對(duì)純的天然膠原蛋白衍生物以及具有多種天然大分子的復(fù)合脫細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)材料，例如小腸粘膜下層(SIS) (Dejardin et al. , Am J Sports Med 2001 ；29 175-184)和絲(Altman et al. ,Biomaterials 2002 ；23(20) :4131-4141)。但是這些生物支架的局限性是機(jī)械特性較差(Gentleman et al.，Bioamterials 2003 ；24 :3805-3813),并且可加工性也有限(Gentleman et al. , Bioamterials 2003;24:3805-3813)。批次與批次間的差異較大也使得難以可靠地生產(chǎn)這些支架(Koski et al. ,Orthop Clin Nort Am2000 ；31 :437-452)。它們可以引起炎性反應(yīng)、移植排斥(Koski et al. ,Orthop Clin NortAm 2000 ；31 :437-452)，并且具有傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)(Chen et al. ,Stem Cells 2009 ；27(6)1276-1287)。諸如羥基磷灰石和磷酸三 鈣(TCP)的磷酸鈣衍生物通常用作骨再生的支架材料。這些材料通常需要較長(zhǎng)的降解時(shí)間。因此，需要開(kāi)發(fā)合適的細(xì)胞類型和支架材料來(lái)促進(jìn)組織修復(fù)或用于置換受損組織的生物人造組織工程。發(fā)明概述本發(fā)明一方面涉及用于促進(jìn)組織修復(fù)和生物人造組織工程的來(lái)源于干細(xì)胞的細(xì)胞片。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的細(xì)胞片包含處理的干細(xì)胞和所述干細(xì)胞自分泌的細(xì)胞外基質(zhì)，其中所述干細(xì)胞被包埋在所述細(xì)胞外基質(zhì)中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的細(xì)胞片包含約50-95% w/w的水，因此細(xì)胞片的干重為所述細(xì)胞片總重量的約5-50% w/w。細(xì)胞片可以包含選自以下的化合物膠原蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白或以上的任意組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，膠原蛋白選自I型膠原蛋白、II型膠原蛋白、III型膠原蛋白或以上的任意組合。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白聚糖選自聚集蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、二聚糖或以上的任意組合。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，糖蛋白選自彈性蛋白、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)、腱生蛋白C或以上的任意組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞片不含細(xì)胞，即細(xì)胞片的無(wú)細(xì)胞產(chǎn)物。不含細(xì)胞的細(xì)胞片或無(wú)細(xì)胞片的組成或結(jié)構(gòu)與本文所公開(kāi)的細(xì)胞片相同，但是不含細(xì)胞。無(wú)細(xì)胞片可以單獨(dú)用于或與其它細(xì)胞類型或生長(zhǎng)因子聯(lián)合用于促進(jìn)組織修復(fù)或組織工程應(yīng)用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所用的干細(xì)胞是成體干細(xì)胞。諸如成體干細(xì)胞的干細(xì)胞可以分離自動(dòng)物組織或人類組織。用于制備細(xì)胞片的干細(xì)胞是自體的或同種異體的。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，干細(xì)胞分離自肌腱/韌帶組織、骨髓、脂肪組織、牙髓或以上的任意組合，但不限于此。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)細(xì)胞片進(jìn)行化學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物機(jī)械和/或生物物理學(xué)方面的修飾和/添加，從而使得所作的修飾能調(diào)節(jié)細(xì)胞或細(xì)胞片的程度和活性。干細(xì)胞(例如肌腱來(lái)源的干細(xì)胞(TDSC))增殖快速，表現(xiàn)出高的集落形成能力，展示出高的骨形成、軟骨形成、脂肪形成以及肌腱形成的分化潛力，并產(chǎn)生高水平的ECM,同時(shí)具有縮短臨床應(yīng)用的體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)勢(shì)。在其它實(shí)施方案中，通過(guò)包括以下步驟的方法形成本文所公開(kāi)的細(xì)胞片分離干細(xì)胞，擴(kuò)增干細(xì)胞，并用生物因子或?qū)е绿幚淼母杉?xì)胞產(chǎn)生生物因子和/或?qū)е录?xì)胞片成熟的因子處理干細(xì)胞，由此在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化、產(chǎn)生它們自身的細(xì)胞外基質(zhì)并形成細(xì)胞片。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物因子是由氨基酸組成的、調(diào)節(jié)干細(xì)胞生物活性的蛋白。誘導(dǎo)細(xì)胞片形成的生物因子的一個(gè)實(shí)例屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族(TGF)(例如TGF-β)和抗壞血酸。生物因子的另一實(shí)例屬于生長(zhǎng)分化因子/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(GDF/BMP)家族成員(例如⑶F-5/BMP-14、⑶F-6/BMP-13和⑶F-7/BMP-12)和抗壞血酸。生物因子的另一實(shí)例是結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)和抗壞血酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以另外用化學(xué)試劑誘導(dǎo)干細(xì)胞產(chǎn)生所述生物因子和其它 生物因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)基因修飾使干細(xì)胞能過(guò)表達(dá)本文所公開(kāi)的生物因子或其它生物因子。在可選的實(shí)施方案中，利用生物物理學(xué)方法刺激誘導(dǎo)所述生物因子或其它生物因子。在形成軟骨的另一可選的實(shí)施方案中，除了生物和化學(xué)因子以外，還使用壓縮作為機(jī)械力來(lái)刺激軟骨的形成。在骨愈合的另一可選的實(shí)施方案中，向細(xì)胞施加拉力負(fù)荷，以輔助骨或肌腱或韌帶的愈合。本發(fā)明的另一方面是本文所公開(kāi)的細(xì)胞片作為促進(jìn)組織修復(fù)的生物活性材料的用途。細(xì)胞片任選地與生物材料、化學(xué)因子、生物因子、遺傳因子、生物機(jī)械因子、生物物理因子在體外成熟和/或在動(dòng)物中、優(yōu)選諸如裸鼠的免疫缺陷動(dòng)物、或在與細(xì)胞片是自體同源的動(dòng)物中的體內(nèi)成熟形成了用于組織修復(fù)的生物人造材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，將具有活性干細(xì)胞的本發(fā)明的細(xì)胞片用于增強(qiáng)前交叉韌帶(ACL)重建中移除髕骨-髕腱-骨移植物后的髕腱中窗樣損傷的修復(fù)，其中將細(xì)胞片卷起并縫合在窗樣缺損中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使細(xì)胞片包裹破裂位點(diǎn)，將細(xì)胞片用于增強(qiáng)肌腱(例如跟腱、手部肌腱)和韌帶(如后交叉韌帶PCL ;ACL)的縫合修復(fù)。與其它課題組利用骨膜自體移植物相似(Ohteraet al. ,Crit Rev Biomed Eng 2000 ;28(1_2) :115-118 ；Youn et al. ,Clin Orthop RelatRes2004 ；419 :223-231 ；Chen et al. , J Orthop Surg Taiwan 2003 ；20 :21-29),通過(guò)用細(xì)胞片包裹肌腱移植物，可以將細(xì)胞片用于在ACL重建中促進(jìn)腱骨連接再生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將細(xì)胞片縫合于肌腱和骨之間的界面，而將所述細(xì)胞片用于肩袖修復(fù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將細(xì)胞片置于缺損處，將所述細(xì)胞片用于修復(fù)諸如骨折的骨疾病狀態(tài)或疾病、諸如骨關(guān)節(jié)炎或骨軟骨缺損的軟骨疾病狀態(tài)或疾病、諸如肌肉撕裂的肌肉疾病狀態(tài)或疾病、諸如創(chuàng)傷或燒傷的皮膚疾病狀態(tài)或疾病。本發(fā)明的另一方面是單獨(dú)使用細(xì)胞片的無(wú)細(xì)胞產(chǎn)物或聯(lián)合使用所述無(wú)細(xì)胞產(chǎn)物與其它細(xì)胞類型或生長(zhǎng)因子來(lái)促進(jìn)組織修復(fù)。在脫細(xì)胞化后，將細(xì)胞片與上文所述相似地用作組織工程應(yīng)用的無(wú)細(xì)胞生物材料。無(wú)細(xì)胞產(chǎn)物被用于防止修復(fù)缺口形成或修復(fù)失敗、增強(qiáng)宿主細(xì)胞粘附、滲透和增殖?？梢砸悦摷?xì)胞化產(chǎn)物的形式使用本文所公開(kāi)的細(xì)胞片，并且與其它已知的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞類型一起用于促進(jìn)組織修復(fù)。本發(fā)明的另一方面是本文所公開(kāi)的細(xì)胞片在形成用于組織置換的生物人造器官中的用途。細(xì)胞片與生物材料、化學(xué)因子、生物因子、遺傳因子、生物機(jī)械因子、生物物理因子在體外成熟和/或在動(dòng)物中、優(yōu)選諸如裸鼠的免疫缺陷動(dòng)物中、或在與細(xì)胞片是自體同源的動(dòng)物中的體內(nèi)成熟形成了用于組織置換的生物人造器官。在一個(gè)實(shí)施方案中，在體外卷起細(xì)胞片并加載于U形彈性針、隨后在裸鼠模型中進(jìn)一步生長(zhǎng)后，形成肌腱樣組織/韌帶樣組織。體外培養(yǎng)步驟的其它改動(dòng)可以進(jìn)一步改善生物人造器官工程的組織結(jié)構(gòu)，所述改動(dòng)例如施加體外機(jī)械負(fù)荷或聯(lián)合應(yīng)用體外機(jī)械負(fù)荷與其它生物材料或生長(zhǎng)因子。結(jié)合附圖閱讀下文的詳細(xì)描述后，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)勢(shì)將會(huì)顯而易見(jiàn)。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明下文所述附圖僅意圖用于說(shuō)明目的，并非意圖限制本發(fā)明的范圍。

圖1(A和B)顯示了第10天時(shí)從綠色熒光蛋白(GFP)大鼠中分離的配對(duì)的大鼠TDSC(TDSC)和大鼠BMSC(BMSC)的集落形成能力的比較(IOcm2皿中100個(gè)細(xì)胞)(η = 5)。圖I (C)顯示了利用BrdU分析測(cè)定的配對(duì)的大鼠TDSC和大鼠BMSC在第2天時(shí)的增殖能力(η = 12) ο *ρ < O. 050。與大鼠BMSC相比，大鼠TDSC形成更多的集落(ρ = O. 010)(圖1Α、1Β)，并且增殖更快(ρ < O. 001)(圖 1C)。圖2(Α_Η)顯示了基礎(chǔ)完全培養(yǎng)基中從GFP大鼠分離的配對(duì)的大鼠TDSC和大鼠BMSC 中(A)腱調(diào)蛋白(Tnmd), (B) scleraxis (Scx)、(C)I 型膠原蛋白 a I (CollAl) (D) III型膠原蛋白a l(Col3Al) (E)CollAl/Col3Al的比、(F)核心蛋白聚糖(Dcn), (G)腱生蛋白(Tnc)、(H)堿性磷酸酶(Alpl)、(I) II型膠原蛋白a I (Col2Al)、(J)聚集蛋白聚糖(Acan)和(K) 二聚糖(Bgn)的 mRNA 表達(dá)。*p ^ O. 050。與基礎(chǔ)完全培養(yǎng)基中配對(duì)的大鼠BMSC相比，大鼠TDSC表達(dá)的肌腱形成標(biāo)志物(Tnmd、Scx、CollAl、Dcn、Bgn)、軟骨形成標(biāo)志物(Col2Al)以及骨形成標(biāo)志物(ALP)的mRNA水平更高(所有的P = O. 050)。發(fā)現(xiàn)了這樣的趨勢(shì)與BMSC相比，TDSC中Col3Al的mRNA表達(dá)較低并且Tnc和Acan的表達(dá)較高，但是這些差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。圖3 (A-D)顯示了從GFP大鼠分離的大鼠BMSC (A、C)和大鼠TDSC (B、D)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(A、B)或骨形成誘導(dǎo)培養(yǎng)基(C、D)培養(yǎng)21天后的鈣結(jié)節(jié)的茜素紅S染色。放大率100倍。比例尺=100μπι。圖3(E)顯示了與鈣結(jié)節(jié)結(jié)合的茜素紅S染色的定量分析。圖
3(F-J)顯示了在基礎(chǔ)培養(yǎng)基或骨形成培養(yǎng)基培養(yǎng)21天的配對(duì)的大鼠TDSC和大鼠BMSC中(F)Alpl, (G)Runx2、(H)Bmp2、(I)Sppl 和(J)Bglap 的 mRNA 表達(dá)。*p ( O. 050。在骨形成誘導(dǎo)之后，大鼠TDSC中形成的鈣結(jié)節(jié)多于大鼠BMSC中形成的鈣結(jié)節(jié)。在第21天時(shí)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中大鼠TDSC的Alpl、Runx2、Bmp2和Bglap的表達(dá)顯著高于大鼠BMSC (所有p = 0. 004)。在骨形成誘導(dǎo)第21天時(shí)，大鼠TDSC中Alpl (ρ = O. 006)、Runx2 (ρ=O. 006)、Bmp2 (ρ = 0. Oil)、Sppl (p = 0. 006)和 Bglap (ρ = 0. 006)的表達(dá)顯著高于大鼠BMSC。圖4 (A-D)顯示了從GFP大鼠分離的配對(duì)的大鼠TDSC (A、B)和大鼠BMSC (C、D)在軟骨形成誘導(dǎo)14天(A、C)和21天(B、D)后的軟骨細(xì)胞表型(箭頭)的存在。染色蘇木精和伊紅；放大率200倍；插圖放大率400倍。圖4(E-H)顯示了從GFP大鼠分離的配對(duì)的大鼠TDSC(E、F)和大鼠BMSC(G、H)在軟骨形成誘導(dǎo)14天(E、G)和21天(F、H)后的粘多糖沉積。染色阿爾新藍(lán)；放大率200倍；插圖放大率400倍。圖4 (I-K)顯示了基礎(chǔ)培養(yǎng)基或軟骨形成培養(yǎng)基中的從GFP大鼠分離的配對(duì)的大鼠TDSC和大鼠BMSC在第O天、第7 天、第 14 天和第 21 天時(shí)的(I) Col2Al、(J) Acan、(K) Sox9 的 mRNA 表達(dá)比。*p < O. 050。在第14天和第21天時(shí)，在由大鼠TDSC形成的細(xì)胞團(tuán)中觀察到更多類似軟骨細(xì)胞的細(xì)胞。在第14天和第21天時(shí)，由大鼠TDSC形成的細(xì)胞團(tuán)中的粘多糖沉積多于由大鼠BMSC形成的細(xì)胞團(tuán)的粘多糖沉積。軟骨形成誘導(dǎo)后，大鼠TDSC中Col2Al和Acan的表達(dá)比顯著高于大鼠BMSC，而對(duì)于Sox9的表達(dá)比則未觀察到該現(xiàn)象。
圖5(A-D)顯示了從GFP大鼠分離的配對(duì)的大鼠BMSC(A、C)和大鼠TDSC(B、D)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(A、B)或脂肪形成培養(yǎng)基(C、D)培養(yǎng)21天后的油滴的油紅O染色。放大率100倍。比例尺=100 μ m。圖5 (E-F)顯示了從GFP大鼠分離的配對(duì)的大鼠TDSC和大鼠BMSC在基礎(chǔ)培養(yǎng)基或脂肪形成培養(yǎng)基培養(yǎng)21天后的(E) PPAR Y 2and (F) C/ΕΒΡ α的mRNA表達(dá)。*p ^ 0. 050。脂肪形成誘導(dǎo)21天后，大鼠TDSC中形成的油滴多于大鼠BMSC。脂肪形成誘導(dǎo)后，大鼠TDSC中PPAR Y 2 (ρ = O. 006)的表達(dá)顯著高于大鼠BMSC，，但是對(duì)于C/ΕΒΡ α (ρ =O. 262)則未觀察到該現(xiàn)象。圖6顯示了從GFP大鼠分離的配對(duì)的大鼠TDSC和大鼠BMSC在肌腱形成誘導(dǎo)后的肌腱相關(guān)標(biāo)志物的mRNA表達(dá)。(A)腱調(diào)蛋白(Tnmd)、(B) I型膠原蛋白a I(CollAl) (C)scleraxis (Scx)和(D)腱生蛋白 C(Tnc)。*p < O. 050。
在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以及誘導(dǎo)后，大鼠TDSC中Tnmd (ρ = O. 004)和Col IAl (ρ = O. 004)的表達(dá)高于大鼠BMSC，而對(duì)Scx (ρ = O. 423)和Tnc (ρ = O. 150)則沒(méi)有觀察到該現(xiàn)象。圖7顯示了分別由從GFP大鼠分離的TDSC和從胭腱分離的人TDSC經(jīng)過(guò)CTGF和抗壞血酸處理后形成的大鼠TDSC片(A)和人TDSC片(B)的總體視圖。用CTGF和抗壞血酸分別處理大鼠TDSC和人TDSC 2周和4周后，產(chǎn)生豐富的細(xì)胞外基質(zhì)，并形成細(xì)胞片。TDSC片不易被胰蛋白酶消化。圖8(Α-Β、Α’-Β’)顯示了從GFP大鼠分離的大鼠TDSC(A、A’)和大鼠BMSC(B、B’)經(jīng)過(guò)CTGF和抗壞血酸處理后所形成的細(xì)胞片的組織學(xué)。細(xì)胞性高。干細(xì)胞是圓形的，并且隨機(jī)定向于細(xì)胞外基質(zhì)中。與大鼠BMSC(B)相比，大鼠TDSC(A)中產(chǎn)生更多的細(xì)胞外基質(zhì)。偏光顯微鏡顯微檢查也證實(shí)，膠原蛋白原纖維是細(xì)的且隨機(jī)定向。與大鼠BMSC(B’ )相比，在大鼠TDSC(A’)中觀察到更多縱向排列的原纖維。染色蘇木精和伊紅；放大率100倍。比例尺=100 μ m。圖9 (A-C)顯示了在卷起由從GFP大鼠分離的經(jīng)過(guò)處理的大鼠TDSC形成的細(xì)胞片并將其加載到U形彈性針上后，形成了生物人造肌腱和韌帶。圖9 (D)展示了用于比較的完整的大鼠屈肌腱。圖10顯示了用CTGF和抗壞血酸處理細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞片形成之后，從GFP大鼠分離的大鼠TDSC中肌腱相關(guān)標(biāo)志物的mRNA表達(dá)。(A) scleraxis (Scx)、(B)腱調(diào)蛋白(Tnmd)、(C)I 型膠原蛋白 a I(CollAl)和(D)腱生蛋白 C(Tnc)。*ρ ( 0.050。處理后，大鼠TDSC 中 Tnmd(ρ = O. 004)、Scx(ρ = O. 010)和 CollAl (ρ = O. 004)的表達(dá)增加。大鼠TDSC中Tnc的表達(dá)增加在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著(P = O. 078)。圖11顯示了細(xì)胞片中從GFP大鼠分離的配對(duì)的大鼠TDSC和大鼠BMSC的軟骨相關(guān)標(biāo)志物(Col2Al、Acan)和骨相關(guān)標(biāo)志物(Bglap)的mRNA表達(dá)。形成細(xì)胞片后，大鼠TDSC 和大鼠 BMSC 中 Col2Al (A)(分別為 ρ = O. 004 和 ρ = O. 037)和 Bglap (C)(分別為 ρ=O. 018和ρ = O. 025)的表達(dá)降低。形成細(xì)胞片后，大鼠TDSC中Acan(B)的表達(dá)降低(ρ=O. 004)，而大鼠BMSC中Acan(B)的表達(dá)不降低(ρ = O. 873)。然而，形成細(xì)胞片后，大鼠 TDSC 中 Col2Al (ρ = O. 004) ,Acan (ρ = O. 004)和 Bglap (ρ = O. 006)的表達(dá)仍高于大鼠BMSC。*p ( O. 050。圖12顯不了分別利用Sirius Red F3BA染色分析和Fast Green FCF染色分析，由從GFP大鼠分離的大鼠TDSC經(jīng)過(guò)CTGF和抗壞血酸處理來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞片形成之后而產(chǎn)生的膠原蛋白酶(A-E)和非膠原蛋白(F-J)。未處理的TDSC (A、C、F、H):處理的TDSC (B、G、D、I);放大率(C、D、H、I) :100 倍；圖12(E)和(J)分別顯示了處理的和未處理的TDSC中Sirius Red F3BA和FastGreen FCF染色的吸光度。*p ( O. 050。 細(xì)胞片的細(xì)胞中產(chǎn)生的膠原蛋白(ρ = O. 004)和非膠原蛋白(P = O. 006)的表達(dá)更高。圖13顯示了從胭腱分離的人TDSC在經(jīng)過(guò)CTGF和抗壞血酸處理4周來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞片形成之后的㈧水含量、(B)硫酸化粘多糖(sGAG)、以及乙酸-胃蛋白酶可溶部分的(C)總膠原蛋白、(D)I型膠原蛋白和(E)III型膠原蛋白。人的胭腱作為參照。人TDSC片含有90. 2土 L 4%的水和18. 0± 1.6%的sGAG(干重)。乙酸-胃蛋白酶可溶部分含有4. 5±4.0% (干重)的總膠原蛋白，其中主要是I型膠原蛋白(5.4±4.8%干重)。僅有少量的III型膠原蛋白(8E-05±2. 5E-05%干重)，并且II型膠原蛋白的水平低于ELISA試劑盒的2ng/ml的檢測(cè)限(結(jié)果未示出)。圖14(D)顯示了在掃描電鏡下觀察到的，由經(jīng)過(guò)CTGF和抗壞血酸處理4周來(lái)形成細(xì)胞片之后得到的人TDSC合成膠原蛋白原纖維并將其分泌到細(xì)胞外間隙(箭頭)。膠原蛋白原纖維是有組織的(E-F)。圖14(A-C)顯示了作為參照的人的胭腱中膠原蛋白原纖維的組織性。比例尺10ym(A、D) ;1 μ m(B、C、E、F)。(D)中的方塊顯示在(F)中。圖14(G)顯示了通過(guò)圖像分析軟件測(cè)量的人的胭腱和人TDSC片中膠原蛋白原纖維的直徑。與人的胭腱中膠原蛋白原纖維相比，人TDSC片中的膠原蛋白原纖維較小并且組織較差。在處理的人TDSC中，膠原蛋白原纖維在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生并被分泌到細(xì)胞外間隙(箭頭)。在某些膠原蛋白化的區(qū)域，細(xì)胞邊界變得模糊(箭頭)。與人的胭腱相似，人TDSC片中的膠原蛋白原纖維為單峰分布。人TDSC片中的原纖維大小為86. 1±25. Inm(范圍50nm-200nm)而人的胭腱中的原纖維大小為141. 5±35. 2nm(范圍70nm-250nm) (ρ< O. 001)。圖15顯示了裸鼠模型中由從GFP大鼠分離的綠色熒光蛋白(GFP)-TDSC形成的細(xì)胞片的體內(nèi)發(fā)育和成熟。圖15(A)顯示了細(xì)胞片的皮下移植。圖15(B)顯示了移植后第8周時(shí)的移植組織。圖15(C_E、C’ -E’ )分別顯示了移植前、移植后第6周和第8周時(shí)的細(xì)胞片的組織學(xué)。移植后6周的細(xì)胞性和血管性(箭頭)很好(D)。細(xì)胞仍然是隨機(jī)定向的并且是圓的(D)。產(chǎn)生了大量細(xì)胞外基質(zhì)(D)，但是正如偏光顯微鏡顯微檢查所示，組織條理并不好(D’)。移植后8周，細(xì)胞性下降(E)。形成肌腱樣組織和韌帶樣組織(E)。細(xì)胞變成紡錘形，沿加載軸縱向排列并被包埋于平行的原纖維之間(E)。第8周時(shí)的原纖維比移植前更厚，并表現(xiàn)出肌腱/韌帶的典型膠原蛋白雙折射(E’)。圖15 (F、F’、G、G’ )顯不了裸鼠t旲型中移植后6周(F、F’)和8周(G、G’ )后的細(xì)胞片的更高放大率圖像。在第8周時(shí)，細(xì)胞沿著加載軸縱向排列并且被包埋在平行的膠原蛋白原纖維之間(星號(hào)、F)。染色蘇木精和伊紅；放大率(C-E、C’ -E’ ) 50倍；(F、F’、G、G’)200倍；比例尺=100 μ m ;箭頭血管；星號(hào)排列的細(xì)胞。圖15 (H、I)顯示了裸鼠模型中移植6周⑶和8周⑴后，細(xì)胞片的離體熒光成像。因?yàn)橛糜谛纬杉?xì)胞片的TDSC分離自GFP大鼠，所以可以檢測(cè)到綠色熒光信號(hào)。在第6周時(shí)，在移植了未加載的細(xì)胞片的裸鼠中未觀察到熒光信號(hào)。細(xì)胞片降解并且無(wú)法發(fā)現(xiàn)(圖15H的左側(cè)小鼠)。在第6周和第8周時(shí)，在縫合于裸鼠脊柱肌肉的移植組織中能檢測(cè)到突光信號(hào)。 圖16顯示了將大鼠GFP-TDSC片縫合于大鼠髕腱窗樣創(chuàng)傷的手術(shù)過(guò)程，以及在第2周進(jìn)行離體熒光成像時(shí)，窗樣創(chuàng)傷中存在GFP-TDSC。圖12(A)顯示了用兩個(gè)疊放的刀片在髕腱中制造窗樣創(chuàng)傷。圖16(B和C)顯示了將細(xì)胞片卷起并縫合于窗樣創(chuàng)傷中的髕骨和脛骨近端。圖16 (D、E)顯示了在第2周時(shí)無(wú)細(xì)胞片的(D)和具有細(xì)胞片(E)的受損髕腱。圖16(F)和(G)分別顯示了第2周時(shí)圖16⑶和圖16(E)的對(duì)應(yīng)熒光圖像。圖17顯示了由從GFP大鼠分離的TDSC形成的細(xì)胞片在促進(jìn)髕腱窗樣創(chuàng)傷大鼠模型中的愈合中的作用，通過(guò)第2周時(shí)的組織學(xué)檢查證實(shí)。TDSC片組的細(xì)胞性似乎高于對(duì)照組，這可能是細(xì)胞片移植造成的(C與F相比)。正如細(xì)胞外基質(zhì)的蘇木精和伊紅穩(wěn)定性所表明的，TDSC片組中觀察到的膠原蛋白表達(dá)高于對(duì)照組。在TDSC片組的窗樣創(chuàng)傷的中心觀察到平行的膠原蛋白纖維之間排列的細(xì)長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(*、E)，但是在對(duì)照組中未觀察到該現(xiàn)象(B)。伴隨該現(xiàn)象的是，在極化顯微鏡下，TDSC片組中窗樣創(chuàng)傷的膠原蛋白雙折射(E’)高于對(duì)照組(B’)。在兩個(gè)組中都能容易地鑒別創(chuàng)傷邊界(C、E)。染色蘇木精和伊紅;A’ -F’是對(duì)應(yīng)的極化圖像。比例尺=500ym(A、A’，、D、D’ );比例尺=100 μ m(B、B’、C、C，、E、E’、F、F，);放大倍數(shù)50 倍(A、A’、D、D’ ) ;200倍(B、B’、C、C’、E、E’、F、F) ;* :成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的縱向排列；N:窗樣創(chuàng)傷附近的正常的完整肌腱；W :創(chuàng)傷區(qū)域。圖18通過(guò)組織學(xué)方法顯示了由分離自GFP大鼠的大鼠TDSC所形成的細(xì)胞片在促進(jìn)髕腱窗樣損傷大鼠模型的愈合中的作用。在第8周，兩個(gè)組中創(chuàng)傷內(nèi)的細(xì)胞性都降低，但是TDSC片組(E、F)仍然高于對(duì)照組(B、C)。盡管如此，在兩個(gè)組的創(chuàng)傷中心(B、B’與E、E’相比)和創(chuàng)傷邊緣(C、C’與F、F’相比)，TDSC片組中的細(xì)胞和膠原蛋白纖維比對(duì)照組排列地更好，并且膠原蛋白雙折射更高。與對(duì)照組(C)相比，TDSC片組的創(chuàng)傷邊界比較模糊(圖18F)。染色蘇木精和伊紅；A’ -F，是對(duì)應(yīng)的極化圖像。比例尺=500ym(A、A’、D、D’ );比例尺=100 μ m(B、B’、C、C’、E、E，、F、F，);放大倍數(shù)50 倍(A、A，、D、D，) ;200 倍(B、B，、C、C，、E、E，、F、F) ;* :成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的縱向排列；箭頭血管；N :窗樣創(chuàng)傷附近的正常的完整肌腱；W :創(chuàng)傷區(qū)域。圖19顯示了將由從GFP大鼠分離的TDSC形成的細(xì)胞片移植到髕腱窗樣缺損2周和8周以及未進(jìn)行細(xì)胞片移植的髕腱窗樣缺損的再生組織的極限應(yīng)力(A)和楊氏模量(B)。#P ( O. 050 ;“0”和分別表示本研究中的外界和極限值。在TDSC片組和對(duì)照組中，從第2周到第8周，再生組織的極限應(yīng)力(TDSC組為ρ =O. 002，對(duì)照組為ρ = 0. 007)和楊氏模量(TDSC組為ρ = O. 002，對(duì)照組為ρ = O. 032)都顯著增加。在TDSC片組中，第2周時(shí)(ρ = O. 015 ;4. 5±1.9N/mm2相比于2. 5±0. 8N/mm2)和第8周時(shí)(ρ = O. 035 ；13. I ±5. ON/mm2相比于8. 4±5. 9N/mm2)的極限應(yīng)力⑷以及第2周時(shí)的楊氏模量(P = O. 046 ；20. 7±6. ON/mm2相比于14. 9±2. 5N/mm2)⑶都顯著高于對(duì)照組。在第8周時(shí)，TDSC組的楊氏模量也高于對(duì)照組，但是不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(ρ = O. 110 ；52. 8±18. 7N/mm2相比于36. 2±13. 8N/mm2)⑶。發(fā)明的詳細(xì)描述下面參考附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明。本文所用術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”指表現(xiàn)出自我更新和多系分化潛力的細(xì)胞?！疤幚淼母杉?xì)胞”是指用生物因子、化學(xué)因子、遺傳因子、生物機(jī)械因子或生物物理因子處理過(guò)的干細(xì)胞，所述處理使干細(xì)胞能產(chǎn)生生物因子或者使本文所公開(kāi)的細(xì)胞片成熟本文所用術(shù)語(yǔ)“生物因子”指由氨基酸組成的、能調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物活性的所有蛋白。在本發(fā)明的一方面，利用干細(xì)胞形成用于促進(jìn)組織修復(fù)和生物人造組織工程的細(xì)胞片。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)包括以下步驟的方法制備本文公開(kāi)的細(xì)胞片處理干細(xì)胞，使得處理的干細(xì)胞能被包埋于其自分泌的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中，并形成細(xì)胞片。因此，本文所公開(kāi)的細(xì)胞片包含處理的干細(xì)胞和由所述處理的干細(xì)胞自分泌的并包埋了所述處理的干細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)。用于形成本發(fā)明細(xì)胞片的化學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物機(jī)械學(xué)或生物物理學(xué)因子或試劑例如但不限于諸如生長(zhǎng)因子的化合物、化學(xué)試劑或生物材料；或干細(xì)胞的基因修飾、體外機(jī)械負(fù)荷或生物物理干預(yù)。上述因子或試劑可以用于本發(fā)明的干細(xì)胞或細(xì)胞片，只要其能調(diào)節(jié)細(xì)胞或細(xì)胞片的程度和活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的細(xì)胞片包含約50-95% w/w的水，因此細(xì)胞片的干重為細(xì)胞片總重量的約5-50% w/w。細(xì)胞片可以包含選自膠原蛋白、蛋白聚糖和糖蛋白或以上的任意組合的化合物；所述膠原蛋白選自I型膠原蛋白、III型膠原蛋白、II型膠原蛋白或以上的任意組合；所述蛋白聚糖選自聚集蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、二聚糖或以上的任意組合；所述糖蛋白選自彈性蛋白、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)、腱生蛋白C或以上的任意組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞片包含占所述細(xì)胞片干重的40-90% w/w的膠原蛋白、O. 5-30% w/w的蛋白聚糖以及1-30% w/w的糖蛋白。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，膠原蛋白包含占膠原蛋白總重量的70-98% w/w的I型膠原蛋白、1-15% w/w的III型膠原蛋白以及1-5%的II型膠原蛋白；或者，所述膠原蛋白優(yōu)選包含占膠原蛋白總重量的70-98% w/w的I型膠原蛋白、1-5% w/w的III型膠原蛋白以及1-5%的II型膠原蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的細(xì)胞片包含直徑為5_500nm的原纖維。優(yōu)選地，所述細(xì)胞片具有直徑為50-250nm的原纖維。細(xì)胞片的極限應(yīng)力為至少lN/mm2、更優(yōu)選至少5N/mm2、更優(yōu)選約5_10N/mm2。應(yīng)力值取決于培養(yǎng)條件，但也基于當(dāng)前設(shè)置。例如，用CTGF和抗壞血酸培養(yǎng)2周后并折疊后的大鼠TDSC片在裝載到斷裂的過(guò)程中能夠達(dá)到約5-10N/mm2 ο在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所用的干細(xì)胞是成體干細(xì)胞。干細(xì)胞分離自動(dòng)物組織或人類組織。用于制備細(xì)胞片的干細(xì)胞是自體的或同種異體的。本發(fā)明的干細(xì)胞可以分離自肌腱組織和韌帶組織、骨髓、脂肪組織、牙髓或以上的任意組合，但不限于此。在一個(gè)實(shí)施方案中，快速增殖、表現(xiàn)出高的集落形成能力、目標(biāo)組織特異性標(biāo)志物的表達(dá)水平高并產(chǎn)生高水平的ECM的干細(xì)胞具有形成細(xì)胞片的優(yōu)勢(shì)，這是由于它們能縮短體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間并提高處理后體外形成細(xì)胞片的成功率。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，干細(xì)胞是肌腱來(lái)源的干細(xì)胞(TDSC)。TDSC 是根據(jù) Rui et al. Tissue Eng Part A 2010 ；16(5) :1549-1558 所述從肌腱分離的干細(xì)胞。該細(xì)胞能形成集落，在低細(xì)胞密度下表現(xiàn)出較好的細(xì)胞增殖，表達(dá)表面標(biāo)志物⑶44和⑶90，但是對(duì)于表面標(biāo)志物⑶31和⑶34是陰性的。該細(xì)胞還表現(xiàn)出多系分化潛力，并在誘導(dǎo)后能分化成肌腱、韌帶、軟骨(軟骨細(xì)胞)或成骨細(xì)胞。參考圖1-6，在基礎(chǔ)水平和誘導(dǎo)后，與骨髓來(lái)源的干細(xì)胞(BMSC)相比，TDSC都表現(xiàn)出較高的集落形成能力、增殖潛力和多系分化潛力。因此，TDSC是用于形成細(xì)胞片的優(yōu)良干細(xì)胞來(lái)源。同種異體或自體的TDSC易于從肌腱/韌帶外科手術(shù)的廢棄材料中獲得，例如ACL重建中的肌腱移植組織和全膝關(guān)節(jié)置換中的肌腱和韌帶組織。與通過(guò)骨髓穿刺分離BMSC和通過(guò)吸脂術(shù)分離脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(ADSC)相比，從常規(guī)外科手術(shù)的廢棄組織中分離干細(xì)胞具有避免對(duì)患者造成額外疼痛的優(yōu)勢(shì)。在分離后直接使用同種異體干細(xì)胞，或?qū)⑵浔４嬖谝旱?，直到需要用其制備?xì)胞片。本發(fā)明的其它方面提供了制備本文所公開(kāi)的細(xì)胞片的方法。所述方法包括以下步驟用生物因子或?qū)е滤黾?xì)胞片成熟和/或?qū)е庐a(chǎn)生生物因子的因子處理干細(xì)胞，從而在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化、產(chǎn)生ECM并由此形成細(xì)胞片，其中所述導(dǎo)致產(chǎn)生的生物因子包括用于處理干細(xì)胞的生物因子。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，本文發(fā)明所用的生物因子是由氨基酸組成的、能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物活性的蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物因子包含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族(TGF)(例如TGF-β)和抗壞血酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物因子包含生長(zhǎng)分化因子/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(⑶F/BMP)家族成員(例如 GDF-5/BMP-14、GDF-6/BMP-13 和 GDF-7/BMP-12)和抗壞血酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞形成的生物因子是結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)和抗壞血酸。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，導(dǎo)致本發(fā)明的生物因子產(chǎn)生或細(xì)胞片成熟的因子還可以是化學(xué)、遺傳學(xué)、生物機(jī)械學(xué)或生物物理學(xué)因子或試劑。在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括使用化學(xué)試劑和生物試劑來(lái)誘導(dǎo)生物因子的產(chǎn)生和/或使用基因修飾來(lái)誘導(dǎo)生物因子的過(guò)表達(dá)。在形成細(xì)胞片的可選實(shí)施方案中，還可以將體外機(jī)械負(fù)荷或生物物理學(xué)方法用于細(xì)胞或細(xì)胞片。在形成軟骨的另一可選實(shí)施方案中，將壓縮施加于細(xì)胞或細(xì)胞片，作為機(jī)械力來(lái)刺激軟骨形成。在形成骨、肌肉、肌腱或韌帶的另一可選實(shí)施方案中，將張力作為機(jī)械力施加于細(xì)胞或細(xì)胞片，從而形成骨樣、肌肉樣、肌腱樣或韌帶樣組織。在利用得到的細(xì)胞片進(jìn)行軟骨修復(fù)的另一可選實(shí)施方案中，將壓縮負(fù)荷施加于細(xì)胞或細(xì)胞片，作為機(jī)械力來(lái)刺激軟骨基質(zhì)的形成。在骨、肌肉、肌腱或韌帶愈合的另一可選實(shí)施方案中，將張力作為機(jī)械力施加于細(xì)胞或細(xì)胞片，從而刺激骨樣、肌肉樣、肌腱樣或韌帶樣細(xì)胞外基質(zhì)。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，對(duì)細(xì)胞片進(jìn)行進(jìn)一步的化學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物機(jī)械學(xué)和/或生物物理學(xué)方面的修飾和/或添加，使得所述修飾能調(diào)節(jié)細(xì)胞或細(xì)胞片的程度和活性。在制備細(xì)胞片的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，干細(xì)胞分離自組織，并且如果需要，保存于液氮中。當(dāng)需要形成細(xì)胞片時(shí)，將所述干細(xì)胞從液氮中解凍。接種細(xì)胞、在培養(yǎng)皿中擴(kuò)增，并使之生長(zhǎng)，直到匯合。然后，在培養(yǎng)基中用生物 因子處理細(xì)胞。在培養(yǎng)中，定期更換含有生物因子的培養(yǎng)基，直到形成細(xì)胞片。在本發(fā)明的另一方面，提供了本文所公開(kāi)的細(xì)胞片與任選的活性干細(xì)胞在增強(qiáng)組織修復(fù)中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在修復(fù)髕腱中窗樣損傷中的用途。髕腱的窗樣損傷是由于前交叉韌帶(ACL)重建中移除髕骨-髕腱-骨移植物而造成的。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，將細(xì)胞片用于增強(qiáng)髕腱中窗樣損傷的修復(fù)的方法中，所述方法包括卷起細(xì)胞片并縫合在窗樣缺損中的步驟?？梢酝ㄟ^(guò)將細(xì)胞片包裹在破裂位點(diǎn)周圍而將本發(fā)明的細(xì)胞片用于增強(qiáng)肌腱(例如跟腱、手部肌腱)和韌帶(例如后交叉韌帶PCL、ACL)的縫合修復(fù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞片用于促進(jìn)ACL重建中肌腱-骨連接的再生。因此，在促進(jìn)ACL重建中肌腱-骨連接的再生的方法中使用所述細(xì)胞片，與其它課題組使用骨膜自體移植物相似(Ohtera et al.，Crit Rev Biomed Eng 2000 ;28(1_2) :115-118 ；Youn et al. , Clin Orthop Relat Res2004 ；419 :223-231 ；Chen et al. , J Orthop SurgTaiwan 2003 ;20 :21-29)，所述方法包括用細(xì)胞片包裹肌腱移植物的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將細(xì)胞片縫合于肌腱和骨之間的界面而將細(xì)胞片用于肩袖修復(fù)中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將細(xì)胞片置于缺損中而將細(xì)胞片用于修復(fù)骨折、骨關(guān)節(jié)炎、骨軟骨缺損、肌肉撕裂、皮膚創(chuàng)傷或燒傷。在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了單獨(dú)的細(xì)胞片無(wú)細(xì)胞產(chǎn)物或所述無(wú)細(xì)胞產(chǎn)物與其它細(xì)胞類型或生長(zhǎng)因子的組合在促進(jìn)組織修復(fù)中的用途。脫細(xì)胞化后，將細(xì)胞片與上文所述相似地用作組織工程應(yīng)用的無(wú)細(xì)胞生物材料。當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)，將其用于防止修復(fù)缺口形成或修復(fù)失敗、增強(qiáng)宿主細(xì)胞粘附、滲透和增殖。脫細(xì)胞化產(chǎn)物形式的細(xì)胞片可以與其它已知的用于促進(jìn)組織修復(fù)的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞類型一起使用。本發(fā)明的另一方面涉及使用本文所公開(kāi)的細(xì)胞片來(lái)形成用于組織置換的生物人造器官。細(xì)胞片與生物材料、化學(xué)因子、生物因子、生物機(jī)械因子、生物物理因子在體外成熟和/或在動(dòng)物中、優(yōu)選在諸如裸鼠的免疫缺陷動(dòng)物中、或在與細(xì)胞片是自體同源的動(dòng)物中的體內(nèi)成熟形成了用于組織置換的生物人造器官。本發(fā)明的另一方面涉及修復(fù)骨折、骨關(guān)節(jié)炎、骨軟骨缺損、肌肉撕裂、皮膚創(chuàng)傷或燒傷的方法，包括將細(xì)胞片置于缺損中的步驟。實(shí)施例實(shí)施例I.細(xì)胞片的制備根據(jù)Rui et al. Tissue Eng Part A 2010 ；16(5) : 1549-1558 所述，從大鼠肌腱分離大鼠TDSC干細(xì)胞。將分離的TDSC在液氮中冷凍，直到使用。為了形成細(xì)胞片，使TDSC在塑料培養(yǎng)皿的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中擴(kuò)增，直到匯合。然后，在濕潤(rùn)的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在10-45°C、3-10% CO2的條件下，用配制在低葡萄糖達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(LG-DMEM) (Gibco)中的CTGF (5ng/ml-Iii g/ml)和抗壞血酸(5-100 y M)處理細(xì)胞1-6周，所述培養(yǎng)基還含有2-30%胎牛血清(FBS)、10-500U/ml青霉素、10-500 y g/ml鏈霉素和I-IOmM L-谷氨酰胺。每2-5天更換含有CTGF和抗壞血酸的培養(yǎng)基。參考圖7和圖12，在濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中，在37°C>5% CO2的條件下，用配制在含2% FBS的DMEM中的抗壞血酸(25 y M)和CTGF(25ng/ml)處理干細(xì)胞后，處理的細(xì)胞發(fā)生分化、產(chǎn)生豐富的細(xì)胞外基質(zhì)并且由此形成的細(xì)胞片是有彈性的。每3天更換含有CTGF和抗壞血酸的培養(yǎng)基。參考圖8和14，組織學(xué)和掃描電鏡分析表明包埋于自分泌的ECM中的細(xì)胞仍然是圓形的并且是隨機(jī)定向的。在第2周時(shí)，在由大鼠TDSC形成的細(xì)胞片的組織學(xué)檢查中觀察到細(xì)的膠原蛋白原纖維；在第4周時(shí)，在由人TDSC形成的細(xì)胞片的掃描電鏡檢查中觀察到細(xì)的膠原蛋白原纖維。參考圖8，在該條件下，與分離自大鼠肌腱的BMSC相比，TDSC形成的細(xì)胞片更好，其具有更多的ECM和縱向排列的原纖維。參考圖10和圖11，用CTGF和抗壞血酸處理大鼠TDSC能促進(jìn)細(xì)胞向肌腱形成譜系的分化，這可以由Tnmd，,Scx和CollAl的mRNA表達(dá)增加所證實(shí)，同時(shí)軟骨相關(guān)標(biāo)志物(Col2Al、Acan)和骨相關(guān)標(biāo)志物(Bglap)的mRNA表達(dá)降低。這符合在細(xì)胞片的形成過(guò)程中干細(xì)胞經(jīng)過(guò)處理而發(fā)生分化。然而，由于與BMSC相比，軟骨細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物(Col2Al，Acan)和骨相關(guān)標(biāo)志物(Bglap)的mRNA表達(dá)在處理后仍然較高，因此，通過(guò)用CTGF和抗壞血酸處理TDSC而形成的細(xì)胞片仍適用于其它組織修復(fù)，例如但不限于骨修復(fù)、肌腱-骨連接修復(fù)、軟骨修復(fù)、皮膚修復(fù)和肌肉修復(fù)。參考圖7B 和 14,在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，根據(jù) Rui et al. Tissue Eng Part A2010 ；16(5) :1549-1558 所述，從廢棄肌腱分離人TDSC，并且該人TDSC表現(xiàn)出與上文所示的大鼠TDSC相似的特性。參考圖13，經(jīng)CTGF和抗壞血酸處理4周而形成的人TDSC片含有90. 2± I. 4%的水和18.0±1.6% (干重)的sGAG。乙酸-胃蛋白酶可溶部分含有4.5±4.0% (干重)的總膠原蛋白，其中主要是I型膠原蛋白(5.4±4.8%干重)。僅有少量的III型膠原蛋白(8E-05±2. 5E-05%干重)，并且II型膠原蛋白的水平低于ELISA試劑盒的2ng/ml的檢測(cè)限參考圖14，經(jīng)CTGF和抗壞血酸處理4周而形成的人TDSC片合成膠原蛋白原纖維并將合成的膠原蛋白原纖維分泌到細(xì)胞外基質(zhì)。與正常的人的胭腱的膠原蛋白原纖維相t匕，人TDSC片合成的膠原蛋白原纖維組織較差并且較小(平均纖維直徑86. lnm±25. Inm相比于 141. 5 ±35. 5nm).實(shí)施例2.生物人造肌腱和韌帶的形成參考圖9，將用大鼠TDSC形成的細(xì)胞片卷起，并加載到U形彈性針上，形成生物人造肌腱和韌帶。參考圖15，在將由大鼠TDSC形成的細(xì)胞片移植并縫合到脊柱肌肉后，該細(xì)胞片進(jìn)一步成熟。在移植后第8周，細(xì)胞性比第6周時(shí)低，并且形成肌腱樣和韌帶樣組織。移植的細(xì)胞是活的、呈紡錘形、沿著加載軸縱向排列并且被包埋于平行的原纖維之間。在第8周，原纖維比移植前更厚，且表現(xiàn)出肌腱和韌帶的典型膠原蛋白雙折射。實(shí)施例3.組織修復(fù)在前交叉韌帶(ACL)重建中移除髕骨-髕腱-骨移植物后會(huì)產(chǎn)生髕腱中的窗樣損傷，通過(guò)將具有活性TDSC的細(xì)胞片卷起并縫合在窗樣缺損中，可以將細(xì)胞片用于增強(qiáng)髕腱中窗樣損傷的修復(fù)。參考圖16-19，將用處理的大鼠TDSC形成的細(xì)胞片縫合于髕骨窗形缺損促進(jìn)了肌腱愈合。在第2周，移植了細(xì)胞片的缺損中的一些細(xì)胞變得扁平。無(wú)細(xì)胞片的組中未觀察到該現(xiàn)象。在移植了細(xì)胞片的組中，觀察到更多ECM。ECM沿著肌腱縱向排列，并且表現(xiàn)出韌帶和肌腱的典型膠原蛋白雙折射。如離體熒光成像所示，在第2周時(shí)，移植的細(xì)胞片仍存在于窗樣缺損中。在第8周，在創(chuàng)傷中心和創(chuàng)傷邊緣，TDSC片組中創(chuàng)傷內(nèi)的細(xì)胞和膠原蛋白纖維比對(duì)照組排列地更好，并且膠原蛋白雙折射更高。與對(duì)照組相比，TDSC片組的創(chuàng)傷邊界比較模糊。在第2周和第8周時(shí)，TDSC片組的極限應(yīng)力和楊氏模量高于對(duì)照組。除了第8周時(shí)的楊氏模量之外，差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。實(shí)施例4.肌腱的縫合修復(fù)通過(guò)將本發(fā)明的細(xì)胞片包括在破裂位點(diǎn)周圍，可以將細(xì)胞片用于增強(qiáng)肌腱(例如跟腱、手部肌腱)和韌帶(例如后交叉韌帶PCL、ACL)的縫合修復(fù)。參考圖10和15，由TDSC形成的細(xì)胞片表現(xiàn)出高的肌腱形成活性和韌帶形成活性，并且適合于肌腱和韌帶修復(fù)。實(shí)施例5.骨折、骨關(guān)節(jié)炎、骨軟骨缺損、肌肉撕裂、皮膚創(chuàng)傷或燒傷的修復(fù)參考圖10和11，在用CTGF和抗壞血酸處理2周后，由TDSC形成的細(xì)胞片表達(dá)高水平的肌腱形成標(biāo)志物、軟骨形成標(biāo)志物和骨形成標(biāo)志物。這表明，本發(fā)明的細(xì)胞片可以用于修復(fù)骨折、骨關(guān)節(jié)炎、骨-軟骨缺損、肌肉撕裂、皮膚創(chuàng)傷或燒傷。本發(fā)明的細(xì)胞片(I)無(wú)需使用支架來(lái)遞送干細(xì)胞，并因此減少了通常由合成支架帶來(lái)的生物相容性、生物降解性和免疫原性問(wèn)題。 (2)天然ECM組合物和提供組織再生接觸指導(dǎo)的初級(jí)原纖維結(jié)構(gòu)的存在會(huì)提供適合存活、增殖和分化的必需的體內(nèi)樣環(huán)境因素，并且刺激干細(xì)胞的再生應(yīng)答。這是僅含有
1-2種基質(zhì)組分的合成和天然支架所無(wú)法比擬的。合成支架會(huì)帶來(lái)干細(xì)胞存活的氧和養(yǎng)分的運(yùn)輸問(wèn)題，而該問(wèn)題在本發(fā)明僅是有限的。(3)本發(fā)明的細(xì)胞片便于體內(nèi)細(xì)胞移植，并且為組織修復(fù)過(guò)程中承載早期機(jī)械負(fù)荷(例如復(fù)原)提供一定抗拉機(jī)械強(qiáng)度。其允許較早地進(jìn)行復(fù)原活動(dòng)，從而促進(jìn)損傷后的較早痊愈。(4)參考圖16-19，本發(fā)明的細(xì)胞片促進(jìn)組織愈合，并伴有更早的痊愈和更好的愈合質(zhì)量，并且參考圖15，形成了肌腱樣和韌帶樣組織。對(duì)本發(fā)明實(shí)施方案的以上描述的性質(zhì)僅是示例性的，因此，對(duì)實(shí)施方案做出的各種變化不應(yīng)認(rèn)為是偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1.來(lái)源于干細(xì)胞的細(xì)胞片，包含處理的干細(xì)胞和所述處理的干細(xì)胞自分泌的并包埋所述處理的干細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。
2.如權(quán)利要求I所述的細(xì)胞片，其中所述細(xì)胞片包含選自以下的化合物膠原蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白或以上的任意組合，優(yōu)選包含膠原蛋白、蛋白聚糖和糖蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞片，其中所述膠原蛋白選自I型膠原蛋白、III型膠原蛋白、II型膠原蛋白或以上的任意組合；所述蛋白聚糖(PG)選自聚集蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、二聚糖或以上的任意組合；所述糖蛋白選自彈性蛋白、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)、腱生蛋白C或以上的任意組合。
4.如權(quán)利要求2或3所述的細(xì)胞片，包含占所述細(xì)胞片干重的40-90%w/w的膠原蛋白、O. 5-30% w/w 的 PG 和 1-30% w/w 的糖蛋白。
5.如權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片，其中所述膠原蛋白包含占所述膠原蛋白總重量的70-98% w/w的I型膠原蛋白、1-15% w/w的III型膠原蛋白和1_5% w/w的II型月父原蛋白。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片，其中所述細(xì)胞片被進(jìn)一步脫細(xì)胞化而成為無(wú)細(xì)胞片。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片，其中所述干細(xì)胞是成體干細(xì)胞；或者其中所述干細(xì)胞分離自肌腱、骨髓、脂肪組織、牙髓或以上的任意組合。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片，其中所述干細(xì)胞分離自動(dòng)物組織或人類組織，或者其中所述干細(xì)胞是自體的或同種異體的。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片，其中對(duì)所述細(xì)胞片進(jìn)行進(jìn)一步的化學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物機(jī)械學(xué)和/或生物物理學(xué)方面的修飾和/或添加，使得所述修飾能調(diào)節(jié)所述細(xì)胞或細(xì)胞片的程度和活性。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片，其中所述細(xì)胞片包含直徑為5-500nm的膠原蛋白原纖維。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片，其中所述細(xì)胞片的極限應(yīng)力為1-10N/mm2 ο
12.制備權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述細(xì)胞片的方法，包括 (a)從新鮮組織獲得干細(xì)胞或從液氮中解凍干細(xì)胞； (b)擴(kuò)增所述干細(xì)胞并使所述細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合； (c)用生物因子或?qū)е滤黾?xì)胞片成熟或?qū)е庐a(chǎn)生生物因子的因子處理所述干細(xì)胞，從而在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化、產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)并形成細(xì)胞片，其中所述導(dǎo)致產(chǎn)生的生物因子包括用于處理干細(xì)胞的生物因子。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述生物因子包含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族(TGF)和抗壞血酸；和/或生長(zhǎng)分化因子/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(GDF/BMP)家族和抗壞血酸；和/或結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)和抗壞血酸。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述導(dǎo)致產(chǎn)生生物因子的因子是 誘導(dǎo)所述干細(xì)胞產(chǎn)生所述生物因子的化學(xué)試劑；和/或 誘導(dǎo)所述干細(xì)胞產(chǎn)生所述生物因子的生物試劑；和/或 誘導(dǎo)所述干細(xì)胞過(guò)表達(dá)所述生物因子的分子生物學(xué)手段；和/或誘導(dǎo)所述干細(xì)胞產(chǎn)生所述生物因子的體外機(jī)械負(fù)荷；和/或 誘導(dǎo)所述干細(xì)胞產(chǎn)生所述生物因子的生物物理學(xué)方法。
15.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片在組織修復(fù)中的用途。
16.如權(quán)利要求15所述的用途，其中需要修復(fù)的組織是患有疾病或處于疾病狀態(tài)的肌腱和韌帶、骨、軟骨、肌肉或皮膚。
17.如權(quán)利要求16所述的用途，其中所述肌腱和韌帶疾病狀態(tài)或疾病是肌腱破裂、韌帶破裂、ACL重建、肩袖損傷、肌腱病或前交叉韌帶(ACL)重建中移除髕骨-髕腱-骨移植物后而造成的髕腱的窗樣損傷；和/或 所述骨疾病狀態(tài)或疾病是骨折；和/或 所述軟骨疾病狀態(tài)或疾病是骨關(guān)節(jié)炎或骨-軟骨缺損；和/或 所述肌肉疾病狀態(tài)或疾病是肌肉撕裂；和/或 所述皮膚疾病狀態(tài)或疾病是創(chuàng)傷或燒傷。
18.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片在生物人造組織工程中的用途。
19.如權(quán)利要求18所述的用途，其中所述生物人造組織是肌腱/韌帶、皮膚、肌肉、骨或軟骨。
20.如權(quán)利要求18所述的用途，其中將所述細(xì)胞片卷起、用生物材料、化學(xué)因子、生物因子、遺傳因子、生物機(jī)械因子、生物物理因子處理所述細(xì)胞片和/或在裸鼠中體內(nèi)成熟，從而形成生物人造器官。
全文摘要
公開(kāi)了用于組織修復(fù)和生物人造組織工程的細(xì)胞片。所述細(xì)胞片包含處理的干細(xì)胞，所述干細(xì)胞被包埋其自分泌的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中并形成細(xì)胞片。所述細(xì)胞片通過(guò)以下過(guò)程形成分離干細(xì)胞，擴(kuò)增干細(xì)胞，并用生物因子或?qū)е律镆蜃赢a(chǎn)生的因子處理干細(xì)胞，從而在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化、產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)并形成細(xì)胞片。所述細(xì)胞片被用作促進(jìn)組織修復(fù)的生物活性材料或無(wú)細(xì)胞材料，或用于形成用于組織置換的生物人造器官。本發(fā)明的細(xì)胞片無(wú)需使用支架遞送細(xì)胞。所述細(xì)胞片促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞移植并提供一定的張力機(jī)械強(qiáng)度，用于承受組織修復(fù)過(guò)程中的早期機(jī)械負(fù)荷。
文檔編號(hào)A61L27/38GK102614546SQ20121002281
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月26日
發(fā)明者倪明, 呂寶儀, 芮云峰 申請(qǐng)人:香港中文大學(xué)