專利名稱：一種缺損修復(fù)材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種缺損修復(fù)材料，屬于生物材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
組織缺損是指由于創(chuàng)傷或疾病所引起的組織細(xì)胞壞死，進(jìn)而導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)連續(xù)性喪失或功能障礙的病理表現(xiàn)。組織缺損包括尿道、膀胱、血管、膽道、腸道、肌腱、神經(jīng)、骨、軟骨、肌肉、皮膚或者食管缺損。組織缺損及修復(fù)過程中纖維組織形成期和瘢痕形成期會(huì)引起身體持久病變，給患者身心帶來極大損傷。理想的組織缺損修復(fù)是使組織恢復(fù)原有的結(jié)構(gòu)和功能，盡管組織缺損的修復(fù)與再生目前在基礎(chǔ)研究和臨床治療等方面均取得了長足的進(jìn)展，但是離理想的組織缺損修復(fù)仍相差較遠(yuǎn)。如，食管是長管狀的器官，是消化道最狹窄的部分。分為頸、胸、腹(亦即上、中、 下)三段。頸段長約5厘米，是由食管開始端至頸靜脈切跡平面的一段，胸段長約15厘米， 上接食管頸段，下至橫膈膜肌食管裂孔，腹段僅1 3厘米，上接胸段，下接胃賁門部，與肝左葉后緣相鄰，其主要的功能是通過蠕動(dòng)把食團(tuán)輸送到胃里。食管癌是常見的消化道腫瘤。 目前，手術(shù)切除腫瘤是食管癌最重要與首選的治療方式，對于先天性食管閉鎖，返流性食管炎，化學(xué)性燒灼傷等造成的食管瘢痕和狹窄，也往往需要手術(shù)治療，手術(shù)切除后的食管缺損往往通過食管形成術(shù)修復(fù)。自Berman等在1952年率先采用特制的聚乙烯管代替食管以修復(fù)缺損以來，至今人工食管的研究已經(jīng)有50多年的歷史。國內(nèi)從1983年開始，先后用各種人工材料進(jìn)行人工食管的研究。早期主要使用不可降解高分子材料制成的人工食管，但其與受體組織相容性差，受體血管、組織無法長入、人工食管內(nèi)腔不能完全內(nèi)皮化，往往會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，如感染、吻合ロ瘺、吻合ロ狹窄等，并且由于人工食管無法與受體組織完全愈合而得到生物學(xué)固定，最終不可避免發(fā)生脫落。后來又采用鎳鈦合金、硅橡膠等，均未達(dá)到理想的效果。去細(xì)胞基質(zhì)的天然材料是機(jī)體組織經(jīng)過機(jī)械及化學(xué)處理而去細(xì)胞的生物支架，它具有良好的生物相容性，天然的三維立體多孔結(jié)構(gòu)，可降解吸收等特點(diǎn)，可能是較理想的修復(fù)材料。小腸黏膜下層(small intestinal submucosa, SIS)是ー種天然的細(xì)胞外基質(zhì)類生物材料，通常由豬小腸制備。SIS主要含有膠原、氨基多糖、糖蛋白等成分，并且含有多種生長因子，對組織的修復(fù)重建及細(xì)胞的生長有重要作用，如成纖維細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子和血管內(nèi)皮生長因子等，可通過與細(xì)胞表面的多種受體作用后介導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而對上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞等多種細(xì)胞具有促進(jìn)生長、分化的作用，其作為組織工程的支架材料廣泛應(yīng)用于尿道、膀胱、血管、肌腱、神經(jīng)、骨等多種組織缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究。然而，研究表明用單純小腸黏膜下層SIS用于組織缺損修復(fù)，存在上皮化不完全，肌肉再生和血管再生不理想等缺陷。尋找簡便、安全、有效的組織缺損修復(fù)材料已成為治療組織缺損疾患、提高病人生活質(zhì)量的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了ー種新的、更加有效的缺損修復(fù)材料。本發(fā)明提供了ー種缺損修復(fù)材料，它包括小腸黏膜下層和銅元素，每Ig小腸黏膜下層中含有0. 005mg 5mg銅元素。優(yōu)選地，每Ig小腸黏膜下層中含有0. 005mg 1. 460mg 銅元素。優(yōu)選地，每Ig小腸黏膜下層中含有0.005mg 0.766mg銅元素。進(jìn)ー步優(yōu)選地， 每Ig小腸黏膜下層中含有0. 562mg 0. 766mg銅元素。所述缺損修復(fù)材料是由如下方法制備(1)取小腸黏膜下層和含有銅離子的溶液，將小腸黏膜下層浸泡在含有銅離子的溶液中8 16h，每Ig小腸黏膜下層浸泡在含有5 μ M 100 μ M銅離子的溶液中；(2)凍干，消毒滅菌。其中，所述步驟(1)中含有銅離子的溶液中銅離子的濃度為25μΜ。本發(fā)明還提供了中制備前述缺損修復(fù)材料的方法，它包括如下步驟(1)取小腸黏膜下層和含有銅離子的溶液，將小腸黏膜下層浸泡在含有銅離子的溶液中8 16h，每Ig小腸黏膜下層浸泡在含有5 μ M 100 μ M銅離子的溶液中；(2)凍干，消毒滅菌。其中，所述步驟(1)中含有銅離子的溶液中銅離子的濃度為25μΜ。本發(fā)明還提供了前述缺損修復(fù)材料在制備修復(fù)組織缺損的藥物中的用途。其中，所述組織缺損為尿道、膀胱、血管、膽道、腸道、肌腱、神經(jīng)、骨、軟骨、肌肉、皮膚或者食管缺損。本發(fā)明提供的缺損修復(fù)材料藥效良好，可加快組織修復(fù)的速度，降低組織修復(fù)需要的時(shí)間，解決了現(xiàn)有修復(fù)材料無法與受體組織完全愈合的問題，提高臨床病人的存活率， 且制備方法簡便，具有廣闊的應(yīng)用前景。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)ー步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖ISIS的光鏡和掃描電鏡檢測結(jié)果。其中，A 未凍干的SIS呈半透明狀膜； B 凍干后的SIS成白色紙狀；C 處理后SIS表面未見細(xì)胞殘留(ΗΕΧ200) ；D 處理后的 SIS(SEMX200)，光鏡以及掃描電鏡下觀察到的處理后的SIS未見細(xì)胞殘留。圖2 CuSO4溶液濃度與復(fù)合材料中Cu元素含量關(guān)系圖。圖3不同濃度的銅對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況的影響。圖4 5μΜ CuSO4作用下血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長曲線。圖5使用5 μ M的CuSO4對HUVEC處理48小時(shí)后，MTT法檢測5 μ M的CuSO4處理 48小時(shí)后對HUVEC増殖情況的影響，數(shù)值以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示(*，表示與Control組有顯著性差異P < 0. 05)，以不添加CuSO4的Control組作為100%，増殖活性百分比處理。圖6使用5 μ M的CuSO4對HUVEC處理48小時(shí)后，3H-TdR滲入法檢測5 μ M的CuSO4處理48小時(shí)后對HUVEC増殖情況的影響，數(shù)值以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示(*，表示與Control 組有顯著性差異P < 0. 05)，以不添加CuSO4的Control組作為100%，増殖活性百分比處理。圖7使用5 μ M的CuSO4對HUVEC處理48小時(shí)后，細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測5 μ M的CuSO4 處理48小時(shí)后對HUVEC増殖情況的影響，數(shù)值以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示(*，表示與Control 組有顯著性差異P < 0. 05)，以不添加CuSO4的Control組作為100%，増殖活性百分比處理。圖8流式細(xì)胞術(shù)檢測5 μ M的CuSO4處理48小時(shí)后對HUVEC細(xì)胞周期的影響。數(shù)值以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示(*，表示與其對應(yīng)相同周期的Control組百分比有顯著性差異P < 0. 05)圖 9SIS, SIS+5Cu(5 μ M 的 CuSO4)和 SIS+25Cu(25 μ M 的 CuSO4)組動(dòng)物體重。(* 表示與SIS組相比，P < 0. 01, #表示與SIS+5CU相比，P < 0. 05)圖10術(shù)后8周三組鋇餐檢測結(jié)果。A為SIS組，B為SIS+5Cu組，C為SIS+25Cu， 右箭頭ヰ示食管缺損修復(fù)處。 圖11術(shù)后8周三組大體標(biāo)本觀察結(jié)果。A為SIS組，B為SIS+5Cu組，C為SIS+25Cu。圖12術(shù)后8周SIS組標(biāo)本組織學(xué)結(jié)果Al SIS組Masson，s trichrome染色示部分上皮化(下箭頭丨)(X40)A2 SIS組HE染色示部分上皮化(下箭頭丨)(X40)A3 SIS組HE染色示部分上皮化(下箭頭丨)及大量炎細(xì)胞(上箭頭丨)(X200)。圖13術(shù)后8周SIS+5CU組標(biāo)本組織學(xué)結(jié)果Bl SIS+5Cu組Masson，s trichrome染色示完全上皮化(下箭頭丨)(X40)B2 SIS+5CU組HE染色示完全上皮化(下箭頭丨)(X40)B3 SIS+5CU組HE染色示完全上皮化(下箭頭丨)，上皮層數(shù)達(dá)8_10層(X 200)。圖14術(shù)后8周SIS+25CU組標(biāo)本組織學(xué)結(jié)果Cl SIS+25Cu 組 Masson，s trichrome 染色示完全上皮化(下箭頭丨)(X40)C2 SIS+25CU組HE染色示完全上皮化(下箭頭丨)(X40)C3 SIS+25CU組HE染色示完全上皮化(下箭頭丨)(X2OO)。圖15術(shù)后8周三組標(biāo)本炎細(xì)胞計(jì)數(shù)(#P < 0. 01，*P < 0. 05)。圖16術(shù)后8周SIS組標(biāo)本組織學(xué)結(jié)果El SIS組HE染色可見血管形成(下箭頭丨)(X200)E2 SIS組Masson，s trichrome染色，可見有波浪狀膠原形成(上箭頭個(gè)) (X200)。圖17術(shù)后8周SIS+5CU組標(biāo)本組織學(xué)結(jié)果Fl SIS+5CU組HE染色示肌島形成(三角形箭頭▲ ) (X200)F2 SIS+5CU組Masson，s trichrome染色示肌島形成(三角形箭頭▲)，肌島被膠原包裹(右箭頭ヰ)(X2OO)。圖18術(shù)后8周SIS+25CU組標(biāo)本組織學(xué)結(jié)果Gl SIS+25CU組HE染色示肌島形成(三角形箭頭▲ ) (X2OO)G2 SIS+25CU組Masson，s trichrome染色示肌島形成(三角形箭頭▲)，肌島被膠原包裹(右箭頭ヰ)(X2OO)。圖19三組免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果Al SIS組α -SMA染色血管平滑肌陽性(下箭頭I )Bl SIS+5CU組α -SMA染色血管平滑肌陽性(下箭頭I )Cl SIS+25CU組α -SMA染色血管平滑肌陽性(下箭頭I )圖20三組免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果Α2 SIS組⑶31染色血管內(nèi)皮陽性(下箭頭I )Β2 SIS+5CU組CD31染色血管內(nèi)皮陽性(下箭頭I )C2 SIS+25CU組CD31染色血管內(nèi)皮陽性(下箭頭丨)。圖21三組免疫組織化學(xué)染色血管計(jì)數(shù)(#Ρ < 0. 01，*Ρ < 0. 05)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明缺損修復(fù)材料的制備1、制備方法(一 )、小腸黏膜下層SIS的制備(I)SIS 的制備清洗整理取屠宰后半個(gè)小時(shí)的新鮮豬小腸，用水沖去小腸內(nèi)容物，翻轉(zhuǎn)小腸，加入鹽揉搓后用水反復(fù)沖洗3次，用手木刀剖開小腸，然后剪成15厘米長的腸段。分離出SIS 用壓舌板刮除肌層，漿膜層，置于生理鹽水中4°C保存過夜。脫脂用去離子水漂洗干凈后用紗布濾干水。浸入三氯甲烷甲醛1 1中，置于通風(fēng)櫥里4個(gè)小吋，平均2小時(shí)換一次液，并且每半個(gè)小時(shí)攪拌一次，每次濾干之前的液體再浸入到新的脫脂液中。脫細(xì)胞將脫脂后的SIS用去離子水漂洗20次，反復(fù)清洗，漂至無味。然后放入濃度為0. 25%的胰酶液里，4°C脫細(xì)胞處理過夜。用去離子水漂洗10次后用0. 5%的SDS處理至少4個(gè)小吋，清洗后凍干。(2) SIS的檢測染色、掃描電鏡通過HE染色和掃描電鏡觀察有無殘留的細(xì)胞，如圖1所示，說明制備好的SIS已基本去除細(xì)胞，且對其超微結(jié)構(gòu)和膠原纖維的熱穩(wěn)定性未造成損害。( ニ)、本發(fā)明缺損修復(fù)材料的制備取步驟(一)制備的SIS或者市售的SIS，按每克SIS重量浸泡在1升5 μ Μ、25 μ M、 50 μ Μ、75 μ Μ、100 μ M的CuSO4溶液中l(wèi) ir，真空凍干機(jī)凍干，裁剪成所需大小，包裝，環(huán)氧乙烷消毒、滅菌。2、檢測采用原子吸收光譜法測定復(fù)合材料上Cu的含量各樣品消解罐在使用前用10%硝酸浸泡M小吋，去離子水沖洗干凈，充分潤洗干凈后烘干，將烘干的各膠條放入各個(gè)消解罐中，各加入6mlHN03(優(yōu)級純)組裝上各罐放入微波消解儀中。消解條件6^00W，1900C,15atm, 5min消解結(jié)束后，待溫度降到50攝氏度以下，壓カ降到O.fetm以下后，取出消解罐，在通風(fēng)櫥中擰開罐側(cè)邊螺絲放氣，片刻后再擰松頂絲，取出內(nèi)罐。將罐中的HNO3消解液倒入 25ml容量瓶中，用少量去離子水沖洗內(nèi)罐、漏斗并入容量瓶中。用去離子水定容即可。
AAS測定方法及儀器條件
表1. AAS測銅儀器條件選擇
權(quán)利要求
1.ー種缺損修復(fù)材料，其特征在于它包括小腸黏膜下層和銅元素，每Ig小腸黏膜下層中含有0. 005mg 5mg銅元素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的材料，其特征在于每Ig小腸黏膜下層中含有0.005mg 1. 460mg銅元素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的材料，其特征在于每Ig小腸黏膜下層中含有0.005mg 0. 766mg銅元素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的材料，其特征在于每Ig小腸黏膜下層中含有0.562mg 0. 766mg銅元素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的材料，其特征在于它是由如下方法制備(1)取小腸黏膜下層和含有銅離子的溶液，將小腸黏膜下層浸泡在含有銅離子的溶液中8 16h，每Ig小腸黏膜下層浸泡在含有5 μ M 100 μ M銅離子的溶液中；(2)凍干，消毒滅菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的材料，其特征在干步驟(1)所述含有銅離子的溶液中銅離子的濃度為25 μ Μ。
7.ー種制備權(quán)利要求1 6任意ー項(xiàng)所述的缺損修復(fù)材料的方法，其特征在于它包括如下步驟(1)取小腸黏膜下層和含有銅離子的溶液，將小腸黏膜下層浸泡在含有銅離子的溶液中8 16h，每Ig小腸黏膜下層浸泡在含有5 μ M 100 μ M銅離子的溶液中；(2)凍干，消毒滅菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在干步驟(1)所述含有銅離子的溶液中銅離子的濃度為25 μ Μ。
9.權(quán)利要求1 6任意ー項(xiàng)所述的缺損修復(fù)材料在制備修復(fù)組織缺損的藥物中的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于所述組織缺損為尿道、膀胱、血管、膽道、 腸道、肌腱、神經(jīng)、骨、軟骨、肌肉、皮膚或者食管缺損。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種缺損修復(fù)材料，它包括小腸黏膜下層和銅元素，每1g小腸黏膜下層中含有0.005mg～5mg銅元素。還提供了該缺損修復(fù)材料的制備方法以及該缺損修復(fù)材料在制備修復(fù)組織缺損的藥物中的用途。本發(fā)明提供的缺損修復(fù)材料解決了現(xiàn)有修復(fù)材料無法與受體組織完全愈合的問題，具有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號A61L27/04GK102526804SQ201210056999
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月6日
發(fā)明者康裕建, 羅靜聰, 解慧琪 申請人:四川大學(xué)華西醫(yī)院