專利名稱：免疫原性組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含綴合到載體蛋白上的細(xì)菌莢膜糖，尤其是那些腦膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis)糖。其還涉及包含這樣的糖綴合物的疫苗和疫苗試劑盒、制備所述免疫原性組合物和疫苗的方法以及本發(fā)明疫苗和免疫原性組合物在治療中的用途。其還涉及使用糖綴合物抗感染的免疫方法以及糖綴合物在制備藥物方面的用途。
背景技術(shù)：
腦膜炎奈瑟氏球菌是革蘭氏陰性人感染性病原體，其能夠引起細(xì)菌性腦膜炎。以有機(jī)體的莢膜多糖為基礎(chǔ)，腦膜炎奈瑟氏球菌的十二個血清群已經(jīng)得到了鑒定(A，B, C，H， I，K，LJ9E，W135，X，Y和Z)。血清群A(MenA)是導(dǎo)致撒哈拉以南非洲地區(qū)的流行病的最常見原因。血清群B和C是導(dǎo)致發(fā)展中國家的大多數(shù)情況的原因，剩余的情況是由W135和Y 引起的。包含綴合到載體蛋白上的腦膜炎奈瑟氏球菌糖的免疫原性組合物是本領(lǐng)域已知的；載體蛋白具有將T細(xì)胞非依賴型多糖抗原轉(zhuǎn)化為能夠引發(fā)免疫記憶應(yīng)答的T細(xì)胞依賴型抗原的已知作用。例如WO 02/58737公開了一種含有純化的莢膜多糖的疫苗，所述純化的莢膜多糖來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y，并且是綴合到載體蛋白上的。然而，該申請教導(dǎo)所有的多糖必須基本上以同樣的方式(通過相同的連接基連接到相同的蛋白載體上)進(jìn)行綴合。仍存在對開發(fā)改善的抗奈瑟氏腦膜炎綴合疫苗的需要。本發(fā)明涉及提供一種腦膜炎球菌多糖綴合疫苗，其中可以設(shè)計(jì)每種多糖的綴合方式(而不是統(tǒng)一的)以獲得有效的組合疫苗。特別地，將某些腦膜炎球菌糖以高的糖蛋白比例綴合到它們的蛋白載體上而其它的糖以低比例綴合是有利的。

發(fā)明內(nèi)容
因此，在本發(fā)明的一個方面中提供了一種包含至少2種不同腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的免疫原性組合物，其中一種或多種所述糖選自由綴合到蛋白載體上的MenA、MenC、 MenY和MenW組成的第一組，其中糖蛋白的比例(w/w)在1 2_1 5之間，一種或多種不同的糖選自由綴合到蛋白載體上的MenA、MenC, MenY和MenW組成的第二組，其中糖蛋白的比例(w/w)在5 1-1 1.99之間。在MenW疫苗中，Men W糖與載體蛋白的比例可以在5 1-1 1. 99， 2:1-1: 1.99，1.5 1-1 1. 8，1 1-1 1. 7，1 1.2-1 1.6或1 1.4-1 1. 5(w/ w)之間。在MenY疫苗中，Men Y糖與載體蛋白的比例可以在5 1-1 1. 99，2:1-1: 1.99，1.5 1-1 1. 9，1 1-1 1. 8，1 1.1-1 1.6或1 1.3-1 1. 4(w/ w)之間。在MenA疫苗中，Men A糖與載體蛋白的比例可以在1 2_1 5,1 2.4-1 4， 1 2.7-1 3. 5 或 1 2.9-1 3. l(w/w)之間。在 Men C 疫苗中，Men C 糖與載體蛋白的比例可以在 5 1-1 1.99,2 1-1 1.99，1.5 1-1 1.8，1. 3 1-1 1.6， 1.2 1-1 1.4 或 1.1 1-1 1. 2(w/w)之間，或者在 1 2-1 5，1 2.5-1 4.5， 1 2. 7-1 4. 3，1 3-1 4 或 1 3.3-1 3.5(w/w)之間。綴合物中糖與載體蛋白的比例(w/w)是使用滅菌后的綴合物確定的。蛋白的量是使用 Lowry 試驗(yàn)(例如 Lowry 等人(1951) J. Biol. Chem. 193,265-275 或 Peterson 等人 Analytical Biochemistry 100,201-220(1979))確定的，糖的量對于 MenA 來說是使用 ICP-OES (感應(yīng)耦合等離子體發(fā)射光譜)確定的，對于MenC來說是使用DMAP試驗(yàn)確定的而對于MenW和MenY來說是使用間苯二酚試驗(yàn)(Resorcinol assay)確定的(Monsigny等人 (1988)Anal. Biochem. 175，525—530)。通過連接物綴合的糖通常比直接綴合到載體蛋白上時具有更高的載體蛋白結(jié)合。 例如，在本發(fā)明的MenAC疫苗中，MenA糖可以通過連接物綴合到載體蛋白上而MenC直接地綴合。在MenCY疫苗中，MenC可以通過連接物綴合而MenY直接地綴合。在MenACWY疫苗中，MenA可以通過連接物綴合而MenCWY直接地綴合，或者M(jìn)enAC可以通過連接物綴合而 MenffY直接地綴合。在本發(fā)明進(jìn)一步的方面中，提供了包含至少2種分別綴合到同類載體蛋白(例如DT，CRM 197，蛋白D或TT)上的不同糖的免疫原性組合物，其中一種或多種糖是在以 1:2-1: 5之間的糖蛋白比例(w/w)綴合到載體蛋白上的，一種或多種不同的糖是以在 5:1-1: 1.99之間的糖蛋白比例(w/w)綴合到蛋白載體上的。例如，在MenAC疫苗中，可以將MenA以在1 2_1 5之間的糖蛋白比例(w/ w)綴合到載體蛋白上，而將MenC以在5 1-1 1. 99之間的糖蛋白比例(w/w)綴合到蛋白載體上。在MenCY疫苗中，可以將MenC以在1 2_1 5之間的糖蛋白比例(w/w) 綴合到載體蛋白上，而將MenY以在5 1-1 1. 99之間的糖蛋白比例(w/w)綴合到蛋白載體上。在MenACWY疫苗中，可以將MenAC以在1 2_1 5之間的糖蛋白比例(w/w) 綴合到載體蛋白上，而將MenWY以在5 1-1 1.99之間的糖蛋白比例(w/w)綴合到蛋白載體上，或者可以將MenA以在1 2_1 5之間的糖蛋白比例(w/w)綴合到載體蛋白上，而將MenCWY以在5 1-1 1. 99之間的糖蛋白比例(w/w)綴合到蛋白載體上。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，提供了一種使人宿主對由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病具有免疫性的方法，其包括向宿主給藥以免疫保護(hù)劑量的本發(fā)明免疫原性組合物或疫
田ο根據(jù)本發(fā)明更進(jìn)一步的方面，提供了一種用于治療或預(yù)防由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的本發(fā)明免疫原性組合物。根據(jù)本發(fā)明更進(jìn)一步的方面，提供了本發(fā)明免疫原性組合物或疫苗在制備用于治療或預(yù)防由腦膜炎奈瑟氏球菌所引起的疾病的藥物方面的用途。


附圖描述
圖I-A-條形圖顯示了在抗-MenY ELISA中的GMC應(yīng)答。ENYTTO12是由天然MenY 多糖制備的MenY-TT綴合物。ENYTTO14是由微流化MenY多糖制備的MenY-TT綴合物，其中所述MenY多糖經(jīng)歷了 40個周期的微流化作用。ENYTTOMbis是由微流化MenY多糖制備的 MenY-TT綴合物，其中所述MenY多糖經(jīng)歷了 20個周期的微流化作用。-B-條形圖顯示了在抗-MenY SBA試驗(yàn)中的GMT應(yīng)答。ENYTTO12是由天然MenY 多糖制備的MenY-TT綴合物。ENYTTO14是由微流化MenY多糖制備的MenY-TT綴合物，其中所述MenY多糖經(jīng)歷了 40個周期的微流化作用。ENYTTOMbis是由微流化MenY多糖制備的 MenY-TT綴合物，其中所述MenY多糖經(jīng)歷了 20個周期的微流化作用。詳細(xì)描述本發(fā)明的一個方面提供了一種包含至少2種不同的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的免疫原性組合物，其中一種或多種所述糖選自由綴合到蛋白載體上的MenA(腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A莢膜糖),MenC (腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C莢膜糖),MenY (腦膜炎奈瑟氏球菌血清群Y莢膜糖)和MenW(腦膜炎奈瑟氏球菌血清群W135莢膜糖)組成的第一組，其中糖蛋白的比例(w/V)在1 2-1 5之間，一種或多種不同的糖選自由綴合到蛋白載體上的MenA、MenC、MenY和MenW組成的第二組，其中糖蛋白的比例(w/w)在5 1-1 1.99 之間。更具體地說是，所述組合物包含至少2種不同的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，其中一種或多種所述糖選自由綴合到蛋白載體上的MenA和MenC組成的第一組，其中糖蛋白的比例(w/w)在1 2-1 5之間，一種或多種不同的糖選自由綴合到蛋白載體上的MenC、 MenY和MenW組成的第二組，其中糖蛋白的比例(w/w)在5 1_1 1.99之間。在一個方面中，免疫原性組合物含有MenW糖，其中Men W糖與載體蛋白的比例在 5 1-1 1.99,2 1-1 1.99，1.5 1-1 1.8，1 1-1 1. 7，1 1.2-1 1.6 或1 1.4-1 1.5(w/w)之間。在進(jìn)一步的方面中，免疫原性組合物含有MenY糖，其中 Men Y 糖與載體蛋白的比例在 5 1-1 1.99,2 1-1 1.99,1.5 1-1 1.9， 1 1-1 1.8，1 1. 1-1 1.6 或 1 1.3-1 1. 4 (w/w)之間。在進(jìn)一步的方面中，免疫原性組合物含有MenA糖，其中Men A糖與載體蛋白的比例在1 2_1 5，1 2.4-1 4、 1 2.7-1 3. 5 或 1 2.9-1 3. 1 (w/w)之間或者在 5 1-1 1.99，2 1-1 1.99， 1.5 1-1 1.8,1.3 1-1 1.6,1.2 1-1 1.4 或 1. 1 1-1 1.2 (w/w)之間。 在進(jìn)一步的方面中，免疫原性組合物含有MenC糖，其中Men C糖與載體蛋白的比例在 5:1-1: 1.99,2 1-1 1.99，1.5 1-1 1.8，1. 3 1-1 1.6，1. 2 1-1 1.4 或 1.1 1-1 1. 2 (w/w)之間，或者在 1 2-1 5,1 2.5-1 4. 5，1 2.7-1 4.3， 1 3-1 4 或 1 3. 3-1 3.5(w/w)之間。更具體地說是，第一組可以由MenA和MenC組成，第二組由MenC、MenY和MenW組成。本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案是下述的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含=MenA 莢膜糖，其中Men A糖與載體蛋白的比例在1 2-1 5，1 2.4-1 4，1 2.7-1 3.5 或1 2.9-1 3.1(w/w)之間[其可以任選地通過連接物綴合到載體蛋白上]和 MenC莢膜糖，其中Men C糖與載體蛋白的比例在5 1-1 1.99,2 1-1 1.99， 1.5 1-1 1.8,1.3 1-1 1.6,1.2 1-1 1.4 或 1. 1 1-1 1.2 (w/w)之間 [其可以任選地直接綴合到載體蛋白上]；MenC莢膜糖，其中Men C糖與載體蛋白的比例在1 2-1 5,1 2.4-1 4，1 2.7-1 3. 5 或 1 2.9-1 3. 1 (w/w)之間[其可以任選地通過連接物綴合到載體蛋白上]和MenY莢膜糖，其中Men Y糖與載體蛋白的比例在 5:1-1: 1.99,2 1-1 1.99，1.5 1-1 1.8，1. 3 1-1 1.6，1. 2 1-1 1.4 或1.1 1-1 1.2(w/w)之間[其可以任選地直接綴合到載體蛋白上];MenA和MenC莢膜糖，其中Men A和C糖與載體蛋白的比例在1 2-1 5，1 2.4-1 4，1 2.7-1 3.5 或1 2.9-1 3. 1 (w/w)之間[其可以任選地通過連接物綴合到載體蛋白上]和MenY和 Men W莢膜糖，其中Men Y和W糖與載體蛋白的比例在5 1-1 1.99，2 1-1 1.99， 1.5 1-1 1.8,1.3 1-1 1.6,1.2 1-1 1.4 或 1. 1 1-1 1.2 (w/w)之間 [其可以任選地直接綴合到載體蛋白上]；MenA莢膜糖，其中Men A糖與載體蛋白的比例在 1 2-1 5,1 2.4-1 4，1 2. 7-1 3. 5 或 1 2.9-1 3. 1 (w/w)之間[其可以任選地通過連接物綴合到載體蛋白上]和MenC、MenY和Men W莢膜糖，其中Men Y和W和C糖與載體蛋白的比例在 5 1-1 1. 99,2 1-1 1.99，1.5 1-1 1. 8，1. 3 1-1 1.6， 1.2 1-1 1.4或1.1 1-1 1.2 (w/w)之間[其可以任選地直接綴合到載體蛋白上]。 在這些實(shí)施方案的任何一種中，還可以包含Hib綴合物，其直接地或通過連接物連接到載體蛋白(參見上文或下文中的載體列表，例如TT，和糖蛋白的比例)上。在整個本說明書中，術(shù)語“糖”可以表示多糖或低聚糖，或者兩者都包含。多糖是從細(xì)菌中分離出來的，或者是從細(xì)菌中分離出來并通過已知方法(參見例如EP4975M和 EP497525)以及任選地通過微流化作用將尺寸調(diào)整到某一程度的?？梢哉{(diào)整多糖的尺寸從而減少多糖樣品的粘度和/或改善綴合產(chǎn)品的過濾性。低聚糖的重復(fù)單元數(shù)少(一般地具有5-30個重復(fù)單元)，其一般是水解的多糖。各腦膜炎奈瑟氏球菌(和/或Hib)莢膜糖可以綴合到獨(dú)立地選自TT、DT、CRM197、 TT的C片段和蛋白D的載體蛋白上?？捎糜诒景l(fā)明綴合物的蛋白載體的更加全面的列表呈現(xiàn)于下文中。雖然可以將一種或多種腦膜炎奈瑟氏球菌(和/或Hib)莢膜糖綴合到與其它糖不同的載體蛋白上，但是在一個實(shí)施方案中它們是全部綴合到相同的載體蛋白上的。 例如可以將它們?nèi)烤Y合到相同的選自TT、DT、CRM 197,TT的C片段和蛋白D的載體蛋白上。由于CRM197與DT的區(qū)別僅在于一個氨基酸，因此在本文的上下文中認(rèn)為它們是相同的載體蛋白。在一個實(shí)施方案中，將存在的所有腦膜炎奈瑟氏球菌(和/或Hib)莢膜糖都綴合到TT上。如果組合物中2種或2種以上糖的蛋白載體是相同的，則可以將所述糖綴合到蛋白載體的相同分子上(有2種以上的不同的糖綴合在載體分子上)[參見例如 W004/083251 ；例如可以向單一的載體蛋白上綴合MenA和MenC ；MenA和MenW ；MenA和 MenY ；MenC 禾口 MenW ；MenC 禾口 MenY ；Men W 和 MenY ；MenA、MenC 禾口 MenW ；MenA、MenC 禾口 MenY ； MenA、MenW 禾口 MenY ；MenC、MenW 禾口 MenY ；MenA、MenC、MenW 禾口 MenY ；Hib 禾口 MenA ；Hib 禾口 MenC ； Hib和MenW;或Hib和MenY]?；蛘呖梢詫⒏魈欠謩e綴合到蛋白載體的不同分子上(蛋白載體的每種分子僅有一類糖綴合在其上面)。本申請第一方面的免疫原性組合物還可以具有本發(fā)明第二方面的任意或全部附加特征，反之亦然。本發(fā)明的第二方面提供了一種包含至少2種分別綴合到同類載體蛋白上的不同糖的免疫原性組合物，其中一種或多種糖是以在1 2-1 5之間[高比例]的糖蛋白比例(w/V)綴合到載體蛋白上的，一種或多種不同的糖是以在5 1-1 1.99之間[低比例]的糖蛋白比例(w/V)綴合到蛋白載體上的?！胺謩e綴合到同類載體蛋白上”的意思是指將糖各自地綴合到相同的載體上(即， 不同的糖不是綴合到相同蛋白載體的相同分子上的)。莢膜糖可以是綴合到同類載體蛋白上，所述載體蛋白獨(dú)立地選自TT、DT、CRM 197、 TT的C片段和蛋白D。下文中給出了可用于本發(fā)明綴合物中的蛋白載體的更全面的列表。 由于CRM 197和DT的區(qū)別僅在于一個氨基酸，所以在本文的上下文中認(rèn)為它們是相同的載體蛋白。在一個實(shí)施方案中，存在的所有莢膜糖都是綴合到TT上的。高比例(1 2-1 5)和低比例(5 1-1 1.99)的糖可以選自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A莢膜糖(MenA)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C莢膜糖(MenC)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群Y莢膜糖(MenY)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群W莢膜糖(MenW)、b型流感嗜血桿菌 (H. influenzae)莢膜糖(Hib)、B群鏈球菌(Mi^ptococcus) I群莢膜糖、B群鏈球菌II群莢膜糖、B群鏈球菌III群莢膜糖、B群鏈球菌IV群莢膜糖、B群鏈球菌V群莢膜糖、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus) 5型莢膜糖、金黃色葡萄球菌8型莢膜糖、來自傷寒殺門氏菌(Salmonella typhi)的Vi糖、腦膜炎奈瑟氏球菌LPS (例如L3和/或L2)、卡他莫拉菌(M. catarrhaliS)LPS、流感嗜血桿菌LPS和來自任意莢膜肺炎球菌糖的糖例如來自血清型:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 或33F。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物是由來自同屬細(xì)菌(例如，奈瑟氏球菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬或嗜血桿菌屬)的兩種或兩種以上的不同的糖組成的，或者包含來自同屬細(xì)菌的兩種或兩種以上的不同的糖。在一個實(shí)施方案中，MenA是高比例的糖；在另一個中Men W是低比例的糖；在另一個中MenY是低比例的糖；在另一個中MenC是高比例的糖；在另一個中MenC是低比例的糖； 在另一個中Hib是高比例的糖。包含MenA/C的疫苗可以分別是高/低比例，包含MenC/Y 的疫苗可以分別是高/低比例，包含MenA/C/W/Y的疫苗可以分別是高/高/低/低比例， 而包含MenA/C/W/Y的疫苗可以分別是高/低/低/低比例。本發(fā)明各方面的概述將包含在本發(fā)明藥物(免疫)組合物中的本發(fā)明的糖(特別是腦膜炎奈瑟氏球菌糖和/或Hib莢膜糖)是綴合到載體蛋白上的，所述載體蛋白例如是破傷風(fēng)類毒素(TT)、破傷風(fēng)類毒素片段C、破傷風(fēng)類毒素的無毒突變株[注意，為了本發(fā)明的目的，所有這樣的TT 變形株均被認(rèn)為是同一類載體蛋白]、白喉類毒素(DT)、CRM197、白喉類毒素的其它無毒突變株[例如 RM176、CRM 197、CRM228、CRM 45 (Uchida 等人，J. Biol. Chem. 218 ；3838-3844， 1973) ；CRM 9,CRM 45、CRM102、CRM103 和 CRM 107 以及 Nicholls 和 Youle 在 Genetically Engineered Toxins,Ed =Frankel,Maecel Dekker Inc. 1992 中描述的其它突變株；Glu—148 到Asp的缺失或突變、Gin或Ser和/或Ala 158到Gly的突變以及US4709017或US 4950740中公開的其它突變；殘基Lys 516、Lys 526、Phe530和/或Lys 534中的至少一或多種的突變以及US 5917017或US6455673中公開的其它突變；或US 5843711中公開的片段](注意，為了本發(fā)明的目的，所有這樣的DT變形株均被認(rèn)為是同一類載體蛋白)、肺炎球菌的肺炎球菌溶血素(Kuo等人(1995nnfect Immun 63 ;2706_13)、OMPC(腦膜炎球菌的外膜蛋白-通常提取自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B-EP0372501)、合成肽(EP0378881，EP0427347)、熱休克蛋白(W093/17712，WO 94/03208)、百日咳蛋白(W0 98/58668， EP0471177)、細(xì)胞因子、淋巴因子、生長因子或激素(W0 91/01146)、包含多個人類⑶4+T細(xì)胞抗原表位的人工蛋白，其中所述人工蛋白來自由抗原衍生的多種病原體O^alugi等人 (2001) Eur J Immunol 31 ；3816-3824)例如附9 蛋白(Baraldoi 等人(2004) Infect Immun 72 ；4884-7)肺炎球菌表面蛋白I3SpA(W) 02/091998)、鐵吸收蛋白(W0 01/72337)、難辨梭狀芽孢桿菌毒素A或B(W0 00/61761)或蛋白D(EP594610和W000/56360)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物在其所含有的至少兩種、三種、四種或每種糖(例如腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖和/或Hib)中(獨(dú)立地)使用了同一類型的載體蛋白。在一個含有Hib和腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的實(shí)施方案中，可以將Hib綴合到與至少兩種、三種、四種或每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖所綴合的載體蛋白相同類型的載體蛋白上。 例如，將2、3、或4種腦膜炎奈瑟氏球菌糖(MenA、C、Y、W)獨(dú)立地綴合到破傷風(fēng)類毒素上以制備2、3或4綴合物，并且任選地將Hib也綴合到TT上。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含綴合到選自TT、DT、CRM197、TT 的C片段和蛋白D的載體蛋白上的腦膜炎奈瑟氏球菌糖。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含綴合到選自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D的載體蛋白上的Hib糖。本發(fā)明的免疫原性組合物任選地包含至少一種腦膜炎球菌糖(例如，MenA ；MenC ； Menff ；MenY ；MenA 和 MenC ；MenA 和 Menff ；MenA 和 MenY ；MenC 和 Men W ；Men C 和 MenY ；Men W 和 Men Y ；MenA、MenC 禾口 MenW ；MenA、MenC 禾口 Men Y ；MenA^Menff 禾口 MenY ；MenC^Menff 禾口 MenY 或MenA、MenC, Menff和MenY)綴合物，所述綴合物的Men糖與載體蛋白的比例在1 5至 5 1，1 2至 5 1，1 0.5至1 2. 5 或 1 1. 25 至 1 2.5(w/w)之間。本發(fā)明免疫原性組合物任選地包含Hib糖綴合物，所述綴合物的Hib與載體蛋白的比例在1 :5至5: 1;1:2至2: 1 ；1 1至1:4;1:2至1: 3. 5之間；或者在 1 2. 5或1 3左右，或剛好為1 2. 5或1 3 (w/w)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明免疫原性組合物所包含的腦膜炎奈瑟氏球菌糖和/或 Hib糖綴合物是通過連接物，例如雙官能連接物，綴合到載體蛋白上的。連接物任選地是異雙官能的或同雙官能的，其具有例如反應(yīng)性氨基基團(tuán)和反應(yīng)性羧酸基團(tuán)、2個反應(yīng)性氨基基團(tuán)或者兩個反應(yīng)性羧酸基團(tuán)。連接物具有例如4到20，4到12，5到10個碳原子?？赡艿倪B接物是ADH。其它連接物包括B-丙酰胺基(W0 00/10599)、硝基苯-乙胺(Gever等人(1979)Med. Microbiol. Immunol. 165 ；171-288)、鹵代燒基鹵化物(US4057685)、糖苷鍵 (US4673574, US4808700)、己二胺和 6-氨基己酸(US4459286)。存在于本發(fā)明免疫原性組合物中的糖綴合物可以通過任何已知的偶聯(lián)技術(shù)制備。 綴合方法可以借助用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)使糖活化以形成氰酸酯。這樣，活化的糖就可以直接地或通過間隔(連接)基團(tuán)被偶合到載體蛋白的氨基上。例如，間隔物可以是胱胺或半胱胺以提供硫醇化糖，所述硫醇化糖能夠通過硫醚鍵偶合到載體上，所述硫醚鍵是在與馬來酰亞胺-活化載體蛋白(例如使用GMBQ或鹵代乙?；d體蛋白(例如使用碘代乙酰亞胺或溴乙酸N-琥珀酰亞胺酯)反應(yīng)后獲得的。任選地，將氰酸酯(任選地是通過CDPA化學(xué)制得的)與己二胺或ADH偶合，并將氨基-衍生化的糖用碳二亞胺(例如EDAC或EDC)化學(xué)通過蛋白載體上的羧基綴合到載體蛋白上。這樣的綴合物描述于 PCT 公開申請 WO 93/15760 Uniformed Services University 和 WO 96/08348 和 WO96/29094 中。其它合適的技術(shù)使用了碳二亞胺、酰胼、活性酯、降冰片烷、對-硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。許多描述于WO 98/42721中。綴合可以使用羰基連接物，其可以通過使糖的游離羥基基團(tuán)與CDI反應(yīng)(Bethell等人J. Biol. Chem. 1979,254 ； 2572-4，Hearn等人J. Chromatogr. 1981. 218 ；509-18)后接著與蛋白反應(yīng)以形成氨基甲酸酯連接而形成。其可以包括將異頭端基還原為伯羥基；任選地進(jìn)行伯羥基基團(tuán)的保護(hù)/脫保護(hù)反應(yīng)，所述反應(yīng)為使伯羥基與CDI反應(yīng)以形成氨基甲酸CDI酯中間體以及使氨基甲酸 CDI酯中間體與蛋白上的氨基偶合。綴合物也可以如US 4365170 (Jennings)和 US 467；3574 (Anderson)中所描述的那樣通過直接還原氨化的方法來制備。其它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和 EP-0-477508 中。進(jìn)一步的方法包括將溴化氰(或CDAP)活化的糖通過碳二亞胺縮合作用(Chu C.等人hfect. Immunity, 1983M5256)，例如使用EDAC，偶合到蛋白載體上，其中所述糖是用己二酸二酰胼(ADH)衍生化的。在一個實(shí)施方案中，將糖上的羥基(任選地為活化的羥基，例如用氰酸酯活化的羥基)直接地或間接地(通過連接物)連接到蛋白上的氨基或羧基上。當(dāng)存在連接物時，將糖上的羥基任選地連接到連接物上的氨基上，例如通過使用CDAP綴合。可以將連接物(例如ADH)中的其它氨基基團(tuán)綴合到蛋白上的羧酸基團(tuán)上，例如通過使用碳二亞胺化學(xué)，例如通過使用EDAC。在一個實(shí)施方案中，在將連接物綴合到載體蛋白上之前，先將Hib或腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖(或通常所說的糖)綴合到第一連接物上?；蛘咴诰Y合到糖上之前，可以先將連接物綴合到載體上。通常，蛋白載體上可以用于偶合/綴合的化合物基團(tuán)的類型如下A)羧基(例如通過天冬氨酸或谷氨酸)。在一個實(shí)施方案中該基團(tuán)被直接連接到糖上的氨基基團(tuán)上，或者用碳二亞氨化學(xué)例如用EDAC連接到連接物上的氨基基團(tuán)上。B)氨基(例如通過賴氨酸)。在一個實(shí)施方案中該基團(tuán)被直接連接到糖上的羧基基團(tuán)上，或者用碳二亞氨化學(xué)例如用EDAC連接到連接物上的羧基基團(tuán)上。在一個實(shí)施方案中該基團(tuán)被直接連接到糖上的用CDAP或CNBr活化的羥基上，或者連接到連接物上的這樣的基團(tuán)上；連接到具有醛基的糖或連接物上；連接到具有琥珀酰亞胺酯基的糖或連接物上。C)巰基(例如通過半胱氨酸)。在一個實(shí)施方案中將該基團(tuán)連接到溴或氯乙?；奶巧?，或者用馬來酰亞胺化學(xué)連接到連接物上。在一個實(shí)施方案中該基團(tuán)是用雙二重氮聯(lián)苯胺(bis diazobenzidine)活化/改性的。D)羥基(例如通過酪氨酸)。在一個實(shí)施方案中該基團(tuán)是用雙二重氮聯(lián)苯胺活化 /改性的。E)咪唑基(例如通過組氨酸)。在一個實(shí)施方案中該基團(tuán)是用雙二重氮聯(lián)苯胺活化/改性的。F)胍基(例如通過精氨酸)。
G)吲哚基(例如通過色氨酸)。 在糖上，能夠用于偶合的通常是以下基團(tuán)0H、COOH或NH2。醛基能夠在本領(lǐng)域已知的不同處理后產(chǎn)生，所述處理例如用高碘酸鹽、酸解、過氧化氫等。直接偶合法糖-OH+CNBr或 CDAP----->氰酸酯 +NH2_Prot—— >綴合物糖-醛+NH2-Prot-— > 西佛堿 +NaCNBH3----->綴合物糖-C00H+NH2_Prot+EDAC----->綴合物糖-NH2+C00H_Pr。t+EDAC----->綴合物通過間隔物(連接物)的間接偶合法糖-OH+ CNBr 或 CDAP-----> 氰酸酉旨 +NH2----NH2----->
糖——NH2+C00H-Prot+EDAC------>綴合物糖-OH+CNBr或 CDAP—— >氰酸酯 +NH2——SH----->糖-----SH+SH-Prot (具
有暴露的半胱氨酸的天然蛋白或是通過例如SPDP將蛋白的氨基改性后獲得的)——> 糖-S-S-Prot 糖-OH+CNBr或CDAP----->氰酸酯+NH2——SH----->糖——SH+馬來酰亞
胺-Prot (氨基的改性物)------>綴合物糖-C00H+EDAC+NH2——NH2----->糖——NH2+EDAC+C00H-Prot----->綴合物糖-C00H+EDAC+NH2——SH----->糖-----SH+SH-Prot (具有暴露的半胱氨酸的
天然蛋白或是通過例如SPDP將蛋白的氨基改性后獲得的)—— > 糖-S-S-Prot糖-C00H+EDAC+NH2——SH----->糖——SH+馬來酰亞胺-Prot (氨基的改性
物)------>綴合物糖-醛+NH2——NH2----->糖——NH2+EDAC+C00H-Prot----->綴合物注意除了以上的EDAC，還可以使用任何合適的碳ニ亞胺?？傊?，通?？梢杂糜谂c糖偶合的蛋白載體化學(xué)基團(tuán)的類型是氨基(例如賴氨酸殘 基上的)、C00H基團(tuán)(例如天冬氨酸和谷氨酸殘基上的)和SH基團(tuán)(如果能夠獲得的話) (例如半胱氨酸殘基上的)。在一個實(shí)施方案中，將Hib糖，當(dāng)存在吋，用CNBr、或CDAP、或CDAP與碳ニ亞胺化 學(xué)(例如EDAC)的結(jié)合、或CNBr與碳ニ亞胺化學(xué)(例如EDAC)的結(jié)合來綴合到載體蛋白 上。任選地Hib是用CNBr和碳ニ亞胺化學(xué)綴合的，其中所述碳ニ亞胺化學(xué)任選地為EDAC。 例如，用CNBr連接糖和連接物，接著用碳ニ亞胺化學(xué)連接連接物和蛋白載體。在一個實(shí)施方案中，腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖(或通常所說的糖)中的至少ー種 是直接綴合到載體蛋白上的；任選地將MenW和/或MenY和/或MenC糖直接綴合到載體蛋 白上。例如將 MenW ；MenY ；MenC ；MenW禾ロ MenY ；MenW 禾ロ MenC ；MenY 禾ロ MenC ；或 MenW、MenY 禾ロ MenC直接連接到載體蛋白上。任選地，腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖中的至少ー種是通過CDAP 直接綴合的。例如將 Menff ；MenY ；MenC ；Menff 禾ロ MenY ；Menff 禾ロ MenC ；MenY 禾ロ MenC ；或 Menff, MenY和MenC通過CDAP直接連接到載體蛋白上(參見WO 95/08348和WO 96/29094)。在 一個實(shí)施方案中，將所有的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖均綴合到破傷風(fēng)類毒素上。任選地，MenW和/或Y糖與載體蛋白的比例在1 0. 5到1 2(w/w)之間，和/ 或MenC糖與載體蛋白的比例在1 0. 5到1 4或1 0. 5到1 1. 5 (w/w)之間，尤其 是當(dāng)這些糖是直接連接到所述蛋白上的吋，其中所述連接任選地使用了 CDAP。在一個實(shí)施方案中，腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖(或通常所說的糖)中的至少ー種是通過連接物，例如雙官能連接物，綴合到載體蛋白上的。所述連接物任選地是異雙官能的或是同雙官能的，其具有例如反應(yīng)性氨基基團(tuán)和反應(yīng)性羧酸基團(tuán)、2個反應(yīng)性氨基基團(tuán)或者 2個反應(yīng)性羧酸基團(tuán)。連接物具有例如4到20，4到12，5到10個碳原子?？赡艿倪B接物是 ADH。在一個實(shí)施方案中，MenA ；MenC ；或MenA和MenC是通過連接物綴合到載體蛋白 (例如破傷風(fēng)類毒素)上的。在一個實(shí)施方案中，至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌糖是通過連接物使用CDAP和 EDAC綴合到載體蛋白上的。例如，如上所述地將MenA ；MenC ；或MenA和MenC通過連接物 (例如那些在其端基上具有兩個胼基的連接物如ADH)用CDAP和EDAC綴合到蛋白上。例如， 用CDAP將糖綴合到連接物上，用EDAC將連接物綴合到蛋白上。任選地，對于MenA ；MenC ；或 MenA和MenC來說，通過連接物的綴合導(dǎo)致糖與載體蛋白的比例在1 0. 5到1 6 ;1 1 到1 5或1 2到1 4之間。對于含有綴合到相同載體上的多種糖的組合疫苗來說，一個值得考慮的問題是載體的免疫抑制作用可能使用了太多的載體從而可能抑制了免疫應(yīng)答。用統(tǒng)一的方法綴合載體將向免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)相似的B-和T-細(xì)胞抗原表位的混合。然而，如果一種糖和另一種糖的綴合發(fā)生在載體蛋白內(nèi)不同化學(xué)基團(tuán)上，則蛋白載體在怎樣將它們自身呈現(xiàn)給免疫系統(tǒng)方面可能會有某種程度的不同。因此，對于本發(fā)明的所有方面來說，本文中還提供了包含至少2種分別綴合到同類載體蛋白(例如破傷風(fēng)類毒素)上的不同糖的免疫原型組合物，其中一種或多種糖是通過蛋白載體上的第一類化學(xué)基團(tuán)綴合到載體蛋白上的，一種或多種糖是通過蛋白載體上的第二類(不同的)化學(xué)基團(tuán)綴合到載體蛋白上的。第一和第二類化學(xué)基團(tuán)可以存在于蛋白載體中在蛋白載體的相互排斥的第一和第二系列氨基酸(例如一個系列中的某些天冬氨酸/谷胺酸殘基和第二系列中的某些賴氨酸/精氨酸殘基)上。例如可以將一種糖綴合到載體上的羧基上，將另一種綴合到氨基上。 這樣的綴合可以包括每種不同綴合物的在單獨(dú)的B-和/或T-細(xì)胞抗原表位上的綴合例如在MenAC疫苗中，可以將MenA連接到載體蛋白上的第一類化學(xué)基團(tuán)(例如羧基)上，將MenC連接到第二基團(tuán)(例如氨基)上。在MenCY疫苗中，可以將MenC連接到載體蛋白上的第一類化學(xué)基團(tuán)(例如羧基)上，將MenY連接到第二基團(tuán)(例如氨基)上。 在MenACWY疫苗中，可以將MenAC連接到載體蛋白上的第一類化學(xué)基團(tuán)(例如羧基)上，將 MenWY連接到第二基團(tuán)(例如氨基)上，或者可以將MenA連接到載體蛋白上的第一類化學(xué)基團(tuán)(例如羧基)上，將MenCWY連接到第二基團(tuán)(例如氨基)上。在一個實(shí)施方案中，2綴合物可以包括連接到同類載體上的同類糖，但是其是通過不同綴合化學(xué)進(jìn)行的。在其它的實(shí)施方案中，將2種不同的糖綴合到蛋白載體上的不同基團(tuán)上。“分別綴合到同類載體蛋白上”的意思是指將糖各自綴合到相同的載體上(即，不一起使用蛋白載體相同分子上的第一和第二化學(xué)基團(tuán)兩者來綴合糖的片段，而考慮用蛋白載體第一部分上的第一化學(xué)基團(tuán)來綴合第一個糖，考慮用蛋白載體第二部分上的第二化學(xué)基團(tuán)來綴合第二個糖)。在一個實(shí)施方案中，蛋白載體上的第一和第二類化學(xué)基團(tuán)是存在于載體蛋白上的單獨(dú)的B-和/或T-細(xì)胞抗原表位上的。也就是說，它們彼此存在于不同系列的B-和/或τ-細(xì)胞抗原表位上?？梢允褂靡阎姆椒ɡ缫韵聝煞N方法中的一種或兩種來預(yù)測載體的 B-細(xì)胞抗原表位2D-結(jié)構(gòu)預(yù)測和/或抗原指數(shù)預(yù)測。2D-結(jié)構(gòu)預(yù)測可以使用PSIPRED程序進(jìn)行(來自 David Jones,Brunei Bioinformatics Group,Dept. Biological Sciences, Brunei University, Uxbridge UB83PH, UK)?？乖笖?shù)可以以 Jameson 和 Wolf 所描述的方法(CABI0S 4:181-186[1988])為基礎(chǔ)進(jìn)行計(jì)算。該程序中使用的參數(shù)是抗原指數(shù)和抗原肽的最小長度。在該程序中可以使用對于最少5個連續(xù)氨基酸的0. 9的抗原指數(shù)作為初始值。T-輔助細(xì)胞抗原表位是結(jié)合在HLA類II型分子上的肽，并且其能夠被T-輔助細(xì)胞識別。對有效T-輔助細(xì)胞抗原表位的預(yù)測可以基于已知技術(shù)進(jìn)行，所述已知技術(shù)例如 Sturniolo 等人描述的 TEPIT0PE 法。(Nature Biotech. 17 :555-561 [1999]) 存在于蛋白載體上的第一和第二化學(xué)基團(tuán)任選地是彼此不同的，并且理想地是易于用于綴合目的的天然化學(xué)基團(tuán)。它們可以獨(dú)立地選自羧基、氨基、巰基、羥基、咪唑基、胍基和吲哚基。在一個實(shí)施方案中，第一化學(xué)基團(tuán)是羧基，第二基團(tuán)是氨基，或者為相反。對于這些基團(tuán)在上文中有更加詳細(xì)的解釋。在一個具體的實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含至少2中不同的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，其中一種或多種選自由MenA和MenC組成的第一組，其中所述MenA和MenC是通過蛋白載體上的第一類化學(xué)基團(tuán)(例如羧基)綴合到載體蛋白上的，一種或多種不同的糖選自由MenC、MenY和MenW組成的第二組，其中所述MenC、MenY和MenW是通過蛋白載體上的第二類化學(xué)基團(tuán)(例如氨基)綴合到載體蛋白上的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含通過第一類化學(xué)基團(tuán)(例如羧基)綴合的MenA，和通過第二類化學(xué)基團(tuán)(例如氨基)綴合的MenC。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含通過第一類化學(xué)基團(tuán)(例如羧基)綴合的MenC，和通過第二化種學(xué)基團(tuán)(例如氨基)綴合的MenY。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含通過第一類化學(xué)基團(tuán)(例如羧基)綴合的MenA，和通過第二化種學(xué)基團(tuán)(例如氨基)綴合的MenC、MenY和MenW。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含通過第一類化學(xué)基團(tuán)(例如羧基)綴合的MenA和MenC，和通過第二化種學(xué)基團(tuán)(例如氨基)綴合的MenY和MenW。在任意以上的實(shí)施例中，還可以存在綴合到同類蛋白載體上的Hib。可以將Hib通過第一或第二類化學(xué)基團(tuán)綴合到載體上。在一個實(shí)施方案中，其是通過羧基綴合的。在一個實(shí)施方案中，MenA莢膜糖，當(dāng)存在時其至少是部分0-乙?；?，從而使得至少50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或98 %的重復(fù)單元在至少一個位置上是0-乙?；?。0-乙?；绯霈F(xiàn)在至少50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或98 %的重復(fù)單元的至少 0-3位置上。在一個實(shí)施方案中，MenC莢膜糖，當(dāng)存在時其至少是部分0-乙?；?，從而使得至少 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或 98% 的(α 2 — 9)-連接 NeuNAc 重復(fù)單元在至少一或兩個位置上是0-乙?；摹?-乙?；绯霈F(xiàn)在至少30^^40%,50%、 60%、70%、80%、90%、95%或98%的重復(fù)單元的0_7和/或0_8位置上。在一個實(shí)施方案中，MenW莢膜糖，當(dāng)存在時，其至少是部分0_乙?；?，從而使得至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重復(fù)單元在至少一或兩個位置上是0-乙?；摹?-乙?；绯霈F(xiàn)在至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重復(fù)單元的0-7和/或0-9位置上。在一個實(shí)施方案中，MenY莢膜糖，當(dāng)存在時，其至少是部分0-乙酰化的，從而使得至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重復(fù)單元在至少一或兩個位置上是0-乙?；摹?-乙酰化出現(xiàn)在至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%、95%或98%的重復(fù)單元的7和/或9位上。0-乙?；陌俜直仁侵负?-乙?；鶊F(tuán)的重復(fù)單元的百分比?？梢栽诰Y合前和/或綴合后在糖中對其進(jìn)行測量。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，免疫原性組合物中所存在的糖或者所存在的各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是綴合到TT上的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，各類腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是分別綴合到不同類型的載體蛋白上的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖綴合物的糖載體比是1 5-5 1或1 1-1 4(w/w)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一種、兩種或三種腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖綴合物是直接綴合到載體蛋白上的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，Men W禾口 /或MenY, Menff和/或MenC、MenY和/或MenC、或者M(jìn)enW 和MenC和MenY是直接綴合到載體蛋白上的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一種、兩種或三種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物是通過CDAP化學(xué)直接綴合的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，MenW 和/或Y糖與載體蛋白的比例在1 0.5到1 2(w/w)之間。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中， MenC糖與載體蛋白的比例在1 0. 5到1 2(w/w)之間。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一種、兩種或三種腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是通過連接物(其可以是雙官能的具有兩個反應(yīng)性氨基(例如ADH)或兩個反應(yīng)性羧基或者一端具有反應(yīng)性氨基而另一端具有反應(yīng)性羧基)綴合到載體蛋白上的。連接物能夠具有4到12個碳原子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述的或每種通過連接物綴合的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖都是用CDAP化學(xué)綴合到連接物上的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，載體蛋白是使用碳二亞胺化學(xué)，任選地使用EDAC綴合到連接物上的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述的或每種腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖均是在將載體蛋白綴合到連接物上之前綴合到連接物上的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，MenA是通過連接物綴合到載體蛋白上的(MenA糖與載體蛋白的比例可以在1 2到1 5 (w/w)之間)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，MenC是通過連接物綴合到載體蛋白上的(MenC糖與載體蛋白的比例可以在 1 2 到 1 5(w/w)之間)。本發(fā)明的免疫原性組合物任選地包含一或多種糖綴合物，其中各糖在綴合前的平均尺寸大于50kDa、75kDa、IOOkDa, 1 IOkDa, 120kDa或130kDa。在一個實(shí)施方案中，綴合后的綴合物能夠容易地過濾通過0. 2微米的過濾器使得與過濾前的樣品相比，過濾后能夠獲得大于50、60、70、80、90或95%的收率。特別是，本發(fā)明的免疫原性組合物包含腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，所述莢膜糖來自綴合到載體蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一種、兩種、三種或四種，其中至少一種、 兩種、三種或四種或者每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖的平均尺寸(重均分子量；Mw)在50kDa、 60kDa、75kDa、100kDa、l 10kDa、120kDa 或 130kDa 以上。免疫原性組合物可以包含腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，所述莢膜糖來自綴合到載體蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一種、兩種、三種或四種，其中至少一種、兩種、三種或四種或者每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖是天然糖，或者是相對于天然多糖重量平均分子量用最高達(dá)XI. 5、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9或XlO的因子調(diào)整過尺寸的。
為了本發(fā)明的目的，“天然多糖”是指已經(jīng)經(jīng)歷過以減小糖的尺寸為目的的方法的糖。在通常的純化過程中，多糖的尺寸會稍微地減小。這樣的糖仍然是天然的。只有當(dāng)多糖已經(jīng)用調(diào)整尺寸的技術(shù)調(diào)整過尺寸后才認(rèn)為所述多糖不再是天然的。為了本發(fā)明的目的，“用最高達(dá)X2的因子調(diào)整尺寸”的意思是指用下述方法處理過的糖，所述方法試圖減小糖的尺寸但卻將其尺寸保持在天然多糖尺寸的一半以上。X3、X4等也是以同樣的方式解釋的，S卩，糖是用下述方法處理過的，所述方法試圖減小多糖的尺寸但卻將其尺寸保持在天然多糖尺寸的三分之一、四分之一以上等。在本發(fā)明的一個方面，免疫原性組合物包含腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，所述莢膜糖來自綴合到載體蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一種、兩種、三種或四種，其中至少一種、兩種、三種或四種或者每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖是天然多糖。在本發(fā)明的一個方面，免疫原性組合物包含腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，所述莢膜糖來自綴合到載體蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一種、兩種、三種或四種，其中至少一種、兩種、三種或四種或者每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖是用最高達(dá)X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9或XlO的因子調(diào)整過尺寸的。本發(fā)明的免疫原性組合物任選地包含綴合物腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C莢膜糖 (MenC)、血清群A莢膜糖(MenA)、血清群W135莢膜糖(MenW)、血清群Y莢膜糖(MenY)、血清群C和Y莢膜糖(MenCY)、血清群C和A莢膜糖(MenCA)、血清群C和W莢膜糖(MenCW)、血清群A和Y莢膜糖(MenAY)、血清群A和W莢膜糖(MenAW)、血清群W和Y莢膜糖(MenWY)、 血清群A、C和W莢膜糖(MenACff)、血清群A、C和Y莢膜糖(MenACY)、血清群A、W135和Y 莢膜糖(MenAffY)、血清群C、W135和Y莢膜糖(MenCffY)；或血清群A、C、W135和Y莢膜糖 (MenACWY)。這是本文所提到的“一種、兩種、三種或四種”，或血清群A、C、W和Y中，或各腦膜炎奈瑟氏球菌糖中的“至少一種”的定義。在一個實(shí)施方案中，至少一種、兩種、三種、四種或每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖的通過 MALLS 確定的平均尺寸在 50kDa 到 1500kDa、50kDa 到 500kDa、50kDa 到 300kDa、IOlkDa 到 1500kDa、IOlkDa 到 500kDa、IOlkDa 到 300kDa 之間。在一個實(shí)施方案中，MenA糖，如果存在，其分子量通過MALLS為50_500kDa、 50-100kDa、100-500kDa、55-90kDa、60-70kDa 或 70_80kDa 或 60_80kDa。在一個實(shí)施方案中，MenC糖，如果存在，其分子量通過MALLS為100_200kDa、 50-100kDa、100-150kDa、101-130KDa、150-210kDa 或 180_210kDa。在一個實(shí)施方案中，MenY糖，如果存在，其分子量通過MALLS為60_190kDa、 70-180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa 或 110-140kDa、50_100kDa、100_140kDa、 140-170kDa 或 150_160kDa。在一個實(shí)施方案中，MenW糖，如果存在，其分子量通過MALLS為60_190kDa、 70-180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa 或 110-140kDa、50-100kDa、120_140kDa。本文中糖的分子量或平均分子量是指在綴合之前測量的糖的重均分子量，其是通過MALLS測量的。MALLS技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的，其一般是如實(shí)施例2中所描述的那樣進(jìn)行的。對于腦膜炎雙球菌糖的MALLS分析，可以聯(lián)合使用兩個塔(TSKG6000和5000PWxl)，并且糖是在水中洗脫的。糖是使用光散射檢測器(例如裝有488nm的IOmW氬激光器的Wyatt DawnCN 102526723 A
DSP)和干涉測量折光計(jì)(例如裝有PlOO管和498nm的紅色濾光片的WyattOtilab DSP)檢測的。在一個實(shí)施方案中，腦膜炎奈瑟氏球菌糖是天然多糖，或者是在通常的提取過程中減小了尺寸的天然多糖。在一個實(shí)施方案中，腦膜炎奈瑟氏球菌糖是通過機(jī)械切割，例如通過微流化作用或超生處理調(diào)整過尺寸的。微流化作用和超生處理具有能夠?qū)⑤^大的天然多糖的尺寸減小到足以提供可過濾綴合物的優(yōu)勢。尺寸調(diào)整是通過不超過 X20、X10、X8、X6、X5、X4、X3 或 X2 的因子進(jìn)行的。在一個實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含腦膜炎奈瑟氏球菌綴合物，所述綴合物是由天然多糖和用不超過X20的因子調(diào)整過尺寸的糖的混合物制成的。例如， 來自MenC和/或MenA的糖是天然的。例如，來自MenY和/或MenW的糖是用不超過X20、X 10、X8、X6、X5、X4、X3或X2的因子調(diào)整過尺寸的。例如，免疫原性組合物含有由MenY和/或MenW和/或MenC和/或MenA制成的綴合物，其中所述MenY和/或 Menff和/或MenC和/或MenA是用不超過X 10的因子調(diào)整過尺寸的和/或是微流化的。 例如，免疫原性組合物含有由天然MenA和/或MenC和/或MenW和/或MenY制成的綴合物。例如，免疫原性組合物包含由天然MenC制成的綴合物。例如，免疫原性組合物包含由天然MenC和用不超過X 10的因子調(diào)整過尺寸的和/或微流化的MenA制成的綴合物。例如，免疫原性組合物包含由天然MenC和用不超過XlO的因子調(diào)整過尺寸的和/或微流化的MenY制成的綴合物。在一個實(shí)施方案中，糖的多分散性是1-1. 5，1-1. 3，1-1. 2，1-1. 1或1-1. 05，在綴合到載體蛋白上以后，綴合物的多分散性是1. 0-2. 5，1. 0-2. 0. 1. 0-1. 5，1. 0-1. 2，1. 5-2. 5， 1. 7-2. 2或1. 5-2. 0。所有的多分散性都是通過MALLS測量的。任選地調(diào)整糖的尺寸直到其是從細(xì)菌中分離出的多糖尺寸的1.5、2、4、6、8、10、 12、14、16、18 或 20 倍。在一個實(shí)施方案中，各腦膜炎奈瑟氏球菌糖或者是天然多糖，或者是用不超過XlO的因子調(diào)整過尺寸的。在一個實(shí)施方案中，每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖均是天然多糖。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，至少一種、兩種、三種或四種腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是通過微流化作用調(diào)整過尺寸的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是用不超過X 10的因子調(diào)整過尺寸的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，腦膜炎奈瑟氏球菌綴合物是由天然多糖和用不超過Xio的因子調(diào)整過尺寸的糖的混合物制成的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中， 來自血清群Y的莢膜糖是用不超過Xio的因子調(diào)整過尺寸的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中， 來自血清群A和C的莢膜糖是天然的多糖，而來自血清群W135和Y的糖是用不超過X 10 的因子調(diào)整過尺寸的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的平均尺寸在50kDa到300KDa或50kDa到200kDa之間。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含MenA莢膜糖，其中所述MenA莢膜糖的平均尺寸大于50kDa，75kDa, IOOkDa,或者其平均尺寸在50-IOOkDa或55-90kDa或60_80kDa之間。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含MenC莢膜糖，其中所述MenC莢膜糖的平均尺寸大于50kDa，75kDa, IOOkDa,或者在 100-200kDa,100-150kDa,80-120kDa,90-1IOkDa,150_200kDa，120_240kDa，140_220kDa， 160-200kDa或190-200kDa之間。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含MenY莢膜糖，其中所述MenY莢膜糖的平均尺寸大于50kDa，75kDa，1 OOkDa，或者在60_190kDa 或 70-180kDa 或 80_170kDa 或 90_160kDa 或 100-150kDa、110-150kDa、110_145kDa 或 120-140kDa之間。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含MenW莢膜糖，其中所述 Menff莢膜糖的平均尺寸大于50kDa、75kDa、100kDa，或者在60_190kDa或70_180kDa或 80-170kDa 或 90_160kDa 或 100_150kDa，140_180kDa，150_170kDa 或 110_140kDa 之間。本發(fā)明的免疫原性組合物可以包含綴合到載體蛋白上的b型流感嗜血桿菌 (H. influenzae)莢膜糖(Hib)。其可以綴合到選自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D 的載體蛋白上，例如綴合到TT上?？梢詫ib糖綴合到與至少一種、兩種、三種或全部腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖綴合物相同的載體蛋白上，例如綴合到TT上。在Hib莢膜糖綴合物中 Hib與載體蛋白的比例可以在1 5到5 l(w/w)之間，例如在1 1到1 4、1 2到 1 3.5之間，或者在1 3(w/w)左右。Hib莢膜糖可以是通過連接物(參見上面)綴合到載體蛋白上的。連接物可以是雙官能的(具有兩個反應(yīng)性氨基，例如ADH，或者具有兩個反應(yīng)性羧酸基團(tuán)，或者一端具有反應(yīng)性氨基另一端具有反應(yīng)性羧酸基團(tuán))。其可以具有4到 12各碳原子?？梢詫ib糖綴合到載體蛋白上，或者使用CNBr或CDAP綴合到連接物上。 載體蛋白可以通過連接物用包含碳二亞胺化學(xué)，任選地為EDAC化學(xué)(因此使用載體上的羧基化學(xué)基團(tuán))的方法綴合到Hib糖上。Hib糖綴合物的劑量可以在0. 1到9μ g、l到5μ g 或2到3yg糖之間。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含Hib糖綴合物和至少兩種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物，其中所述Hib綴合物以比所述至少兩種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物的平均糖劑量低的糖劑量存在?；蛘?，所述Hib綴合物以比所述至少兩種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物中的每一種的糖劑量低的糖劑量存在。例如，Hib綴合物的劑量可以比所述至少兩種其它腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物的平均或最低糖劑量低至少10 %、20 %、30 %、 40%、50%、60%、70% 或 80%。平均劑量是通過將所有的其它糖的劑量相加再除以其它糖的數(shù)目而確定的。所述其它糖是指免疫原性組合物中除Hib以外的所有的糖，其能夠包括腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖。“劑量”是向人給予的免疫原性組合物或疫苗的量。Hib糖是b型流感嗜血桿菌的磷酸聚核糖基核糖醇(PRP)莢膜糖，或者是由其衍生的低聚糖?！爸辽賰煞N其它細(xì)菌糖綴合物”意思是指除Hib綴合物以外的兩種其它細(xì)菌糖綴合物。所述的兩種其它細(xì)菌綴合物可以包括腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物。本發(fā)明的免疫原性組合物可以包含由腦膜炎奈瑟氏球菌、肺炎鏈球菌、A組鏈球菌、B組鏈球菌、傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌中的一種或多種衍生的其它糖綴合物。在一個實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含由腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、 W135和Y中的一種或多種衍生的莢膜糖。一個進(jìn)一步的實(shí)施方案包含由肺炎鏈球菌衍生的莢膜糖。所述肺炎球菌莢膜糖抗原任選地選自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、 11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F(任選地選自血清型 1、3、4、5、6B、 7F、9V、14、18C、19F和23F)。一個進(jìn)一步的實(shí)施方案包含金黃色葡萄球菌的5型、8型或336 莢膜糖。一個進(jìn)一步的實(shí)施方案包含表皮葡萄球菌的I型、II型或III型莢膜糖。一個進(jìn)一步的實(shí)施方案包含來自傷寒沙門氏菌的Vi糖。一個進(jìn)一步的實(shí)施方案包括B組鏈球菌的Ia型、Ic型、II型、III型或V型莢膜糖。一個進(jìn)一步的實(shí)施方案包含A組鏈球菌的莢膜糖，任選地進(jìn)一步包含至少一種M蛋白和更任選地多種類型的M蛋白。
本發(fā)明的免疫原性組合物還可以包含DIPa或DTPw疫苗(例如一種含有DT、TT 以及全細(xì)胞百日咳(Pw)疫苗或無細(xì)胞百日咳(Pa)疫苗(包含例如百日咳類毒素、FHA、 pertactin以及任選地agglutinogins2和幻的疫苗)。這樣的組合物還可以包含抗乙型肝炎的疫苗(例如其可以包含乙型肝炎表面抗原[HepB]，其任選地是吸附在磷酸鋁上的)。 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含DTPwifepBHibMenAC疫苗，其中的MenAC 組分是如上所述的。 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物進(jìn)一步包含來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B的抗原。所述抗原任選地是來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B (MenB)或調(diào)整過尺寸的多糖或由其衍生的低聚糖的莢膜多糖，所述莢膜多糖可以是綴合在蛋白載體上的。所述抗原任選地是如 EP301992、W0 01/09350, WO 04/14417, WO 04/14418 和 WO 04/14419 中所描述的那些來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B的外膜囊制備物。通常，本發(fā)明免疫原性組合物所包含的每種糖綴合物的劑量可以在2到20μ g、3 至Ij IOyg或4至lj7yg||之間。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明免疫原性組合物所包含的每種腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的劑量可以在0. 1-20 μ g ；1-10 μ g ；2-10 μ g ；2. 5-5 μ g之間，或者在5 μ g左右或恰好為 5 μ g ；或者在2. 5 μ g左右或恰好為2. 5 μ g。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明免疫原性組合物所含有的Hib糖綴合物的糖劑量可以在0. 1至Ij 9 μ g ;1至Ij 5 μ g或2至Ij 3 μ g之間，或者在2. 5 μ g左右或恰好為2. 5 μ g。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物所含有的Hib糖綴合物的糖劑量例如在0. 1到 9 μ g ； 1到5g或2到3 μ g之間，或者在2. 5 μ g左右或恰好為2. 5 μ g，和所含有的每種腦膜炎奈瑟氏球菌多糖綴合物的糖劑量在2到20 μ g、3到10 μ g或4到7 μ g之間，或者恰好為 5 μ go為了本發(fā)明的目的，“左右”或“大約”被定義為在所給出范圍的10%上下以內(nèi)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明免疫原性組合物所含有的Hib糖綴合物的糖劑量例如小于至少兩種、三種、四種或每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物平均糖劑量的90%，80%， 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%^ 10%o Hib糖的糖劑量例如是至少兩種、三種、四種或每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物平均糖劑量的20 %到60 %、30 %到60 %、40 %到60 % 或者50%左右或恰好為50%。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明免疫原性組合物所含有的Hib糖綴合物的糖劑量例如小于至少兩種、三種、四種或每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物最低糖劑量的90%，80%， 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%^ 10%o Hib糖的糖劑量例如是至少兩種、三種、四種或每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物最低糖劑量的20 %到60 %、30 %到60 %、40 %到60 % 或者50%左右或恰好50%。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述至少兩種、三種、四種或每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物中的每一種的糖劑量任選地是相同的或近似相同的。本發(fā)明免疫原性組合物的實(shí)例是由以下物質(zhì)組成或含有以下物質(zhì)的組合物Hib綴合物和MenA綴合物和MenC綴合物，任選地各糖的劑量比為1 2 2，1 2 1,1 4 2,1 6 3,1 3 3,1 4 4,1 5 5,1 6 6 (w/w)。任選地，MenA的糖劑量大于MenC的糖劑量。Hib綴合物和MenC綴合物和MenY綴合物，任選地各糖的劑量比為1 2 2， 1 2 1,1 4 2,1 4 1,1 8 4,1 6 3,1 3 3,1 4 4,1 5 5, 1:6: 6 (w/w) 0任選地，MenC的糖劑量大于MenY的糖劑量。Hib綴合物和MenC綴合物和MenW綴合物，任選地各糖的劑量比為1 2 2， 1 2 1,1 4 2,1 4 1,1 8 4,1 6 3,1 3 3,1 4 4,1 5 5, 1:6: 6 (w/w)。任選地，MenC的糖劑量大于MenW的糖劑量。Hib綴合物和MenA綴合物和MenW綴合物，任選地各糖的劑量比為1 2 2， 1 2 1,1 4 2,1 4 1,1 8 4,1 6 3,1 3 3,1 4 4,1 5 5, 1:6: 6 (w/w) 0任選地，MenA的糖劑量大于MenW的糖劑量。Hib綴合物和MenA綴合物和MenY綴合物，任選地各糖的劑量比為1 2 2， 1 2 1,1 4 2,1 4 1,1 8 4,1 6 3,1 3 3,1 4 4,1 5 5, 1:6: 6 (w/w) 0任選地，MenA的糖劑量大于MenY的糖劑量。Hib綴合物和MenW綴合物和MenY綴合物，任選地各糖的劑量比為1 2 2， 1 2 1，1 1 2，1 4 2，1 2 4.1 4 1，1 1 4，1 3 6，1 1 3， 1 6 3,1 3 3,1 4 4,1 5 5,1 6 6 (w/w)。任選地，MenY 的糖劑量大于MenW的糖劑量。MenA、MenC、MenW 和 MenY，其糖劑量比為 1 :1:1:1 或 2:1:1:1 或 1:2:1:1 或 2:2:1:1 或 1:3:1:1 或 1:4:1:1 (w/w)。本發(fā)明進(jìn)一步的方面是包含本發(fā)明免疫原性組合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗。在一個實(shí)施方案中，將本發(fā)明的免疫原性組合物緩沖到或調(diào)節(jié)到pH7. 0到8. 0或 pH 7. 2到7. 6之間，或pH 7. 4左右或恰好為pH 7. 4。本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗任選地是在穩(wěn)定劑例如多元醇如蔗糖或海藻糖的存在下凍干的。任選地，本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗含有足以使對免疫原的免疫應(yīng)答加強(qiáng)的量的助劑。合適的助劑包括，但不限于，鋁鹽(磷酸鋁或氫氧化鋁)、角鯊烯混合物(SAF-1)、 胞壁肽、皂草苷衍生物、分枝桿菌細(xì)胞壁制品、單磷酰脂質(zhì)A、霉菌酸衍生物、非離子嵌段共聚物表面活性劑、Quil A、霍亂毒素B亞單位、聚磷腈及其衍生物、和免疫刺激復(fù)合物 (ISCOMs)例如Takahashi等人，(1990) Nature 344 :873-875中所描述的那些免疫刺激復(fù)合物。對于以上所討論的腦膜炎奈瑟氏球菌或HibMen組合物，不使用任何鋁鹽助劑，或者根本不使用任何助劑是有利的。對于所有的免疫原性組合物或疫苗來說，免疫原的免疫有效量必須是憑經(jīng)驗(yàn)確定的。所考慮的因素包括免疫原性、免疫原是否將會被復(fù)合到或共價附著到助劑或載體蛋白或其它載體上，給藥途徑和給藥的致免疫劑量的數(shù)量。本發(fā)明的藥物組合物或疫苗中可以存在不同濃度的活化劑。一般地，物質(zhì)的最低濃度是獲得其使用目所必須的量，而最高濃度是能夠保留在溶液中的最大量，或者是能夠保持均勻地懸浮在初始混合物內(nèi)的最大量。例如，治療劑的最小量任選地是能夠提供單一治療有效劑量的量。對于生物活性物質(zhì)來說，其最低濃度是在重組過程中具有生物活性所必需的量，最高濃度是不能夠再保持均勻懸浮的點(diǎn)處的濃度。在單劑單位的情況下，所述量即為單一治療使用量。通常，可以預(yù)期每種制劑能夠包含I-IOOyg的蛋白抗原，任選地為5-50yg或5-25yg。例如，綴合物中細(xì)菌糖的劑量是10-20 μ g、5-10 μ g、2. 5-5 μ g或 1-2. 5μ g糖。通過對所述疫苗進(jìn)行全身或粘膜途徑的給藥，本發(fā)明的疫苗制品可以用于保護(hù)或治療易受感染的哺乳動物(例如人類患者)。所述人類患者任選地是嬰兒(12個月以下)、 初學(xué)走路的孩子(12-24、12-16或12-14個月)、兒童(2_10、3_8或3-5歲)、青少年(21-21、 14-20或15-19歲)或成人。這些給藥可以包括經(jīng)由肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或皮下路線的注射； 或者通過粘膜給藥到達(dá)口腔/消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)處。疫苗的產(chǎn)期內(nèi)給藥對于治療肺炎或中耳炎來說是優(yōu)選的(因?yàn)檫@樣能夠更有效地預(yù)防鼻咽部攜帶肺炎球菌，并因此能夠在其最初階段減少感染)。雖然本發(fā)明的疫苗可以作為單劑給藥，但也可以將其各組分一起進(jìn)行同時或不同時的共同給藥(例如如果疫苗中存在糖，則可以同時對這些糖進(jìn)行分別給藥，或者是在給藥以細(xì)菌蛋白疫苗1-2周后再對這些糖進(jìn)行給藥以彼此獲得免疫應(yīng)答的最佳協(xié)調(diào))。除了單一的給藥途徑以外，還可以使用2種不同的給藥途徑。例如，可以對病毒抗原進(jìn)行ID(皮內(nèi))給藥，而對細(xì)菌蛋白進(jìn)行IM(肌內(nèi))或IN(產(chǎn)期內(nèi))給藥。如果存在糖，則可以對它們進(jìn)行IM(或ID)給藥，并對細(xì)菌蛋白進(jìn)行IN(或ID)給藥。此外， 對于初種制劑，本發(fā)明的疫苗可以用IM的方式給藥，對于加強(qiáng)制劑可以用IN的方式。疫苗制品通常描述于 Vaccine Design( "The subunit and adjuvant approach" (Powell M. F. & Newman M. J.編輯)(1995)Plenum Press New York)中。月旨質(zhì)體內(nèi)部的膠囊化描述于Ful lerton，美國專利4，235，877中。本發(fā)明進(jìn)一步的方面是一種用于伴隨或順序給藥的免疫試劑盒，其包含兩種多價免疫原性組合物以用于在宿主內(nèi)提供保護(hù)作用從而抵抗由百日咳桿菌(Bordetella pertussis)、破傷風(fēng)桿菌(Clostridium tetani)、白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)和腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)以及任選地流感嗜血桿菌 (Haemophilus influenzae)所引起的疾病。例如，所述試劑盒任選地包含第一容器，所述第一容器中包含一種或多種破傷風(fēng)類毒素(TT)，白喉類毒素(DT)，和全細(xì)胞或無細(xì)胞百日咳組分和第二容器，所述第二容器中包含如上所述的本發(fā)明免疫原性組合物(例如那些包含Men或HibMen糖綴合物組合的免疫原性組合物)。本發(fā)明進(jìn)一步的方面是一種用于伴隨或連續(xù)給藥的免疫試劑盒，其包含兩種多價免疫原性組合物以用于在宿主內(nèi)提供保護(hù)作用從而抵抗由肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonias)和腦膜炎奈瑟氏球菌以及任選地流感嗜血桿菌引起的疾病。例如，所述試劑盒任選地包含第一容器，所述第一容器中包含載體蛋白與來自肺炎鏈球菌的莢膜糖[其中所述莢膜糖任選地來自選自1，2，3，4，5，6A，6B，7F，8，9N，9V，10A,11A,12F,14，15B,17F,18C,19A,19F，20，22F，23F 和 33F 的肺
炎球菌血清型]的一種或多種綴合物。和第二容器，所述容器中包含如上所述的本發(fā)明免疫原性組合物(例如那些包含Men或HibMen糖綴合物組合的免疫原性組合物)。Hib綴合物和腦膜炎奈瑟氏球菌多糖綴合物的例子如上所述。一般地，本發(fā)明免疫試劑盒中的(或者任意以上所描述的本發(fā)明免疫原性組合物中的)肺炎鏈球菌疫苗將包含糖抗原(任選地是綴合的)，其中所述糖衍生自選自1，2，3， 4，5，6A，6B，7F，8，9N，9V，10A,11A,12F,14，15B,17F,18C,19A,19F，20，22F，23F 和 33F 的肺炎球菌血清型中的至少四種。任選地，所述的四種血清型包括6B，14，19F和23F。任選地， 組合物中包括至少7種血清型，例如那些衍生自血清型4、6B、9V、14、18C、19F* 23F的。任選地，組合物中包括大于7種的血清型，例如包括至少10、11、12、13或14種血清型。例如一個實(shí)施方案中的組合物包含衍生自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F和任選地 3(所有均任選地是綴合的)的10或11莢膜糖。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中包含了至少13 種糖抗原(任選地是綴合的)，雖然其它的糖抗原，例如23元(例如血清型1，2，3，4，5，6B， 7F，8，9N，9V，10A, 11A, 12F, 14，15B, 17F, 18C, 19A, 19F，20，22F，23F 和 33F)也能夠通過本發(fā)明預(yù)期到。能夠?qū)⒎窝浊蚓仟?dú)立地綴合到任何已知的載體蛋白上，所述載體蛋白例如 CRM197、破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、蛋白D或以上所提到的任何其它載體蛋白。任選地，本發(fā)明的免疫試劑盒還包含第三部分。例如，所述試劑盒任選地包含第一容器，所述第一容器中含有一種或多種破傷風(fēng)類毒素(TT)，白喉類毒素(DT)，和全細(xì)胞或無細(xì)胞百日咳組分和第二容器，所述第二容器中包含載體蛋白與來自肺炎鏈球菌的莢膜糖[其中所述莢膜糖任選地來自選自1，2，3， 4，5，6A，6B，7F，8，9N，9V，10A,11A,12F,14，15B,17F,18C,19A,19F，20，22F，23F 和 33F 的肺
炎球菌血清型]的一種或多種綴合物。和第三容器，所述容器中包含如上所述的本發(fā)明免疫原性組合物(例如那些包含Men或HibMen糖綴合物組合的免疫原性組合物)。本發(fā)明進(jìn)一步的方面是一種本發(fā)明免疫原性組合物或疫苗的的制備方法，其包括將本發(fā)明的糖進(jìn)行混合的步驟，例如將腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖與藥學(xué)上可接受的賦形劑進(jìn)行混合，所述腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖來自綴合到載體蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一種、兩種、三種或全部四種。本發(fā)明進(jìn)一步的方面是一種對人類宿主進(jìn)行免疫以抵抗由腦膜炎奈瑟氏球菌以及任選地流感嗜血桿菌感染所引起的疾病的方法，所述方法包括向宿主給藥以免疫保護(hù)劑量的本發(fā)明免疫原性組合物或疫苗或試劑盒，任選地使用單劑。本發(fā)明的一個獨(dú)立的方面是一種用免疫原性組合物使人類宿主免疫的方法，所述免疫原性組合物包含至少2種選自血清群A、C、W和Y(任選地為MenA、C、W和Y)的不同腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖綴合物，其中單一劑量的給藥(任選地是對少年、成人或孩子的給藥)導(dǎo)致在給藥一個月后進(jìn)行的血液檢查中給出在測量對MenA、MenC、MenW和/或MenY的應(yīng)答水平的SBA試驗(yàn)中應(yīng)答者超過50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或95 %的結(jié)果。任選地SBA 試驗(yàn)是如實(shí)施例9中所描述的，并如實(shí)施例9中所描述的那樣對應(yīng)答者進(jìn)行評價。本發(fā)明一個進(jìn)一步獨(dú)立的方面是一種包含MenA、MenC, Menff和/或MenY綴合物的免疫原性組合物，其能夠在單劑使用后引發(fā)免疫應(yīng)答，從而使得超過50^^60^^70 ^ 80%、90%或95%的接種人類受試者(兒童、少年或成人)在對接種后一個月時抽取的血液進(jìn)行的SBA試驗(yàn)中能夠歸為應(yīng)答者一類(任選地使用實(shí)施例9中所描述的標(biāo)準(zhǔn))。這樣的免疫原性組合物任選地具有本文所描述的進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)特征。本發(fā)明的一個進(jìn)一步的方面是本發(fā)明免疫原性組合物在治療或預(yù)防由腦膜炎奈瑟氏球菌和任選地流感嗜血桿菌感染所引起的疾病方面的用途。本發(fā)明的一個進(jìn)一步的方面是本發(fā)明免疫原性組合物或疫苗或試劑盒在制備用于治療或預(yù)防由腦膜炎奈瑟氏球菌和任選地流感嗜血桿菌感染所引起的疾病的藥物方面的用途。根據(jù)發(fā)明人的意圖，在所有情況中，本文中的術(shù)語“包含”、“含有”和“包括”是分別與術(shù)語“由...組成”、“由...組成的”和“由...組成地”可任選地替換的。本專利說明書中所引用的全部參考文獻(xiàn)或?qū)＠暾埦诖艘胱鳛閰⒖肌Ｋ降膶?shí)施例解釋說明了本發(fā)明。除另外詳細(xì)描述的那些以外，以下實(shí)施例均是采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行的，其對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的并且是常規(guī)的。實(shí)施例是解釋說明性的，其不用于限定本發(fā)明。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例實(shí)施例1-多糖綴合物的制備通過由Chu等人開發(fā)的偶合化學(xué)方法Qnfection and Immunity 1983,40(1), 245-256)實(shí)現(xiàn)流感嗜血桿菌(Hib)PRP多糖到TT上的共價鍵合。通過加入CNBr并在pH 10. 5下培養(yǎng)6分鐘對Hib PRP多糖進(jìn)行活化。將pH降低到pH 8. 75并加入己二酸二酰胼 (ADH)，繼續(xù)培養(yǎng)90分鐘。通過使用1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亞胺(EDAC) 的碳二亞胺縮合將活化的PRP連接到純化的破傷風(fēng)類毒素上。向活化的PRP中加入EDAC以達(dá)到0.6mg EDAC/mg活化PRP的最終比例。將pH調(diào)節(jié)到5. 0并加入純化的破傷風(fēng)類毒素以達(dá)到ang TT/mg活化PRP。在溫和的攪拌下將所產(chǎn)生的溶液放置三天。在通過0.45 μ m 膜的過濾之后，將綴合物在用在0. 2M NaCl中平衡過的s印hacryl S500HR(Pharmacia，瑞典)柱上進(jìn)行純化。MenC-TT綴合物是使用天然多糖(通過MALLS測量超過150kDa的)制備的或者是被輕微微流化過的。MenA-TT綴合物是用超過60kDa的天然多糖或輕微微流化多糖制備的，所述超過60kDa是通過實(shí)施例2中的MALLS法測量的。MenW和MenY-TT綴合物是用 100-200kDa左右的調(diào)整過尺寸的多糖制備的，其中所述100_200kDa左右是通過MALLS (參見實(shí)施例2)測量的。通過使用勻漿器Emulsiflex C-50裝置的微流化作用來調(diào)整尺寸。然
28后將多糖通過0. 2 μ m過濾器進(jìn)行過濾?；罨团己鲜侨鏦096/29094和WO 00/56360中所描述的那樣進(jìn)行的。簡單地說是，將2M NaCl中的pH 5. 5-6. 0且濃度為10_20mg/ml的多糖與CDAP溶液(100mg/ml，在乙腈/WFI, 50/50中新制備的)進(jìn)行混合以達(dá)到0. 75/1或1. 5/1的最終CDAP/多糖比例。 1.5分鐘后，用氫氧化鈉將pH升高到pH 10.0。三分鐘后，加入破傷風(fēng)類毒素以達(dá)到以下蛋白/多糖比例，所述比例對MenW來說為1. 5/1，對MenY來說為1. 2/1，對MenA來說為1. 5/1 或者對MenC來說為1.5/1。繼續(xù)反應(yīng)一到兩個小時。偶合步驟之后，加入甘氨酸以達(dá)到7. 5/1的最終甘氨酸/PS(w/w)比例，并將pH調(diào)節(jié)到pH 9. O。將混合物放置30分鐘。使用10 μ m的Kleenpak過濾器澄清綴合物，然后將其裝載到kphacryl S400HR柱上，所述柱子使用的洗脫緩沖液是的150mM NaCl、IOmM或5mM TrispH7. 5。將臨床批次在Opticap 4滅菌膜上過濾。所產(chǎn)生的綴合物具有1 1_1 5 (w/ w)的平均糖蛋白比例。實(shí)施例Ia-本發(fā)明MenA和MenC多糖綴合物的制備MenC-TT綴合物是使用天然多糖(通過MALLS測量超過150kDa的)制備的，或者是被輕微微流化過的。MenA-TT綴合物是使用超過60kDa的天然多糖或輕微微流化過的多糖制備的，其中所述超過60kDa是通過實(shí)施例2中的MALLS法測量的。通過使用勻漿器 Emulsiflex C-50裝置的微流化作用來調(diào)整尺寸。然后將多糖通過0. 2 μ m的過濾器進(jìn)行過
濾ο為了將MenA莢膜多糖通過間隔物綴合到破傷風(fēng)類毒素上，使用了以下的方法。通過偶合化學(xué)方法來實(shí)現(xiàn)多糖與間隔物(ADH)的共價鍵合，所述偶合化學(xué)方法使多糖在控制條件下通過氰基化試劑，1-氰基4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)得到活化。間隔物通過其胼基來與氰基化的PS進(jìn)行反應(yīng)，從而在間隔物與多糖之間形成穩(wěn)定的異脲連接。用新制備的100mg/ml CDAP的乙腈/水(50/50 (v/v))溶液處理10mg/ml的MenA 溶液(pH 6. 0) [3. 5g]以獲得0. 75 (w/w)的CDAP/MenA比例。1. 5分鐘后，將pH升高到pH 10. O。三分鐘后，加入ADH以獲得8. 9的ADH/MenA比例。將溶液的pH降低到8. 75并且保持該pH繼續(xù)反應(yīng)2小時(溫度保持在25°C )。將PSAAH溶液濃縮到其初始體積的四分之一，然后使用截點(diǎn)為IOkDa的Filtron Omega膜用30體積的0. 2M NaCl進(jìn)行滲濾(diaf iltered)，過濾滯留物。在綴合(碳二亞胺縮合)反應(yīng)之前，對純化TT溶液和PSAAH溶液進(jìn)行稀釋以達(dá)到 10mg/ml 的 PSAAH 濃度和 10mg/ml 的 TT 濃度。為了達(dá)到0. 9mg EDAC/mg PSAAH的最終比例，向PSAH溶液(2g糖)中加入 EDACd-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亞胺)。將pH調(diào)節(jié)到5. O。用蠕動泵(在60 分鐘內(nèi))加入純化的破傷風(fēng)類毒素以達(dá)到angTT/mg PSAAH。在+25°C在攪拌下將所產(chǎn)生的溶液放置60分鐘以達(dá)到120分鐘的最終偶合時間。通過加入pH 7. 5的IM Tris-Hcl (最終體積的1/10)對溶液進(jìn)行中和并在+25°C下放置30分鐘，然后在+2°C到+8°C下放置過夜。使用10 μ m的過濾器澄清綴合物，并使用kphacryl S400HR柱(Pharmacia，瑞典) 進(jìn)行純化。該柱是在IOmM Tris-HCKpH 7.0)中平衡過的，將0. 075M NaCl和綴合物(大約 660mL)載樣到所述柱子上(+2°C到+8°C)。洗脫池(elution pool)是作為^Onm下光密度的函數(shù)選擇的。當(dāng)吸光度增加到0.05時開始收集。持續(xù)收集直到Kd達(dá)到0.30。將綴合物在+20°C下過濾消毒，然后在+2°C到+8°C下儲存。所產(chǎn)生的綴合物具有1 2-1 4(w/ w)的糖蛋白比例。為了將MenC莢膜多糖通過間隔物綴合到破傷風(fēng)類毒素上，使用了以下的方法。通過偶合化學(xué)方法來實(shí)現(xiàn)多糖與間隔物(ADH)的共價鍵合，所述偶合化學(xué)方法使多糖在控制條件下通過氰基化試劑，1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)得到活化。間隔物通過其胼基與氰基化的PS進(jìn)行反應(yīng)，從而在間隔物與多糖之間形成了穩(wěn)定的異脲連接。用新制備的100mg/ml CDAP的乙腈/水(50/50 (v/v))溶液處理20mg/ml的MenC 溶液(pH 6. 0) [3. 5g]以獲得1. 5 (w/w)的CDAP/MenC比例。1. 5分鐘后，將pH升高到pH 10.0。在活化過程中加入pH 5M NaCl以獲得2M NaCl的最終濃度。三分鐘后，加入ADH以獲得8. 9的ADH/MenC比例。將溶液的pH降低到8. 75并且保持該pH繼續(xù)反應(yīng)2小時(溫度保持在25°C )。將PSCAH溶液濃縮到150mL的最小體積，然后使用截點(diǎn)為IOkDa的Filtron Omega 膜用30體積的0. 2M NaCl進(jìn)行滲濾，過濾滯留物。在綴合反應(yīng)之前，將純化TT溶液和PSCAH溶液(2g規(guī)模的)在0. 2M NaCl中進(jìn)行稀釋以達(dá)到15mg/ml的PSCAH濃度和20mg/ml的TT濃度。為了達(dá)到aiig TT/mg PSCAH，向PSCAH溶液中加入純化的破傷風(fēng)類毒素。將pH調(diào)節(jié)到5. O。用蠕動泵(在10分鐘內(nèi))加入EDAC(16. 7mg/ml Tris 0. IM pH 7. 5中的)以達(dá)到0.5mg EDAC/mg PSCAH的最終比例。在+25°C，在攪拌和pH調(diào)節(jié)下將所產(chǎn)生的溶液放置 110分鐘以達(dá)到120分鐘的最終偶合時間。然后通過加入pH 9. O的IM Tris-Hcl (最終體積的1/10)對溶液進(jìn)行中和并在+25°C下放置30分鐘，然后在+2°C到+8°C下放置過夜。使用10 μ m的過濾器澄清綴合物，并使用kphacryl S400HR柱(Pharmacia，瑞典) 進(jìn)行純化。該柱是在IOmM Tris-HCKpH 7.0)中平衡過的，將0. 075M NaCl和綴合物(大約460mL)載樣到所述柱子上(+2°C到+8°C )。洗脫池是作為280nm下光密度的函數(shù)選擇的。當(dāng)吸光度增加到0.05時開始收集。持續(xù)收集直到Kd達(dá)到0.20。將綴合物在+20°C下過濾消毒，然后在+2°C到+8°C下儲存。所產(chǎn)生的綴合物具有1 2-1 4 (w/w)的糖蛋白比例。實(shí)施例2-使用MALLS確定分子量將檢測器與HPLC排阻柱連接，樣品從所述排阻柱中得到洗脫。一方面，激光散射檢測器測量了大分子溶液在16度角散射的光強(qiáng)度，另一方面，在線設(shè)置的干涉測量折光計(jì) (interferometric refractometer)提供了對洗脫樣品的量的測量。由此可以確定溶液中大分子的密度、尺寸和形狀。重均分子量(Mw)的定義是所有物質(zhì)重量與它們各自分子量的乘積的總和，再除以所有物質(zhì)的重量和。a)重均分子量-Mw-
權(quán)利要求
1.一種包含至少2種不同腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的免疫原性組合物，其中一種或多種所述糖選自由綴合到蛋白載體上的MenA、MenC、MenY和MenW組成的第一組，其中糖 蛋白的比例(w/V)在1 2-1 5之間，一種或多種不同的糖選自由綴合到蛋白載體上的 MenA、MenC、MenY和MenW組成的第二組，其中糖蛋白的比例(w/w)在5 1-1 1. 99之間。
2.如權(quán)利要求1中所述的包含至少2種不同腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的免疫原性組合物，其中一種或多種所述糖選自由綴合到蛋白載體上的MenA和MenC組成的第一組，其中糖蛋白的比例(w/w)在1 2-1 5之間，一種或多種不同的糖選自由綴合到蛋白載體上的MenC、MenY和MenW組成的第二組，其中糖蛋白的比例(w/w)在5 1-1 1. 99之間。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中所述的免疫原性組合物，其中存在MenW并且MenW糖與載體蛋白的比例在 5 1-1 1.99,2 1-1 1.99,1. 5 1-1 1.8,1 1-1 1.7、 1 1.2-1 1.6或 1 1.4-1 1.5(w/w)之間。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中存在MenY并且MenY糖與載體蛋白的比例在 5 1-1 1.99,2 1-1 1.99,1. 5 1-1 1.9,1 1-1 1.8、 1 1.1-1 1.6或 1 1.3-1 1.4(w/w)之間。
5.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中存在MenA并且MenA糖與載體蛋白的比例在 1 2-1 5、1 2.4-1 4、1 2.7-1 3. 5 或 1 2.9-1 3. 1 (w/ w)之間。
6.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中存在MenC并且Men C糖與載體蛋白的比例在 5 1-1 1. 99,2 1-1 1. 99,1. 5 1-1 1. 8,1. 3 1-1 1.6、 1.2 1-1 1.4 或 1.1 1-1 1.2 (w/w)之間。
7.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中存在MenC并且Men C糖與載體蛋白的比例在 1 2-1 5、1 2.5-1 4. 5,1 2.7-1 4. 3,1 3-1 4 或 1 3.3-1 3. 5 (w/w)之間。
8.如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的包含至少2種不同腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的免疫原性組合物，其中一種或多種所述糖選自由通過連接物綴合到載體蛋白上的MenA、MenC、 MenY和MenW組成的第一組，而一種或多種不同的糖選自由直接綴合到載體蛋白上的MenA、 MenC、MenY和MenW組成的第二組。
9.如權(quán)利要求8中所述的包含至少2種不同的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的免疫原性組合物，其中一種或多種所述糖選自由通過連接物綴合到載體蛋白上的MenA和MenC組成的第一組，一種或多種不同的糖選自由直接綴合到載體蛋白上的MenC、MenY和MenW組成的第二組。
10.如權(quán)利要求9中所述的免疫原性組合物，其包含通過連接物綴合到載體蛋白上的 MenA莢膜糖，和直接綴合到載體蛋白上的MenC莢膜糖。
11.如權(quán)利要求9中所述的免疫原性組合物，其包含通過連接物綴合到載體蛋白上的 MenC莢膜糖，和直接綴合到載體蛋白上的MenY莢膜糖。
12.如權(quán)利要求9中所述的免疫原性組合物，其包含通過連接物綴合到載體蛋白上的 MenA和MenC莢膜糖，和直接綴合到載體蛋白上的MenY和MenW莢膜糖。
13.如權(quán)利要求9中所述的免疫原性組合物，其包含通過連接物綴合到載體蛋白上的 MenA莢膜糖，和直接綴合到載體蛋白上的MenC、MenY和MenW莢膜糖。
14.如前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖均是綴合到載體蛋白上的，所述載體蛋白獨(dú)立地選自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D。
15.如前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是綴合到相同載體蛋白上的，所述載體蛋白選自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D。
16.如前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖均是綴合到TT上的。
17.如前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是分別綴合到單獨(dú)的載體蛋白上的。
18.如前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中至少一種、兩種或三種腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖綴合物是直接綴合到載體蛋白上的。
19.如權(quán)利要求18中所述的免疫原性組合物，其中MenW和/或MenY, Menff和/或 MenC, MenY和/或MenC，或者M(jìn)enW和MenC和MenY是直接綴合到載體蛋白上的。
20.如權(quán)利要求18或19中所述的免疫原性組合物，其中至少一種、兩種或三種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物是通過CDAP化學(xué)直接綴合的。
21.如權(quán)利要求1-20任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中至少一種、兩種或三種腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是通過連接物綴合到載體蛋白上的。
22.如權(quán)利要求21中所述的免疫原性組合物，其中所述連接物是雙官能的。
23.如權(quán)利要求21或22中所述的免疫原性組合物，其中所述連接物具有兩個反應(yīng)活性氨基基團(tuán)。
24.如權(quán)利要求21或22中所述的免疫原性組合物，其中所述連接物具有兩個反應(yīng)活性羧酸基團(tuán)。
25.如權(quán)利要求21或22中所述的免疫原性組合物，其中所述連接物一端具有反應(yīng)活性氨基基團(tuán)，另一端具有反應(yīng)活性羧酸基團(tuán)。
26.如權(quán)利要求21-25中所述的免疫原性組合物，其中所述連接物具有4到12個碳原子。
27.如權(quán)利要求21或22中所述的免疫原性組合物，其中所述連接物是ADH。
28.如權(quán)利要求21-27任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中通過連接物綴合的所述或各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是用CDAP化學(xué)綴合到連接物上的。
29.如權(quán)利要求21-28中所述的免疫原性組合物，其中所述載體蛋白是使用碳二亞胺化學(xué)，任選地使用EDAC，綴合到連接物上的。
30.如權(quán)利要求21- 任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中所述或各每種腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是在將載體蛋白綴合到連接物上之前綴合到連接物上的。
31.如權(quán)利要求21-30任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中MenA是通過連接物綴合到載體蛋白上的。
32.如權(quán)利要求21-31任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中MenC是通過連接物綴合到載體蛋白上的。
33.如前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其包含來自血清群A、C、W135 和Y中至少兩種的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，將所述莢膜糖綴合到載體蛋白上以產(chǎn)生腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖綴合物，其中各腦膜炎奈瑟氏球菌糖的平均尺寸均在50kDa、75kDa、 100kDa、l 10kDa、120kDa 或 130kDa 以上。
34.如權(quán)利要求33中所述的免疫原性組合物，其中各腦膜炎奈瑟氏球菌糖是天然多糖或者是用不超過XlO的因子調(diào)整過尺寸的。
35.如權(quán)利要求33或34中所述的免疫原性組合物，其中至少一種、兩種、三種或四種腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是通過微流化調(diào)整過尺寸的。
36.如權(quán)利要求33或34中所述的免疫原性組合物，其中各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是天然多糖。
37.如權(quán)利要求33或34中所述的免疫原性組合物，其中各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖是用不超過XlO的因子調(diào)整過尺寸的。
38.如權(quán)利要求33或34中所述的免疫原性組合物，其中腦膜炎奈瑟氏球菌綴合物是由一些天然多糖與用不超過XlO的因子調(diào)整過尺寸的其它糖的混合物制備的。
39.如權(quán)利要求38中所述的免疫原性組合物，其中來自血清群Y的莢膜糖是用不超過XlO的因子調(diào)整過尺寸的。
40.如權(quán)利要求38或39中所述的免疫原性組合物，其中來自血清群A和C的莢膜糖是天然多糖，而來自血清群W135和Y的糖是用不超過X 10的因子調(diào)整過尺寸的。
41.如權(quán)利要求33-40中所述的免疫原性組合物，其中各腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的平均尺寸在50kDa到300kDa或者50kDa到200kDa之間。
42.如權(quán)利要求33-41中所述的免疫原性組合物，其包含平均尺寸大于50kDa、75kDa、 IOOkDa或者平均尺寸在50-100kDa或55_90kDa或60_80kDa之間的MenA莢膜糖。
43.如權(quán)利要求33-42中所述的免疫原性組合物，其包含平均尺寸大于50kDa、75kDa、 IOOkDa 或者在 100-200kDa、100-150kDa、80-120kDa、90-110kDa、150-200kDa、120-240kDa、 140-220kDa、160-200kDa 或 190_200kDa 之間的 MenC 莢膜糖。
44.如權(quán)利要求33-43中所述的免疫原性組合物，其包含平均尺寸大于50kDa、75kDa、 IOOkDa 或者在 60-190kDa 或 70_180kDa 或 80_170kDa 或 90_160kDa 或 100_150kDa、 110-145kDa 或 120_140kDa 之間的 MenY 莢膜糖。
45.如權(quán)利要求33-44中所述的免疫原性組合物，其包平均尺寸大于50kDa、75kDa、 IOOkDa 或者在 60-190kDa 或 70_180kDa 或 80_170kDa 或 90_160kDa 或 100_150kDa、 140-180kDa、150-170kDa 或 110_140kDa 之間的 MenW 莢膜糖。
46.如前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中各糖綴合物的劑量在2 到20 μ g、3到10 μ g、4至Ij 7 μ g的糖之間，或者大約(或恰好)為5 μ g的糖。
47.如前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其進(jìn)一步包含綴合到載體蛋白上的b型流感嗜血桿菌莢膜糖(Hib)。
48.如權(quán)利要求47中所述的免疫原性組合物，其中所述b型流感嗜血桿菌莢膜糖是綴合到選自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D的載體蛋白上的。
49.如權(quán)利要求47或48中所述的免疫原性組合物，其中所述Hib糖是綴合到與至少一種、兩種、三種或全部腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖綴合物相同的載體蛋白上的。
50.如權(quán)利要求47-49中所述的免疫原性組合物，其中所述Hib糖是綴合到TT上的。
51.如權(quán)利要求47-50中所述的免疫原性組合物，其中在Hib莢膜糖綴合物中Hib與載體蛋白的比例在1 5到5 l(w/w)之間。
52.如權(quán)利要求51中所述的免疫原性組合物，其中在Hib莢膜糖綴合物中Hib與載體蛋白的比例在1 1到1 4、1 2到1 3. 5之間，或者在1 3(w/w)左右。
53.如權(quán)利要求47-52中所述的免疫原性組合物，其中所述Hib莢膜糖是通過連接物綴合到載體蛋白上的。
54.如權(quán)利要求53中所述的免疫原性組合物，其中所述連接物是雙官能的。
55.如權(quán)利要求53或M中所述的免疫原性組合物，其中所述連接物具有兩個反應(yīng)活性氨基基團(tuán)。
56.如權(quán)利要求53或M中所述的免疫原性組合物，其中所述連接物具有兩個反應(yīng)活性羧酸基團(tuán)。
57.如權(quán)利要求53或M中所述的免疫原性組合物，其中所述連接物一端具有反應(yīng)活性氨基基團(tuán)，另一端具有反應(yīng)活性羧酸基團(tuán)。
58.如權(quán)利要求53-57中所述的免疫原性組合物，其中所述連接物具有4到12個碳原子。
59.如權(quán)利要求53或M中所述的免疫原性組合物，其中所述連接物是ADH。
60.如權(quán)利要求47-59任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中所述Hib糖是使用 CNBr或CDAP綴合到載體蛋白或連接物上的。
61.如權(quán)利要求53-60中所述的免疫原性組合物，其中所述載體蛋白是使用包含碳二亞胺化學(xué)，任選地EDAC化學(xué)的方法通過連接物綴合到Hib糖上的。
62.如權(quán)利要求47-61任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其包含Hib糖綴合物和至少兩種其它的細(xì)菌糖綴合物，其中Hib綴合物以比所述至少兩種其它細(xì)菌糖綴合物的平均劑量低的劑量存在。
63.如權(quán)利要求62中所述的免疫原性組合物，其中Hib綴合物以比所述至少兩種其它細(xì)菌糖綴合物中的每一種的劑量低的劑量存在。
64.如權(quán)利要求62或63中所述的免疫原性組合物，其中所述的至少兩種其它細(xì)菌糖綴合物包含腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C莢膜糖(MenC)綴合物。
65.如權(quán)利要求62-64任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中所述的至少兩種其它細(xì)菌糖綴合物包含腦膜炎奈瑟氏球菌血清群Y莢膜糖(MenY)綴合物。
66.如權(quán)利要求62-65任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中所述的至少兩種其它細(xì)菌糖綴合物包含腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A莢膜糖(MenA)綴合物。
67.如權(quán)利要求62-66任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中所述的至少兩種其它細(xì)菌糖綴合物包含腦膜炎奈瑟氏球菌血清群W135莢膜糖(MenW)綴合物。
68.如權(quán)利要求62-67任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中所述的至少兩種其它細(xì)菌糖綴合物包含衍生自以下菌株的肺炎球菌莢膜糖，所述菌株選自血清型1、2、3、4、5、 6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F。
69.如權(quán)利要求62-68任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中所述的至少兩種其它細(xì)菌糖綴合物包含傷寒殺門氏菌Vi (S. typhi Vi)莢膜糖。
70.如權(quán)利要求62-69任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中Hib糖綴合物的劑量在 0. 1 至Ij 9 μ g，1 至Ij 5 μ g 或 2 至Ij 3 μ g 的H之間。
71.如權(quán)利要求62-70任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中所述的至少兩種其它糖綴合物中的每一種的劑量在2到20 μ g、3到10 μ g或4到7 μ g糖之間，或者在5 μ g糖左右或恰好為5yg糖。
72.如權(quán)利要求62-71任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中Hib糖綴合物的糖劑量小于90 %、75 %或60 %，或者在20 %到60 %之間或者是50 %左右的所述至少兩種其它糖綴合物的平均糖劑量。
73.如權(quán)利要求62-72任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中Hib糖綴合物的糖劑量小于90 %、75 %或60 %，或者在20-60 %之間或者是50 %左右的所述至少兩種其它糖綴合物中每一種的糖劑量。
74.如權(quán)利要求62-73任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中在Hib綴合物和在兩種或兩種以上的所述至少兩種其它細(xì)菌糖綴合物中使用了相同的載體蛋白。
75.如權(quán)利要求1-74任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其包含腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B的外膜囊制備物或莢膜糖。
76.一種疫苗，其包含如權(quán)利要求1-75任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
77.一種用于伴隨或順序給藥的免疫試劑盒，其包含兩種多價免疫原性組合物以用于在宿主內(nèi)提供保護(hù)作用從而抵抗由百日咳桿菌、破傷風(fēng)桿菌、白喉棒桿菌、流感嗜血桿菌以及腦膜炎奈瑟氏球菌所引起的疾病，所述試劑盒包含第一容器，所述第一容器中包含破傷風(fēng)類毒素(TT)，白喉類毒素(DT)，和全細(xì)胞或無細(xì)胞百日咳組分和第二容器，所述第二容器中包含如權(quán)利要求1-75任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物。
78.—種如權(quán)利要求76中所述的疫苗的制備方法，其包括將權(quán)利要求1-75任意一項(xiàng)所述的免疫原性組合物與藥學(xué)上可接受的賦形劑相混合的步驟。
79.一種使人宿主對由腦膜炎奈瑟氏球菌感染所引起的疾病具有免疫力的方法，其包括向宿主給藥以免疫保護(hù)劑量的如權(quán)利要求1-77所述的免疫原性組合物或疫苗。
80.用于治療或預(yù)防由腦膜炎奈瑟氏球菌感染所引起的疾病的如權(quán)利要求1-75中所述的免疫原性組合物。
81.如權(quán)利要求1-75中所述的免疫原性組合物在制備用于治療或預(yù)防由腦膜炎奈瑟氏球菌感染所引起疾病的藥物中的用途。
82.一種包含至少2種分別綴合到同類載體蛋白上的不同糖的免疫原性組合物，其中一種或多種糖是在以1 2-1 5之間的糖蛋白比例(w/w)綴合到載體蛋白上的，一種或多種不同的糖是以5 1-1 1.99之間的糖蛋白比例(w/w)綴合到蛋白載體上的。
83.如權(quán)利要求82中所述的免疫原性組合物，其中一種或多種糖是通過蛋白載體上的第一類化學(xué)基團(tuán)綴合到載體蛋白上的，而一種或多種糖是通過蛋白載體上的第二類化學(xué)基團(tuán)綴合到載體蛋白上。CN 102526723 A
84.如權(quán)利要求83中所述的免疫原性組合物，其中通過蛋白載體上的第一類化學(xué)基團(tuán)綴合到載體蛋白上的一種或多種糖與通過蛋白載體上的第二類化學(xué)基團(tuán)綴合到載體蛋白上的一種或多種糖不同。
85.如權(quán)利要求83或84中所述的免疫原性組合物，其中一種或多種糖是通過蛋白載體上的羧基基團(tuán)綴合到載體蛋白上的，一種或多種糖通過蛋白載體上的氨基基團(tuán)綴合到載體蛋白上的。
86.如權(quán)利要求83-85中所述的免疫原性組合物，其中蛋白載體上的第一和第二類化學(xué)基團(tuán)存在于載體蛋白上的單獨(dú)的B和/或T細(xì)胞抗原表位上。
87.如權(quán)利要求82-86中所述的免疫原性組合物，其中所述糖選自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A莢膜糖(MenA)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C莢膜糖(MenC)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群Y莢膜糖(MenY)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群W莢膜糖(MenW)、B群鏈球菌I群莢膜糖、 B群鏈球菌II群莢膜糖、B群鏈球菌III群莢膜糖、B群鏈球菌IV群莢膜糖、B群鏈球菌V 群莢膜糖、金黃色葡萄球菌5型莢膜糖、金黃色葡萄球菌8型莢膜糖、來自傷寒殺門氏菌的 Vi糖、腦膜炎奈瑟氏球菌LPS (例如L3和/或L2)、卡他莫拉菌LPS、流感嗜血桿菌LPS和來自任意莢膜肺炎球菌糖的糖例如來自血清型:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、 12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 或 33F。
88.如權(quán)利要求82-87中所述的免疫原性組合物，其中載體蛋白選自TT、DT、CRM197、 TT的C片段和蛋白D。
89.如權(quán)利要求82-88中所述的免疫原性組合物，其中載體蛋白是TT。
90.如權(quán)利要求82-89中所述的免疫原性組合物，其包含至少2種不同的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，其中一種或多種所述糖選自由綴合到載體蛋白上的MenA和MenC組成的第一組，其中糖蛋白的比例(w/V)在1 2-1 5之間，而一種或多種不同的糖選自由綴合到載體蛋白上的MenC、MenY和MenW組成的第二組，其中糖蛋白的比例(w/w)在 5:1-1: 1.99 之間。
91.如權(quán)利要求90中所述的免疫原性組合物，其中MenW糖與載體蛋白的比例在 5:1-1: 1.99,2 1-1 1.99,1. 5 1-1 1.8,1 1-1 1. 7,1 1.2-1 1.6 或 1 1.4-1 1.5(w/w)之間。
92.如權(quán)利要求90或91中所述的免疫原性組合物，其中MenY糖與載體蛋白的比例在 5:1-1: 1.99,2 1-1 1.99,1. 5 1-1 1.9,1 1-1 1.8,1 1.1-1 1.6 或 1 1.3-1 1.4(w/w)之間。
93.如權(quán)利要求90-92任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中MenA糖與載體蛋白的比例在 1 2-1 5、1 2.4-1 4、1 2.7-1 3. 5 或 1 2.9-1 3. l(w/w)之間。
94.如權(quán)利要求90-93任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中MenC糖與載體蛋白的比例在 5 1-1 1.99,2 1-1 1.99,1. 5 1-1 1.8,1. 3 1-1 1.6、 1.2 1-1 1.4 或 1.1 1-1 1.2(w/w)之間。
95.如權(quán)利要求90-94任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中MenC糖與載體蛋白的比例在 1 2-1 5、1 2.5-1 4. 5、1 2. 7-1 4. 3、1 3-1 4 或 1 3.3-1 3. 5 (w/ w)之間。
96.如權(quán)利要求90-95中所述的免疫原性組合物，其包含至少2種不同的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖，其中一種或多種糖選自由MenA和MenC組成的第一組，其中所述MenA和 MenC是通過蛋白載體上的第一類化學(xué)基團(tuán)綴合到載體蛋白上的，一種或多種不同的糖選自由MenC、MenY和MenW組成的第二組，其中所述MenC、MenY和MenW是通過蛋白載體上的第二類化學(xué)基團(tuán)綴合到載體蛋白上的。
97.如權(quán)利要求96中所述的免疫原性組合物，其中第一類化學(xué)基團(tuán)是蛋白載體上的羧基基團(tuán)，第二類化學(xué)基團(tuán)是蛋白載體上的氨基基團(tuán)。
98.如權(quán)利要求96或97中所述的免疫原性組合物，其包含通過第一類化學(xué)基團(tuán)綴合的 MenA和通過第二類化學(xué)基團(tuán)綴合的MenC。
99.如權(quán)利要求96-98中所述的免疫原性組合物，其包含通過第一類化學(xué)基團(tuán)綴合的 MenC和通過第二化類學(xué)基團(tuán)綴合的MenY。
100.如權(quán)利要求96-99中所述的免疫原性組合物，其包含通過第一類化學(xué)基團(tuán)綴合的 MenA和通過第二類化學(xué)基團(tuán)綴合的MenC、MenY和MenW。
101.如權(quán)利要求96-99中所述的免疫原性組合物，其包含通過第一類化學(xué)基團(tuán)綴合的 MenA和MenC以及通過第二類化學(xué)基團(tuán)綴合的MenY和MenW。
102.如權(quán)利要求96-101中所述的免疫原性組合物，其進(jìn)一步包含綴合到載體蛋白上的來自b型流感嗜血桿菌的莢膜糖(Hib)。
103.如權(quán)利要求102中所述的免疫原性組合物，其中Hib是綴合到與腦膜炎奈瑟氏球菌糖同類的載體蛋白上的。
104.如權(quán)利要求103中所述的免疫原性組合物，其中Hib是通過第一或第二類化學(xué)基團(tuán)綴合到載體蛋白上的。
105.如權(quán)利要求82-104中所述的免疫原性組合物，其中以1 2-1 5之間的糖蛋白比例(w/w)綴合到載體蛋白上的一種或多種糖(例如MenA和/或MenC)是通過連接物綴合的。
106.如權(quán)利要求105中所述的免疫原性組合物，其中所述連接物是雙官能的。
107.如權(quán)利要求105或106中所述的免疫原性組合物，其中所述連接物具有4到12個碳原子。
108.如權(quán)利要求105-107中所述的免疫原性組合物，其中所述連接物具有兩個反應(yīng)活性氨基基團(tuán)。
109.如權(quán)利要求105-107中所述的免疫原性組合物，其中所述連接物具有兩個反應(yīng)活性羧酸基團(tuán)。
110.如權(quán)利要求105-107中所述的免疫原性組合物，其中所述連接物一端具反應(yīng)活性氨基基團(tuán)，另一端具有反應(yīng)活性羧酸基團(tuán)。
111.如權(quán)利要求105-108中所述的免疫原性組合物，其中所述連接物是ADH。
112.如權(quán)利要求105-111中所述的免疫原性組合物，其中通過連接物綴合的各莢膜糖是用CDAP化學(xué)綴合到連接物上的。
113.如權(quán)利要求105-112中所述的免疫原性組合物，其中載體蛋白是使用碳二亞胺化學(xué)，任選地使用EDAC，綴合到連接物上的。
114.如權(quán)利要求105-113中所述的免疫原性組合物，其中所述或各莢膜糖是在將載體蛋白綴合到連接物上之前綴合到連接物上的，或者所述連接物是在其綴合到載體蛋白上之前綴合到糖上的。
115.如權(quán)利要求82-114中所述的免疫原性組合物，其中以5 1-1 1.99之間的糖 蛋白比例(w/w)綴合到載體蛋白上的一種或多種糖(例如MenY、MenW和/或MenC)是直接綴合的。
116.如權(quán)利要求82-115中所述的免疫原性組合物，其是如權(quán)利要求1-75所述的免疫原性組合物。
117.—種包含至少2種分別綴合到同類載體蛋白上的不同糖的免疫原性組合物，其中一種或多種糖是通過蛋白載體上的第一類化學(xué)基團(tuán)綴合到蛋白載體上的，其中糖蛋白比例(w/w)在1 2-1 5之間，和一種或多種不同的糖是通過蛋白載體上的第二類化學(xué)基團(tuán)綴合到蛋白載體上的，其中糖蛋白比例(w/V)在5 1-1 1.99之間。
118.如權(quán)利要求117中所述的免疫原性組合物，其中通過蛋白載體上的第一類化學(xué)基團(tuán)綴合到載體蛋白上的一種或多種糖與通過蛋白載體上的第二類化學(xué)基團(tuán)綴合到載體蛋白上的一種或多種糖不同。
119.如權(quán)利要求117或118中所述的免疫原性組合物，其中一種或多種糖是通過蛋白載體上的羧基基團(tuán)綴合到載體蛋白上，一種或多種糖是通過蛋白載體上的氨基基團(tuán)綴合到載體蛋白上。
120.如權(quán)利要求117-118任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中蛋白載體上的第一和第二類化學(xué)基團(tuán)存在于載體蛋白上的單獨(dú)的B和/或T細(xì)胞抗原表位上。
121.如權(quán)利要求117-118任意一項(xiàng)中所述的免疫原性組合物，其中所述糖選自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A莢膜糖(MenA)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C莢膜糖(MenC)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群Y莢膜糖(MenY)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群W莢膜糖(MenW)、B群鏈球菌 I群莢膜糖、B群鏈球菌II群莢膜糖、B群鏈球菌III群莢膜糖、B群鏈球菌IV群莢膜糖、B 群鏈球菌V群莢膜糖、金黃色葡萄球菌5型莢膜糖、金黃色葡萄球菌8型莢膜糖、來自傷寒殺門氏菌的Vi糖、腦膜炎奈瑟氏球菌LPS、卡他莫拉菌LPS、流感嗜血桿菌LPS和來自任意莢膜肺炎球菌糖的糖。
122.如權(quán)利要求121所述的免疫原性組合物，其中所述糖選自來自血清型1、2、3、4、 5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 或 33F 的莢膜肺炎球菌糖的糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了免疫原性組合物。本申請公開了一種包含至少2種不同腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的免疫原性組合物，其中一種或多種所述糖選自由綴合到蛋白載體上的MenA、MenC、MenY和MenW組成的第一組，其中糖∶蛋白的比例(w/w)在1∶2-1∶5之間，一種或多種不同的糖選自由綴合到蛋白載體上的MenA、MenC、MenY和MenW組成的第二組，其中糖∶蛋白的比例(w/w)在5∶1-1∶1.99之間。
文檔編號A61K39/116GK102526723SQ201210028358
公開日2012年7月4日 申請日期2006年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月27日
發(fā)明者C·卡皮奧, D·布特里奧, J·普爾曼, P·德內(nèi)爾, P·迪維維耶, R·L·比曼斯 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司