專利名稱：鑒定淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性的試劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物學和醫(yī)學應用領域，涉及一種存在于淋巴細胞來源腫瘤內的microRNA家族成員miR-182，主要涉及利用miRNA_182與淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性的相關性。
背景技術：
miRNA-182是2003年新發(fā)現(xiàn)的miRNA家族的一成員，目前有些文獻報道了其在某些癌癥中的功能和活性；新近研究發(fā)現(xiàn)其行使著抑癌基因的作用，其與DNA損傷修復相關、調控著細胞的凋亡和增殖，并可參與調節(jié)WNT信號途徑相關和P53信號途徑。但是，microRNA-182在淋巴細胞來源腫瘤發(fā)生發(fā)展與治療耐藥發(fā)生、預后判斷等，尚未有明確報道。糖皮質激素(GCs)是血液腫瘤化療方案中的一線用藥，而糖皮質激素耐藥則是化療失敗的主要原因，導致疾病的難治和復發(fā)。目前關于糖皮質激素耐藥機制的研究則是臨床亟待解決攻破的主要難題之一。糖皮質激素耐藥機制尚有一些最新文獻報道，如GR受體變異、糖酵解異常通路相關，但從RNA調控、蛋白翻譯水平上的機制探討尚無先例。并且，糖皮質激素的敏感性判斷尚未有快捷、簡易的手段。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供鑒定 淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性的microRNA。在本發(fā)明的第一方面，提供一種miRNA-182的用途，包括:用于作為鑒定淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性的標志物；或用于制備鑒定淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性的試劑；或用于制備增加淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性或逆轉淋巴細胞來源腫瘤對糖皮質激素的耐藥性的試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的miRNA-182還用于一些重要的自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、免疫性血小板減少性紫癜等疾病中對糖皮質激素敏感性判斷，亦或用于某些疾病預后評價的指標。在另一優(yōu)選例中，所述的淋巴細胞來源腫瘤選自但不限于:淋巴細胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。 在另一優(yōu)選例中，所述的糖皮質激素是地塞米松。在另一優(yōu)選例中，所述的鑒定淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性的試劑是特異性識別或擴增miRNA-182的試劑(如引物或探針)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種特異性識別或擴增miRNA-182的試劑的用途，用于制備鑒定淋巴細胞來源腫瘤(包括淋巴細胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等)糖皮質激素敏感性的試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒是(但不限于):PCR檢測試劑盒或原位雜交試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的特異性擴增miRNA-182的試劑是引物，所述的引物包括:SEQ ID NO:3所示的反轉錄引物，以及SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的檢測引物對；或所述的特異性識別miRNA-182的試劑是探針，所述的探針特異性識別和結合miRNA-182。在本發(fā)明的另一方面，提供一種miRNA-182的下調劑的用途，用于制備增加淋巴細胞來源腫瘤(包括淋巴細胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等)糖皮質激素敏感性或逆轉淋巴細胞來源腫瘤(包括淋巴細胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等)對糖皮質激素的耐藥性的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的miRNA-182的下調劑是miRNA-182的反義核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的反義核苷酸是miRNA-182-ASO。在本發(fā)明的另一方面，提供一種抑制淋巴細胞來源腫瘤(包括淋巴細胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等)的藥盒，其中包括:miRNA-182的下調劑；以及糖皮質激素。在另一優(yōu)選例中，所述的miRNA-182的下調劑是miRNA-182的反義核苷酸；或所述的糖皮質激素是地塞米松。

在另一優(yōu)選例中，所述的藥盒中，所述的miRNA-182的下調劑和/或糖皮質激素是
有效量的。在本發(fā)明的另一方面，提供一種篩選增加淋巴細胞來源腫瘤(包括淋巴細胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等)糖皮質激素敏感性或逆轉淋巴細胞來源腫瘤(包括淋巴細胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等)對糖皮質激素的耐藥性的藥物的方法，所述方法包括:(I)用候選物質處理表達miRNA-182的體系，所述候選物質是針對miRNA-182的核酸抑制物例如反義核苷酸；和(2)檢測所述體系中miRNA-182的表達情況；其中，若所述候選物質可降低miRNA-182的表達，則表明該候選物質是增加淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性的藥物(包括潛在藥物)。在一個優(yōu)選例中，步驟(I)包括:在測試組中，將候選物質加入到表達miRNA-182的體系中；和/或步驟⑵包括:檢測測試組的體系中miRNA-182的表達，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的表達miRNA-182的體系；如果測試組中miRNA-182的表達在統(tǒng)計學上低于(優(yōu)選顯著低于，如低20%以上，較佳的低50%以上；更佳的低80%以上)對照組，就表明該候選物是增加淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的核酸抑制物包括(但不限于):針對miRNA-182設計的干擾分子、核酸抑制物、結合分子(如抗體或配體)、小分子化合物。在另一優(yōu)選例中，所述的體系選自:細胞體系(或細胞培養(yǎng)物體系)、亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1A、人T淋巴細胞白血病細胞株CCRF-CEM中，Western Blot方法檢測總Fox03a蛋白(Total_Fox03a)與磷酸化Fox03a蛋白(p_Fox03a)的表達。Dex表示地塞米松。左圖為Western Blot結果，右圖為左圖結果以GAPDH標準化的定量結果。圖1B、人T淋巴細胞白血病細胞株HUT-78中，Western Blot方法檢測總Fox03a蛋白(Total_Fox03a)與磷酸化Fox03a蛋白(p_Fox03a)的表達。Dex表示地塞米松。左圖為Western Blot結果，右圖為左圖結果以GAPDH標準化的定量結果。圖1C、在T淋巴細胞白血病細胞株CCRF-CEM和HUT-78中，磷酸化Fox03a蛋白與總Fox03a蛋白的比例。圖2A、人T淋巴細胞白血病細胞株CCRF-CEM的轉染效率。圖2B、人T淋巴細胞白血病細胞株CCRF-CEM中，RT-PCR檢測miRNA-182在轉染后的表達量情況。 圖2C、人T淋巴細胞白血病細胞株CCRF-CEM中，轉染miRNA-182-mimics后Fox03a蛋白及磷酸化的Fox03a蛋白的表達情況。圖2D、人T淋巴細胞白血病細胞株CCRF-CEM中，轉染miRNA-182-mimics且在轉染24小時后加入地塞米松，F(xiàn)ox0·3a蛋白及磷酸化的Fox03a蛋白的表達情況。圖3A、人T淋巴細胞白血病細胞株CCRF-CEM中，轉染miRNA-182-mimics后，可拮抗DEX誘導的凋亡。圖3B、人T淋巴細胞白血病細胞株各設置組中，早期凋亡下調、晚期凋亡下調的情況。圖3C、通過Western blot檢測凋亡分子Bim的蛋白表達水平。圖4A、對糖皮質激素耐藥的細胞株HUT-78，轉染miRNA-182-ASO可增強細胞對DEX的敏感性。圖4B、細胞株HUT-78各設置組中，早期凋亡下調、晚期凋亡下調的情況。圖4C、通過Western blot檢測凋亡分子Bim的蛋白表達水平圖5A、用10 ii M的地塞米松處理Molt-4、Jurkat48，小時后凋亡檢測情況。圖5B、用藥(DEX)前后野生型原代脾細胞、SUP-B15細胞的凋亡情況。圖5C、人白血病細胞株Molt-4和Jurkat在不同濃度地塞米松作用下的凋亡率比較。圖用CCK-8檢測法對兩種細胞株的耐藥系數(shù)進行比較。圖6、抽取多種淋巴細胞來源的腫瘤細胞株(人源性細胞株SUP-B15、Jurkat,Molt-4、CCRF-CEM、HUT-78, Daudi (A)和鼠源性細胞株脾細胞、SP2/0、EL-4、L1210(B))的RNA,反轉錄成cDNA，用2_a ACt方法實時定量檢測miRNA-182的表達情況。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過長期的研究，意外地發(fā)現(xiàn)miRNA-182與淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性密切相關，其在糖皮質激素耐藥性的淋巴細胞來源腫瘤(細胞)中異常高表達?；诒景l(fā)明的揭示，所述的miRNA-182可用于作為鑒定淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性的標志物。miRNA-182的下調劑可用于增加淋巴細胞來源腫瘤對于糖皮質激素類藥物的敏感性，從而提高糖皮質激素類藥物的臨床療效。miRNA-182本發(fā)明中，所述的miRNA-182是具有SEQ ID NO:1所示核酸序列的小核糖核酸:UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU(SEQ ID NO:1)miRNA-182是為一種本領域已知的microRNA (miRNA)小分子，其對于調控RNA是有用的。然而，對于miRNA-182結合的靶點和其與糖皮質激素敏感性或糖代謝之間的關系目前并不清楚。miRNA-182可以在體內沉默F(xiàn)ox03a。Fox03a是一個50kD的轉錄因子，也稱為Scurf in、JM2、IPEX。它是一個主要調節(jié)基因，也是調節(jié)性T細胞的特異性標志。Fox03a也是一種在糖皮質誘導的淋巴細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用的核轉錄因子。miRNA-182可以被分離自細胞，或者可通過人工合成的方式獲得。在得知了miRNA-182或其前體的序列后，本領域人員可以方便地制備獲得miRNA-182或其前體。miRNA-182作為鑒定糖皮質激素敏感性的標志物本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，miRNA-182是一個新的、與糖皮質激素敏感性密切相關的藥物靶點，其通過調控與凋亡密切相關的分子Fox03a行使功能。針對miRNA-182的各種檢測試劑可以用于鑒定淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性；針對miRNA-182的治療手段可以作為提高細胞對糖皮質激素敏感性的新穎和有效的手段。如本文所用，所述的“淋巴細胞來源腫瘤”是指來源于淋巴細胞及其前體細胞的腫瘤，又稱為淋巴樣腫瘤。較佳地，所述的“淋巴細胞來源腫瘤”包括淋巴瘤、淋巴細胞白血病和骨髓瘤等。在外源性干預miR-182的實施例中:1)選擇轉染效率較高的細胞株CCRF-CEM，過表達miR-182，發(fā)現(xiàn)在淋巴細胞來源腫瘤中，miR-182可抑制總的Fox03a蛋白表達水平，不影響磷酸化的Fox03a蛋白表達水平，且隨著轉染劑量的增加，抑制效果越明顯。2)過表達miRNA-182，可抵抗糖皮質激素誘導的凋亡；在CCRF-CEM細胞株中，過表達miRNA-182，I μ M濃度地塞米松作用下，與空白對照相比，凋亡率被下調，凋亡分子Bim表達量較低。3)沉默miRNA-182，可增加淋巴細胞來源腫瘤細胞株對糖皮質激素誘導的凋亡；在HUT-78細胞株中，沉默miRNA-182，10 μ M濃度地塞米松作用下，凋亡率較空白對照上調，凋亡分子Bim表達量較高。在相關淋巴細胞來源腫瘤細胞株miR-182的檢測分析實施例中:1)用流式細胞術(FCM)行凋亡檢測，篩選和鑒定糖皮質激素敏感淋巴細胞來源腫瘤細胞株和糖皮質激素淋巴細胞來源腫瘤耐藥細胞株，以及用CCK-8法進行不同淋巴細胞來源腫瘤細胞株的糖皮質激素耐藥程度比較并歸類。2)檢測miR-182在不同糖皮質激素敏感性的細胞株的表達譜。結果發(fā)現(xiàn)，在糖皮質激素耐藥的細胞株中，miR-182表達量相對較高，明顯高于糖皮質激素敏感細胞株。表明miR-182的異常表達，可能與淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素的耐藥發(fā)生相關?；诒景l(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，可以將miRNA-182作為鑒定糖皮質激素敏感性的標志物:(i)進行淋巴細胞來源腫瘤的分型、鑒別診斷、和/或易感性分析；(ii)評估相關人群的淋巴細胞來源腫瘤治療藥物、藥 物療效、預后，以及選擇合適的治療方法；(iii)早期評估糖皮質激素類藥物的療效，優(yōu)化治療方案。比如，可分離出由miRNA-182基因表達異常相關的淋巴細胞來源腫瘤，從而可進行更有針對性的治療。因此，本發(fā)明提供了 miRNA-182的用途，用于制備鑒定淋巴細胞來源腫瘤的糖皮質激素敏感性的試劑或試劑盒?？刹捎酶鞣N本領域已知的技術來檢測細胞內miRNA-182的存在與否以及表達情況，這些技術均包含在本發(fā)明中。例如可用已有的技術如原位雜交發(fā)，聚合酶鏈式反應技術(PCR), Southern印跡法、DNA序列分析等,這些方法可結合使用。本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測miRNA-182的存在與否以及表達情況的試齊U。作為一種優(yōu)選方式，可以采用特異性擴增miRNA-182的引物；或特異性識別miRNA-182的探針來確定miRNA-182的存在與否。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的試劑是引物，其可特異性擴增出miRNA-182。更優(yōu)選的，所述的引物所述的引物包括:SEQ ID NO:3所示的反轉錄引物，以及SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示 的檢測引物對。該引物擴增獲得的擴增產(chǎn)物特異性高，對于復雜體系的擴增也具有良好的特異性。所述的特異性識別miRNA-182的試劑是探針，所述的探針特異性識別和結合miRNA-182。針對miRNA-182的特異性探針的設計是本領域人員熟知的技術，例如，制備一種探針，其可與miRNA-182上特定位點發(fā)生特異性結合，而不與miRNA-182以外的其它基因特異性結合，且所述探針帶有可檢測信號。目前，多種淋巴細胞來源腫瘤和一些重要的自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、免疫性血小板減少性紫癜等疾病中，糖皮質激素是不可或缺的重要用藥之一。miRNA182則可成為是糖皮質激素敏感性判斷的一個標準，可成為這些疾病預后判斷的指標。因此，本發(fā)明將miRNA-182作為診斷淋巴細胞來源腫瘤的標志物，具有較強的理論意義和臨床價值。本發(fā)明人在多種不同糖皮質激素敏感性的淋巴細胞來源腫瘤的miRNA-182表達譜中均發(fā)現(xiàn)了其與糖皮質激素敏感性程度相關的規(guī)律性。證明了 miRNA-182對于鑒定糖皮質激素敏感性的重要性，本發(fā)明具有檢測方便、有效、經(jīng)濟、安全、技術難度低等特點，進一步可以適用于判斷其它自身免疫性疾病以及作為預后評價的指標等。本發(fā)明提供了一種可以有效、經(jīng)濟、安全、技術難度低的檢測指標。檢測miRNA-182的試劑盒本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測miRNA-182的存在與否以及表達情況的試劑盒，該試劑盒包括:特異性識別或擴增miRNA-182的試劑。該試劑盒可用于鑒定淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性。作為一種優(yōu)選方式，所述的試劑盒是PCR檢測試劑盒，其中包括特異性擴增miRNA-182的引物。更佳地，所述的引物具有5’ CGGCGGTTTGGCAATGGTAGAACT 3’和5’ CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT3’ 所示的核苷酸序列。作為一種優(yōu)選方式，所述的試劑盒是:PCR檢測試劑盒或原位雜交試劑盒。其中包括特異性識別miRNA-182的探針，所述的探針具有5’_AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA_3’所示的核苷酸序列，且還具有可檢測信號。此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取DNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑，包括但不限于:抽提液、擴增液、雜交液、酶、對照液、顯色液、洗液等。
此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書和/或核酸序列分析軟件等。miRNA-182為靶點的藥物篩選在得知了 miRNA-182與糖皮質激素敏感性的密切相關性后，可以基于該特征來篩選抑制miRNA-182的物質。之后，可從所述的物質中找到對于提高細胞對糖皮質激素敏感性真正有用的藥物。因此，本發(fā)明提供一種篩選增加淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性(逆轉淋巴細胞來源腫瘤對糖皮質激素的耐藥性)的藥物的方法，所述的方法包括:用候選物質處理表達miRNA-182的體系；和檢測所述體系中miRNA-182的表達情況；其中，若所述候選物質可降低miRNA-182的表達，則表明該候選物質是增加淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性的藥物(包括潛在藥物)。所述的表達miRNA-182的體系例如可以是細胞(或細胞培養(yǎng)物)體系，所述的細胞可以是內源性表達miRNA-182的細胞；或可以是重組表達miRNA-182的細胞。所述的表達miRNA-182的體系還可以是亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系(如動物模型，優(yōu)選非人哺乳動物的動物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在進行篩選時，為了更易于觀察到miRNA-182的表達或活性的改變，還可設置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質的表達miRNA-182的體系。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括:對獲得的潛在物質進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以進一步選擇和確定對于提高糖皮質激素敏感性真正有用的物質?；趍iRNA-182的作用機理為:通過抑制Fox03a蛋白表達,進而發(fā)揮提高糖皮質激素敏感性的作用。因此還可以在篩選體系中表達Fox03a蛋白。從而，可通過進一步觀察所述體系中Fox03a蛋白的表達 情況來分析候選藥物的有效性。若Fox03a蛋白表達發(fā)生下調，則表明該候選物質是提高糖皮質激素敏感性的物質；或者，檢測所述體系中miRNA-182與Fox03a基因的相互作用(結合或互補)，若相互作用減弱，則表明該候選物質是提高糖皮質激素敏感性的物質。另一方面，本發(fā)明還提供了采用所述篩選方法獲得的提高糖皮質激素敏感性的物質。miRNA-182下調劑及其用途基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種miRNA-182下調劑的用途，用于制備提高糖皮質激素敏感性的藥物。如本文所用，所述的“miRNA-182下調劑”包括了核酸抑制物、拮抗劑、抑制劑、阻滯齊U、阻斷劑等，只要它們能夠下調miRNA-182或其前體的表達水平。它們可以是化合物、化學小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。所述的miRNA-182下調劑是指任何可阻止miRNA-182或其前體與其靶向序列結合、降低miRNA-182或其前體的活性、降低miRNA-182或其前體的穩(wěn)定性、下調miRNA-182或其前體的表達、減少miRNA-182或其前體有效作用時間的物質，這些物質均可用于本發(fā)明，作為對于下調miRNA-182有用的物質，從而可用于提高細胞對于糖皮質激素的敏感性。例如，所述的下調劑是:核酸抑制物，蛋白抑制劑，抗體，配體，核酸酶，核酸結合分子，只要其能夠下調miRNA-182的表達。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的下調劑是核酸抑制物。較佳地，所述的核酸抑制物通過阻止miRNA-182與其祀向序列結合,從而發(fā)揮作用。所述的核酸抑制物例如選自(但不限于):miRNA-182的反義核酸，miRNA-182的鎖核酸反義核酸；肽核酸；siRNA(沉默miRNA-182 前體)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的miRNA的抑制劑是miRNA-182的反義核酸。如本文所用，“反義核酸”又稱為“反義核酸”或“反義寡核苷酸(AS-ONs，AS0,AntiSense-Oligonucleotides) ”或“反義藥物”，是指長度約為15-30個堿基的DNA分子、RNA分子它們的經(jīng)修飾的形式或它們的類似物，可與mRNA互補。本領域人員均了解，根據(jù)本發(fā)明提供的反義核酸，可以進行適當?shù)淖兓⒈Ａ羝浠钚?，這些變化形式均可用于本發(fā)明。任何可起到抑制或沉默miRNA-182的作用的反義核酸都是可用于本發(fā)明的，其類型不限于DNA或是RNA。例如，所述的miRNA的反義核酸是與miRNA-182的序列基本上(較佳地為完全)互補的序列。例如，所述的miRNA-182的反義核酸與SEQ ID NO:1所示的序列或其互補序列具有80%以上的相同性，較佳地具有85%以上的相同性，更佳地具有90 %以上的相同性，最佳地具有95 %以上的相同性，如具有96 %、97%、98%或99%以上的相同性?，F(xiàn)有技術中已經(jīng)指出了一些反義核酸的變化形式是可取的，它們也可以針對相應的革巴序列發(fā)揮抑制作用。如 Improved targeting of miRNA with antisenseoligonucIeotides (2294-2304Nucleic `Acids Research, 2006, Vol.34，N0.8)文獻中提到，在反義核酸的兩個末端截短I個堿基是可以保留其活性的。又如Designand delivery of antisenseoligonucleotides to block microRNA function in culturedDrosophila and humancells (NATURE PROTOCOLS ；V0L.3 N0.10 ；2008 ;1537_1549)文獻綜述了多個研究，認為一般而言，在反義核酸的兩邊延長一些堿基是可以的。而在反義核酸和miRNA間親和性很高(如鎖核酸修飾)時，反義核酸可以被截短到約2/3長度。如本文所用，所述的“嚴格條件”是指:(I)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2XSSC，0.1% SDS,60°C ;或(2)雜交時加有變性劑，如50% (v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1% Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時才發(fā)生雜交。在本發(fā)明中，所述的“反義核酸”還包括經(jīng)修飾的反義核酸，所述的修飾基本不改變反義核酸的活性，更佳地，所述修飾可提高反義核酸的活性、穩(wěn)定性或治療效果。對反義核酸的修飾包括但不限于:鎖核酸修飾、甲氧基化修飾、肽核酸修飾、硫代修飾、磷酸骨架由磷脂連接骨架代替，這些修飾均是本領域技術人員易于實現(xiàn)的。優(yōu)選地，所述的修飾為鎖核酸修飾。藥盒本發(fā)明還提供了一種藥盒，它含有有效量的所述的miRNA-182的下調劑(較佳地其還與藥學上可接受的載體相混合)；以及有效量的糖皮質激素。所述miRNA-182的下調劑可用于提高糖皮質激素敏感性，從而它們聯(lián)合給藥可以降低細胞對于糖皮質激素的敏感性，提聞糖皮質激素的療效。糖皮質激素是一種激素，主要影響正常物質代謝過程，是維持機體自體穩(wěn)定的重要物質。地塞米松是糖皮質激素中的一種，具有抗炎、抗過敏、抗風濕、免疫抑制作用，主要用于治療嚴重細菌感染和嚴重過敏性疾病、各種血小板減少性紫癜、粒細胞減少癥、嚴重皮膚病、器官移植的免疫排斥反應、腫瘤治療及對糖皮質激素敏感的眼部炎癥等。如本文所用，所述“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。所述“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體:它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在藥物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質等。所述的載體中還可以含有細胞轉染試劑。所述的miRNA-182下調劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于:所述的miRNA-182下調劑的藥代動力學參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例1、地塞米松活性與Fox03a表達水平的相關性本發(fā)明人選取了人T淋巴細胞白血病細胞株CCRF-CEM (購自中國科學院上海生物化學與細胞研究所細胞庫，對地塞米松敏感)、HUT-78 (購自中國科學院上海生物化學與細胞研究所細胞庫，對地塞米松不敏感)，使用50nM地塞米松(Dex)預孵育這些腫瘤細胞株，48小時后收取細胞蛋白，應用特異性抗Fox03a蛋白的抗體(兔抗,購自Cell Signaling公司)與特異性抗磷酸化Fox03a蛋白的抗體(兔抗,購自Cell Signaling公司)，通過常規(guī)的Western Blot方法檢測總Fox03a蛋白與磷酸化Fox03a蛋白的表達。結果如圖1，對50nM地塞米松敏感的CCRF-CEM，用地塞米松處理后，總的Fox03a被明顯上調，磷酸化Fox03a表達被明顯下調,二者呈負相關(A、C);而對50nM地塞米松耐藥的HUT-78，總的Fox03a和磷酸化Fox03a 二者未發(fā)現(xiàn)明顯改變，沒有顯著的統(tǒng)計學差異(*P > 0.05) (B、C)。因此，在地塞米松發(fā)揮活性功能的過程中，F(xiàn)ox03a是不可或缺的參與者。并且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在不同的淋巴細胞來源腫瘤細胞株，上調Fox03a總蛋白表達量決定著細胞株本身對激素的敏感程度，改變Fox03a的總體表達水平與改變其磷酸化狀態(tài)，一樣很重要。實施例2、miRNA-182的功能與Fox03a相關選擇人T淋巴細胞白血病細胞株CCRF-CEM，其轉染效率可達84.57% (圖2A)。用INTERFERinTM向細胞內轉染miRNA-182-mimics，轉染量分別為20nM和50nM，72h后收集細胞，抽提細胞中的RNA，逆轉錄為cDNA，利用特異性檢測miRNA-182的引物通過RT-PCR檢測CCRF-CEM細胞miRNA-182的表達情況。設miRNA陰性對照(miRNA-N.C.)，選18S RNA作為內參。miRNA-182mimics、miRNA對照的序列以及RT-PCR引物如下:miRNA-182-mimics(圖中示為 miR-182 或 miR182)序列:正義:5’UUUGGCAAUGGUAGAACUCACA CU 3’ (SEQ ID NO:1)；反義:3’UGUGAGUUCUACCAUUGCCAAA UU 5’ ；miRNA-N.C.(NC mimics)序列:AGUGUGAGUUCUACCAUUGCCAAA(SEQ ID NO:2)。miRNA-182 引物:反轉錄(RT)引物:5’ GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTGTG3’ (SEQ ID NO:3)；檢測引物:正向:5’CGGCGGTTTGGCAATGGTAGAACT 3’ (SEQ ID NO:4);反向:5’ CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT 3’ (SEQ ID NO:5)；miRNA-N.C.
正向:5’UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 3’ (SEQ ID NO:6)；反向:5，ACGUGACACGUUCGGAGAATT3，(SEQ ID NO:7)；18S RNA:正向:5，GTAACCCGTTGAACCCCATT-3’(SEQ ID NO:8)；
·
反向:5’CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3’ (SEQ ID NO:9)。如圖2B所示，隨著miRNA-182轉染量的增加，miRNA-182表達量上調。本發(fā)明人將轉染miRNA-182 20nM和50nM，72h后收集細胞，Western blot檢測總Fox03a蛋白、磷酸化Fox03a蛋白的表達情況，選GAPDH作為內參。結果如由圖2C，可以看到，與NC相比，轉染miRNA-182后Fox03a蛋白表達量可下降，50nM的轉染量抑制效果最明顯，但磷酸化Fox03a蛋白未明顯改變；地塞米松組則在轉染24小時后加入，使藥物終濃度為I μ M (圖2D)，孵育48小時后收蛋白，與NC相比，轉染miRNA-182后Fox03a蛋白表達量可下降，50nM的轉染量抑制效果最明顯；但磷酸化Fox03a蛋白未見明顯改變。上述結果提示，在淋巴細胞來源腫瘤細胞株中，miRNA-182發(fā)揮著不容忽視的角色作用，它可通過調控與凋亡密切相關的分子Fox03a行使功能。實施例3、腫瘤內過表達miR182可拮抗地塞米松誘導的凋亡選擇用高轉染效率、對糖皮質激素敏感的細胞株CCRF-CEM，取對數(shù)生長期細胞，參照INTERFERin 24孔板轉染方案，分別轉染50nMmiRNA-182-mimics和NC-mimics，設立地塞米松組和無水乙醇組，對應每組有三個實驗復孔。在細胞轉染24小時后，分別加入地塞米松(DEX)和無水乙醇(ethanol)，孵育48小時后，收集細胞用流式細胞儀行凋亡檢測。結果發(fā)現(xiàn)，加入DEX的組，miRNA-182-mimics實驗孔細胞可拮抗DEX誘導的凋亡，早期凋亡和晚期凋亡均被下調(見圖3A)，與加入DEX的NC-minics實驗孔相比，早期凋亡下調5% ±1.04%，晚期凋亡下調7% ±0.91%，*Ρ、#Ρ均<0.05，差別具有統(tǒng)計學意義(見圖 3Β)。同時，本發(fā)明人收集細胞蛋白，通過Western blot檢測凋亡分子Bim的蛋白表達水平(見圖3C)，NC-mimics與miRNA-182-mimics無明顯差別；地塞米松孵育后，miRNA-182-mimics實驗孔凋亡蛋白Bim表達水平明顯被下調。可見，淋巴細胞來源的腫瘤內過表達miR182可拮抗地塞米松誘導的凋亡。實施例4、腫瘤細胞株中抑制miR-182增加細胞株對地塞米松的敏感性選擇用較高轉染效率、對糖皮質激素耐藥的細胞株HUT-78，取對數(shù)生長期細胞，參照INTERFERinTM 24孔板轉染方案，分別轉染50nMmiRNA-182_AS0 (購自Ambion公司)和NC-ASO (購自Ambion公司)，設立地塞米松組和無水乙醇組，對應每組有三個實驗復孔。在細胞轉染24小時后，分別加入地塞米松和無水乙醇，孵育48小時后，收集細胞用流式細胞儀行凋亡檢測。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，轉染miRNA-182-ASO可增強細胞對DEX的敏感性，早期凋亡和晚期凋亡均高于NC-ASO(見圖4A)，早期凋亡上調4% ±0.14%，晚期凋亡上調2% ±0.24%,*P、**P均< 0.05，差別具有統(tǒng)計學意義(見圖4B)。同時，本發(fā)明人收集細胞蛋白，通過Western blot檢測凋亡分子Bim的蛋白表達水平(見圖4C)，并用Multi Gauge掃描其灰度發(fā)現(xiàn)無水乙醇作用下，NC-ASO與miRNA-ASO無明顯差別，差別無統(tǒng)計學意義；地塞米松處理后，miRNA-ASO實驗孔凋亡蛋白表達水平明顯高于NC-ASO實驗孔(見圖4D)?？梢?，淋巴細胞來源的腫瘤細胞株中抑制miR-182可增加細胞株對地塞米松的敏感性。實施例5、淋巴細胞來源腫瘤激素耐藥的發(fā)生與細胞異常高表達miRNA-182密切相關分析多種淋巴細胞來源腫瘤細胞株的miRNA-182表達水平:Molt_4(購自中國科學院上海生物化學與細胞研究所細胞庫)、Jurkat(購自中國科學院上海生物化學與細胞研究所細胞庫)、CCRF-CEM、HUT-78、SUP-B15(購自中國科學院上海生物化學與細胞研究所細胞庫)、Daudi細胞(購自中國科學院上海生物化學與細胞研究所細胞庫)、以及野生型淋巴細胞脾細胞。抽取各淋巴細胞來源的腫瘤細胞株的RNA，反轉錄成cDNA，用2_Δ "ct方法實時定量檢測，發(fā)現(xiàn)miRNA-182在淋巴細胞來源腫瘤中的表達各異。定量檢測的引物是miRNA-182引物:RT 引物:5，GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTGTG 3，(SEQ IDNO:3)；正向:5，CGGCGGTTTGGCAATGGTAGAACT3，(SEQ ID NO:4)；反向:5，CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT3，(SEQ ID NO:5)；人源性細胞株中(見圖6A)糖皮質激素耐藥細胞株T淋巴細胞白血病細胞株Jurkat> Molt-4中miRNA-182的表達豐度較高,且Jurkat表達量明顯高于Molt_4,而糖皮質激素敏感細胞SUP-B15最低。鼠源性淋巴細胞中(見圖6B)，小鼠慢性淋巴細胞白血病細胞株L1210(購自中國科學院上海生物化學與細胞研究所細胞庫)中miRNA-182表達豐度最高，淋巴瘤細胞株EL-4 (購自中國科學院上海生物化學與細胞研究所細胞庫)僅次，骨髓瘤細胞SP2/0表達豐度相對較低，野生型細胞脾細胞表達量極低。

之后，本發(fā)明人驗證了多種瘤細胞株的耐藥性，如下:多種淋巴細胞來源腫瘤細胞株:Molt_4(購自中國科學院上海生物化學與細胞研究所細胞庫)、Jurkat (購自中國科學院上海生物化學與細胞研究所細胞庫)、CCRF-CEM、HUT-78、SUP-B15(購自中國科學院上海生物化學與細胞研究所細胞庫)以及野生型淋巴細胞脾細胞，分別給予不同濃度的地塞米松作用于細胞，采用凋亡檢測的方法，進行凋亡率比較。用10 μ M的地塞米松處理Molt-4、Jurkat, 48小時后行凋亡檢測(圖5A)，發(fā)現(xiàn)用地塞米松實驗組與用DMSO對照組相比，凋亡無明顯增加，Molt-4對照組與實驗組凋亡分別為 2.63% ±0.12%和 2.64% ±0.14%，Jurkat 用藥前后凋亡分別為 3.39% ±0.28%和3.40% ±0.34%，兩組差別無統(tǒng)計學意義。而用IOOnM的地塞米松處理野生型原代脾細胞8小時后，凋亡明顯發(fā)生，凋亡率達55.4% ±1.28% (地塞米松組)，與用藥前20.2%±0.28% (無水乙醇組)的凋亡率相比，差別顯著，具有統(tǒng)計學意義(圖5B);用IOOnM的地塞米松處理SUP-B15細胞36小時后行凋亡檢測，凋亡明顯發(fā)生，凋亡率達63.9%±1.08%，與非用地塞米松組10.1% ±0.98%的凋亡率相比，差別顯著，具有統(tǒng)計學意義(圖5B)?？梢奡UP-B15細胞、野生型原代脾細胞明顯對地塞米松敏感，而Molt-4、Jurkat明顯較之耐藥。同時，本發(fā)明人對比了人白血病細胞株Molt-4和Jurkat在不同濃度地塞米松作用下的凋亡率比較，橫坐標是不同濃度的地塞米松，縱坐標是凋亡率，由趨勢圖可見，Jurkat明顯比Molt-4耐藥(圖5C)。本發(fā)明人又用CCK-8法檢測，對兩種細胞株的耐藥系數(shù)相比，橫坐標為不同濃度的地塞米松，縱坐標表示細胞存活率，由趨勢圖走向比較明顯可見，CCRF-CEM明顯敏感于HUT-78 (圖 OT)。上述結果可見，淋巴細胞來源的腫瘤激素耐藥的發(fā)生與細胞異常高表達miRNA-182密切相關。通過檢測細胞內的miRNA-182可以準確地反映細胞對于地塞米松的敏感性情況。實施例6、臨床用藥指導獲得臨床淋巴細胞 來源腫瘤患者的腫瘤組織，分離出腫瘤細胞。常規(guī)方法培養(yǎng)，抽取各淋巴細胞來源腫瘤細胞 的RNA，反轉錄成cDNA，用2_δδμ方法實時定量檢測細胞內miRNA-182表達豐度，并以敏感性中等的Daudi細胞作為對照細胞。若檢測結果，miRNA-182表達豐度顯著高于Daudi細胞，則認為該腫瘤患者的腫瘤是糖皮質激素耐藥性的，不適用糖皮質激素類藥物的治療；若檢測結果miRNA-182表達豐度顯著低于Daudi細胞，則認為該腫瘤患者的腫瘤是糖皮質激素敏感性的，適用糖皮質激素類藥物治療。上述方法初步用于臨床20名患者，根據(jù)臨床醫(yī)師用藥效果跟蹤，發(fā)現(xiàn)該方法可較為準確地界定適用糖皮質激素類藥物治療的患者，準確率高于80%。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種miRNA-182的用途，包括: 用于作為鑒定淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性的標志物；或 用于制備鑒定淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性的試劑；或 用于制備增加淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性或逆轉淋巴細胞來源腫瘤對糖皮質激素的耐藥性的試劑。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的淋巴細胞來源腫瘤選自:淋巴細胞白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
3.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的糖皮質激素是地塞米松。
4.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的鑒定淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性的試劑是特異性識別或擴增miRNA-182的試劑。
5.一種特異性識別或擴增miRNA-182的試劑的用途，用于制備鑒定淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性的試劑盒。
6.如權利要求5所述的用途，其特征在于，所述的特異性擴增miRNA-182的試劑是引物，所述的引物包括:SEQ ID NO:3所示的反轉錄引物，以及SEQID NO:4和SEQ ID N0:5所示的檢測引物對；或 所述的特異性識別miRNA-182的試劑是探針，所述的探針特異性識別和結合miRNA-182。
7.—種miRNA-182的下調劑的用途，用于制備增加淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性或逆轉淋巴細胞來源腫瘤對糖皮質激素的耐藥性的藥物。
8.如權利要求7所述的用途，其特征在于，所述的miRNA-182的下調劑是miRNA-182的反義核苷酸。
9.一種抑制淋巴細胞來源腫瘤的藥盒，其中包括: miRNA-182的下調劑；以及 糖皮質激素。
10.如權利要求9所述的藥盒，其特征在于，所述的miRNA-182的下調劑是miRNA-182的反義核苷酸；或 所述的糖皮質激素是地塞米松。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性的試劑。本發(fā)明首次揭示miRNA-182與淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性密切相關，其在糖皮質激素耐藥性的淋巴細胞來源腫瘤中異常高表達。因此，所述的miRNA-182可用于作為鑒定淋巴細胞來源腫瘤糖皮質激素敏感性的標志物。miRNA-182的下調劑可用于增加淋巴細胞來源腫瘤對于糖皮質激素類藥物的敏感性，從而提高糖皮質激素類藥物的臨床療效。
文檔編號A61P35/00GK103243151SQ20121002672
公開日2013年8月14日 申請日期2012年2月7日 優(yōu)先權日2012年2月7日
發(fā)明者謝彥暉, 楊阿碰 申請人:謝彥暉