專利名稱：抗-kdr抗體和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及抗-VEGF受體2(VEGFR2 ;又稱為含激酶插入?yún)^(qū)受體、或KDR)抗體、組合物、及其使用方法。這些抗體可用于例如治療和抑制各種疾患的方法中，所述疾患包括年齡-相關(guān)的黃斑變性(AMD)、糖尿病、和缺血性視網(wǎng)膜病變、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、和各種腫瘤疾病(包括腎細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性胃或胃食管連接部腺癌、乳癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、黑素瘤、和復(fù)發(fā)性多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、白血病和實體瘤)。
背景技術(shù)：
VEGFR2/KDR是原發(fā)性血管生成受體，以及結(jié)合VEGF亞型A、C、D和E，并且對于內(nèi)皮細(xì)胞分化、以及VEGF的促絲裂作用、血管生成作用和滲透性-增強(qiáng)(滲透性-增強(qiáng))作用VEGFR2/KDR為重要的?？?KDR抗體可預(yù)防所有已知VEGF亞型與VEGFR2/KDR結(jié)合和開始信號傳遞。此外，因為腫瘤分泌更多VEGF的分子，而受體的數(shù)目仍然相對恒定，即使在非常高水平的VEGF亞型的存在下，靶向受體增加完全抑制信號的可能性。血管生成血管生成(從現(xiàn)存的脈管系統(tǒng)中新血管的形成)是嚴(yán)格控制的事件，并且對于正常生理(例如胚胎發(fā)育、卵泡發(fā)育、傷口復(fù)原、以及諸如腫瘤生長和進(jìn)展(1，2)的病理病癥)
起著重要作用。原發(fā)性腫瘤的生長和新陳代謝取決于新血管的形成。在沒有新血管形成的情況下，腫瘤會壞死或細(xì)胞凋亡和/或不能生長超過2-3mm3的尺寸(3)。腫瘤血管生成包括多個過程，包括內(nèi)皮細(xì)胞激活、增殖、遷移、和被特定的血管生長因子觸發(fā)的從先前存在血管中組織滲透，所述血管生長因子通過腫瘤細(xì)胞和周圍基質(zhì)(1-4)產(chǎn)生。VEGF 和 VEGF 受體已經(jīng)鑒定幾種生長因子為可能的血管生長的調(diào)節(jié)劑(5)。在這些因子中，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體已經(jīng)顯示對于腫瘤血管生成(6-9)起著重要作用。VEGF是具有強(qiáng)有利的血管生成的、促有絲分裂的、和血管滲透-增強(qiáng)活性(10，11)的均二聚的34-42kDa肝素-結(jié)合糖蛋白。VEGF調(diào)節(jié)在成年人生命(12，13)的胚胎發(fā)育和血管生成的過程中血管生成。VEGF家族成員包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGFUPVEGF-E0通過VEGF受體(VEGFR) VEGF結(jié)合和介導(dǎo)活性。有3種VEGFR，包括VEGFRl (Flt-1)、VEGFR2(Flk-1/KDR)和 VEGFR3(14-16)。在基因敲除實驗(17-18)中已經(jīng)清晰地證實在血管形成中VEGF和VEGF受體的生理重要性。VEGFRl酪氨酸激酶具有對于激酶活性所需要的保守的基序。然而，對VEGF-A應(yīng)答的VEGFRl的磷酸化的水平是低的(37，38)。VEGFR-1的功能未較好定義，它可作用虛擬/誘傅受體(dummy/decoy receptor)以從VEGFR-2結(jié)合中螯合VEGF和調(diào)節(jié)VEGFR-2信號。已經(jīng)顯示VEGFR-3可介導(dǎo)應(yīng)答VEGF-C和VEGF-D的淋巴管生成。VEGFR2/KDR是原發(fā)性血管生成受體，以及結(jié)合VEGF亞型A、C、D和E，并且對于內(nèi)皮細(xì)胞分化和有絲分裂發(fā)生它是重要的。KDR的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)VEGFR是受體酪氨酸激酶，并且屬于作為I3DGF和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)的受體的相同家族。VEGFR2/KDR是在胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、和通過激酶插入分成兩個細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中由個免疫球蛋白樣的環(huán)組成的200kDa糖蛋白。第二和第三免疫球蛋白樣的環(huán)是對于VEGF的高-親合力配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，然而第一和第四免疫球蛋白樣的環(huán)分別調(diào)節(jié)配體結(jié)合和受體二聚化。與對于VEGFRl的25pM的Kd相比，VEGF使用75_250pM的Kd來結(jié)合KDR。KDR主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞表面。還在造血細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)、和一些惡性細(xì)胞的細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)KDR。KDR是在發(fā)展的血管生成和血細(xì)胞生成中主要受體，和是VEGF的促有絲分裂的、血管生成的和滲透性-增強(qiáng)作用的主要的介體。VEGFR2-/-敲除小鼠顯示在ES.5-9.5下具有缺陷性血-島形成和血管生成的胚胎致死率(41)。生理上，VEGF與KDR的結(jié)合導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞激活、增殖、遷移、侵襲和存活。一旦與VEGF結(jié)合時，KDR受體二聚化，這導(dǎo)致激酶結(jié)構(gòu)域的激活和KDR受體信號傳遞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。類似許多其他受體酪氨酸激酶，導(dǎo)致血管生成的主要的細(xì)胞內(nèi)信號傳遞途徑包 括MAPK和PI3激酶激活。作為分子靶用于抗體治療的KDRVEGFR2/VEGF軸是在腫瘤血管生成中主要途徑。多個研究已經(jīng)顯示:VEGF和KDR的過表達(dá)與在人惡性腫瘤￠)中侵襲和轉(zhuǎn)移強(qiáng)烈相關(guān)。VEGF受體與發(fā)生在許多人實體瘤(包括膀胱(21)、乳房(22、23)、直腸(24、25)、胃腸(26)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤(12、27)、腎臟(28)、黑素瘤(29)、和成神經(jīng)細(xì)胞瘤(30))中血管生成相關(guān)。在腫瘤血管生成中KDR的重要作用直接證實在研究中，其中顯性-陰性KDR受體的表達(dá)導(dǎo)致在無胸腺小鼠(31)中減少的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂發(fā)生和皮下神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤的生長抑制。其他研究使用中和可溶性VEGF受體以及使用包括小分子酪氨酸激酶抑制劑(TKI)和KDR-特異性抗體的KDR抑制劑來證實該作用。 除了它對于腫瘤血管生成的作用外，在諸如白血病細(xì)胞的一些腫瘤細(xì)胞上還發(fā)現(xiàn)KDR，并且通過刺激白血病生長(42，43)的自分泌環(huán)KDR可直接介導(dǎo)腫瘤發(fā)生。KDR信號傳遞的抑制能夠減少血管生成和延遲腫瘤生長(35，36)。靶向KDR的大多數(shù)目前治療是小-分子酪氨酸激酶抑制劑(TKI)。TKI干擾ATP或其他底物與酪氨酸激酶的結(jié)合，以及破壞激酶催化活性。所有迄今開發(fā)的TKI (類似舒尼替尼)與KDR激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合部位可逆地結(jié)合。在各種類型的腫瘤(12，19)中VEGF在高水平下表達(dá)，以及新近發(fā)育的毛細(xì)血管被聚集在VEGF-產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞(12)周圍。在含氧量低的條件(與快速生長的腫瘤(20)相關(guān)的那些條件)下強(qiáng)烈上調(diào)VEGF表達(dá)。通過諸如Avastin (33，34)的抗體中和VEGF是臨床批準(zhǔn)的治療，從而抑制癌癥或諸如AMD的其他血管生成疾病。然而，甚至當(dāng)聯(lián)合化學(xué)治療給予時已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對VEGF阻斷的抵抗。該抵抗可以與重塑的脈管系統(tǒng)和其他生成血管因子的增加的表達(dá)相關(guān)。就其本身而論，本領(lǐng)域保留需求對于用于抑制癌癥和與血管生成相關(guān)的其他疾病的改善的組合物和方法。盡管TKI和抗-KDR抗體能夠抑制KDR-介導(dǎo)的血管生成，但是抗體途徑的優(yōu)勢超過TKI。相對于TKI，抗-KDR抗體是更加特異的KDR靶向劑(即，它不會抑制其他的VEGF受體)。因為它的高特異性，抗-KDR抗體能夠限制和/或避免通過更低特異性TKI (44)導(dǎo)致的脫祀效應(yīng)(off-target effect)和毒性。在各種類型的腫瘤(12，19)中VEGF在高水平下表達(dá)，以及新近發(fā)育的毛細(xì)血管被聚集在VEGF-產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞(12)周圍。在含氧量低的條件(與快速生長的腫瘤(20)相關(guān)的那些條件)下強(qiáng)烈上調(diào)VEGF表達(dá)。通過諸如Avastin (33，34)的抗體中和VEGF是臨床批準(zhǔn)的治療，從而抑制癌癥或諸如AMD的其他血管生成疾病。然而，甚至當(dāng)聯(lián)合化學(xué)治療給予時已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對VEGF阻斷的抗性。該抗性可以與重塑的脈管系統(tǒng)和其他生成血管因子的增加的表達(dá)相關(guān)。相對于僅結(jié)合配體之一(VEGF-A)的Avastin，預(yù)期抗-KDR抗體預(yù)防所有已知的VEGF與VEGFR2/KDR的結(jié)合。相比與僅阻斷VEGF-A，這可具有對于腫瘤血管生成的更意義深遠(yuǎn)的抑制作用。可能的是，在Avastin抗性的情況下使用抗-KDR抗體的治療可以為有效的。靶向KDR超過VEGF的潛在優(yōu)勢概述在表I中。表1.靶向KDR的抗體治療超過VEGF的優(yōu)勢
超過抗-VEGF抗體的優(yōu)勢__機(jī)制/原因_
需要更少的抗體以達(dá)到I)在胂瘤中VEGF的過表達(dá)/豐富的生產(chǎn)VEGF-KDR途徑的有效抑制 2)與來自腫瘤和癌癥-相關(guān)的基質(zhì)的VEGF
相比，在內(nèi)皮細(xì)胞上KDR表達(dá)更加恒定
通過幾種VEGF配體來特異通過相關(guān)的配體(VEGF-A, E, C, D^-KDR性阻斷KDR途徑的激活抗體選擇性阻斷KDR信號傳遞的激活
為用于更有效的抑制的與抗聯(lián)合治療可克服通過抗-VEGF治療的獲得-VEGF的聯(lián)合治療提供選擇抗性_因此，靶向KDR和阻斷KDR信號傳遞的抗體可具有更高的特異性和更完全的靶抑制，因此可具有在實體瘤和液體瘤中廣泛的應(yīng)用，以及具有克服Avastin抗性的潛能。在開發(fā)Ramucirumab (IMC-1121B)中抗-KDR 治療性抗體由 ImClone Systems/Eli Lilly 開發(fā)的 Ramucirumab 是結(jié)合人 KDR(KD ^ 50pM)的完全人(fully human) IgGl mAb,以及Ramucirumab阻斷VEGF結(jié)合,從而抑制血管生成。因為Ramucirumab不會與 鼠KDR交叉反應(yīng)，所以產(chǎn)生替代抗-鼠KDR抗體(DC-101)，并且將替代抗-鼠KDR抗體(DC-101)用于POC臨床前研究。
在具有晚期癌癥的患者的I期臨床試驗中，Ramucirumab較好耐受周給藥方案。機(jī)制相關(guān)的劑量限制性毒性是高血壓和深部靜脈血栓形成。最近報道(39)在具有轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌的患者中在KDR酪氨酸激酶抑制劑之后作為單一療法的II期試驗數(shù)據(jù)。將具有進(jìn)行性疾病或?qū)λ骼悄?sorafenib)、舒尼替尼、或兩者的不耐受性的患者兩周一次靜脈注射(IV)施用8mg/kg Ramucirumab。每六周進(jìn)行腫瘤評估。登記總計40個患者,并且治療39個。19個患者(49%)具有持續(xù)大于5個月的穩(wěn)定的疾??；初步中位無進(jìn)展存活是6個月。在黑素瘤中聯(lián)合氮烯唑胺、在具有前列腺癌的患者中聯(lián)合米托蒽醌/強(qiáng)的松、在具有NSCLC的患者中聯(lián)合碳鉬/紫杉醇、以及在具有結(jié)腸直腸癌的患者中聯(lián)合奧沙利鉬/亞葉酸/5-氟尿嘧啶的更多的II期試驗正在進(jìn)行中。最近在評估Ramucirumab在具有胃癌、胃食管連接部腺癌、和肝細(xì)胞癌的患者中3個III期研究。在轉(zhuǎn)移性胃腺癌中、在第二系的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌中和在第二系的非小細(xì)胞肺癌中使用或未使用紫杉醇的Ramucirumab的三個另外的3期研究正在進(jìn)行中。33C3由AstraZeneca開發(fā)的33C3是使用XenoMouse 技術(shù)產(chǎn)生的完全人抗-KDR抗體。33C3結(jié)合KDR的Ig結(jié)構(gòu)域4-7，因此對VEGF-A與KDR的結(jié)合不具有影響。它不競爭在配體結(jié)合部位相互作用的抗體。33C3具有對于KDR的高親合力(KD < InM)，并且抑制KDR的VEGF-A誘導(dǎo)的磷酸化。在體外，33C3強(qiáng)效抑制在2D血管生成分析中管長與分支點(diǎn)的數(shù)目和在3D分析中內(nèi)皮管形成。在體內(nèi)，33C3是在人內(nèi)皮血管生成分析和人皮膚嵌合體模型
(40)中非常有效的血管生成的抑制劑。33C3現(xiàn)在為開發(fā)的早期臨床前階段。由于缺乏對鼠KDR的交叉反應(yīng)性，在體內(nèi)腫瘤模型中尚未測試33C3。TTAC-OOOI通過PharmAbcine開發(fā)的TTAC-0001 (通過噬菌體展示產(chǎn)生的完全人抗-KDR抗體)現(xiàn)在為臨床前階段?？贵w 顯示對抗各種癌癥鼠模型(45)的強(qiáng)效抗-血管生成的功效。發(fā)明概述本公開的一方面提供結(jié)合KDR的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段，包含:(i)包含 SEQ ID NO:3 或 11 表示的 VHCDRl 區(qū)、SEQ ID NO:4 或 12 表示的 VHCDR2 區(qū)、和 SEQ IDNO:5表示的VHCDR3區(qū)的重鏈可變區(qū)；以及(ii)包含SEQ ID NO:6表示的VLCDRl區(qū)、SEQID NO:7表示的VLCDR2區(qū)、和SEQ ID NO:8表示的VLCDR3區(qū)的輕鏈可變區(qū)；或所述抗體的變體、或其抗原-結(jié)合片段，包含重鏈和輕鏈可變區(qū)，除了在所述⑶R區(qū)中高達(dá)8種氨基酸取代外，所述重鏈和輕鏈可變區(qū)與(i)和(ii)的所述重鏈和輕鏈可變區(qū)相同。在一個實施方案中，如本文所公開的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列。在另一實施方案中，如本文所公開的分離的抗體，或其抗原-結(jié)合片段包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列。在一個實施方案中，本文所公開的抗-KDR抗體結(jié)合人KDR，并且與鼠或猴KDR交叉反應(yīng)。本公開的另一方面提供結(jié)合KDR的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段，所述分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段包含:(i)包含如

圖11所示抗體的VHCDRl、VHCDR2、和VHCDR3的重鏈可變區(qū)；以及(ii)包含如圖11所示抗體的VIXDRl、VIXDR2、和VIXDR3的對應(yīng)的輕鏈可變區(qū)；或所述抗體的變體、或其抗原-結(jié)合片段包含重鏈和輕鏈可變區(qū)，除了在所述CDR區(qū)中高達(dá)8種氨基酸取代外，所述重鏈和輕鏈可變區(qū)與(i)和(ii)的所述重鏈和輕鏈可變區(qū)相同。在一個實施方案中，分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:17-42表不的氨基酸序列的任意一種。在另一實施方案中，分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:43-68表示的氨基酸序列的任意一種。本公開的另一方面提供結(jié)合KDR的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段，所述結(jié)合KDR的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:I表示的氨基酸序列。在一個實施方案中，分離的抗體包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列，以及分離的抗體包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列具有至少90% —致性的氨基酸序列。在一個實施方案中，這種抗體包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列。本公開的又一方面提供結(jié)合KDR的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段，所述結(jié)合KDR的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列。在一個實施方案中，結(jié)合KDR的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列，以及結(jié)合KDR的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含與SEQ ID N0:1表示的氨基酸序列具有至少90% —致性的氨基酸序列。在本公開的某些實施方案中，本文所述的抗-KDR抗體為人源化的。如本文所述的結(jié)合KDR的人源化抗體的示意性VH和VL區(qū)表示在SEQ ID NO:9和10中。在本文所述的抗-KDR抗體的另一實施方案中，抗體可包含單鏈抗體、ScFv、缺乏鉸鏈區(qū)的單價抗體、微型抗體、Fab、Fab’片段、F(ab’)2片段、或整個抗體。在某些實施方案中， 本文所述的分離的抗體包含人IgG恒定結(jié)構(gòu)域。在這點(diǎn)上，IgG恒定結(jié)構(gòu)域可包含IgGl CHl結(jié)構(gòu)域，例如如SEQ ID NO:16表示的IgGl CHl結(jié)構(gòu)域氨基酸序列。在某些實施方案中，本文所述的抗體包含IgG恒定結(jié)構(gòu)域，所述IgG恒定結(jié)構(gòu)域包含IgGl Fe區(qū)。本公開的另一方面提供與如本文所述的抗-KDR抗體競爭與人KDR的結(jié)合的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段。本公開的又一方面提供以高親合力(例如5.3xlO_nM或更低的KD的親合力)結(jié)合KDR的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段。在這點(diǎn)上，如本文所公開的抗-KDR抗體的親合力可以為約3.5,4,4.5，5，或5.5X10_nM。在某些實施方案中，本公開的分離的抗體與鼠KDR或非人靈長類KDR交叉反應(yīng)。本公開的另一方面提供分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段，其中分離的抗體或其抗原-結(jié)合片段阻斷VEGF與KDR的結(jié)合；抑制KDR信號傳遞；抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖；抑制腫瘤血管生成；抑制腫瘤細(xì)胞生長；或前述功能的任一項或多項的組合。在一個實施方案中，分離的抗體或其抗原-結(jié)合片段阻斷VEGF與KDR的結(jié)合；抑制KDR信號傳遞；抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖；抑制腫瘤血管生成；和抑制腫瘤細(xì)胞生長。在本發(fā)明的一個方面中，分離的抗體或其抗原-結(jié)合片段直接抑制腫瘤生長。本公開還提供編碼如本文所述的抗-KDR抗體的分離的多核苷酸、和包含這種分離的多核苷酸的表達(dá)載體、和包含這種載體的分離的宿主細(xì)胞。
本公開的另一方面提供包含生理上可接受的媒介物和藥學(xué)上有效量的如本文所述的分離的抗體或其抗原-結(jié)合片段的組合物。本公開的又一方面提供用于治療具有與畸變的VEGF或KDR表達(dá)或活性相關(guān)的癌癥的患者的方法，包括向患者施用包含生理上可接受的媒介物和藥學(xué)上有效量的如本文所述的分離的抗體或其抗原-結(jié)合片段的組合物，從而治療與畸變的VEGF或KDR表達(dá)或活性相關(guān)的癌癥。在這點(diǎn)上，本文所述的抗體可用于治療癌癥，包括但不限于:血管肉瘤、腎細(xì)胞癌、胃腸癌、轉(zhuǎn)移性胃或胃食管連接部腺癌、乳癌、膀胱癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、卵巢癌、黑素瘤、復(fù)發(fā)性多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、和白血病。本發(fā)明的另一方面提供用于治療患有炎性疾病的患者的方法，包括向患者施用藥學(xué)上包含本文所公開的抗體的任一種或多種的有效量的組合物，從而治療患有炎性疾病的患者。本公開的另一方面提供用于治療具有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者的方法，包括向患者施用包含生理上可接受的媒介物和藥學(xué)上有效量的如本文所述的分離的抗體或其抗原-結(jié)合片段的組合物，從而治療具有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者。本公開的另一方面提供用于治療具有銀屑病的患者的方法，包括向患者施用包含生理上可接受的媒介物和藥學(xué)上有效量的如本文所述的分離的抗體或其抗原-結(jié)合片段的組合物，從而治療具有銀屑病的患者。本公開的進(jìn)一步的方面提供用于治療患有血管生成介導(dǎo)的疾病的患者的方法，包括向患者施用藥學(xué)上包含本文 所公開的抗體的任一種或多種的有效量的組合物，從而治療患有血管生成介導(dǎo)的疾病的患者。在這點(diǎn)上，在某些實施方案中，患者患有年齡相關(guān)的黃斑變性。本公開的另一方面提供本文所述結(jié)合KDR的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段或本文所述的組合物在制備用于治療患者的癌癥的藥物的用途。本公開的另一方面提供本文所述結(jié)合KDR的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段或本文所述的組合物在制備用于治療患者的具有與畸變的VEGF或KDR表達(dá)或活性相關(guān)的癌癥的藥物的用途。優(yōu)選地所述癌癥選自:血管肉瘤、腎細(xì)胞癌、胃腸癌、轉(zhuǎn)移性胃或胃食管連接部腺癌、乳癌、膀胱癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、卵巢癌、黑素瘤、復(fù)發(fā)性多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、和白血病。本公開的另一方面提供本文所述結(jié)合KDR的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段或本文所述的組合物在制備用于治療患者的炎性疾病的藥物的用途。本公開的另一方面提供本文所述結(jié)合KDR的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段或本文所述的組合物在制備治療患者的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物的用途。本公開的另一方面提供本文所述結(jié)合KDR的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段或本文所述的組合物在制備治療患者的銀屑病的藥物的用途。本公開的另一方面提供本文所述結(jié)合KDR的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段或本文所述的組合物在制備治療患者的血管生成-介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。優(yōu)選地，其中所述患者患有年齡-相關(guān)的黃斑變性。附圖簡述圖1:顯示對于阻斷KDR與VEGF的結(jié)合的大部分強(qiáng)效抗體的篩選結(jié)果的曲線圖。
圖2:對抑制KDR的磷酸化的抗體的篩選。(A)在酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISAassay)中KDR磷酸化的抑制；(B)在蛋白印跡中KDR磷酸化的抑制。Ab9530是來自Abeam (Cambridge, MA, USA)的對照 KDR 中和抗體。圖3:APX004選擇性結(jié)合人和鼠KDR，但不結(jié)合其他人VEGFR家族蛋白或VEGF。圖4:APX004以2.6nM的IC50強(qiáng)效阻斷KDR與VEGF的結(jié)合。圖5:APX004抑制通過VEGF誘導(dǎo)的KDR磷酸化。圖6:APX004以劑量-依賴性方式抑制HUVEC增殖，圖7:至體內(nèi)研究的終止(41天)，與Avastin (69%抑制)相比，APX004表現(xiàn)出更強(qiáng)效抗-腫瘤活性(77%抑制)。圖8:APX004示出在2.5mg/kg下在H460腫瘤模型中顯著(P < 0.01)抗-腫瘤活性。圖9:在3mg/kg下APX004顯著抑制A375腫瘤生長。體積=(寬)2x長/2。符號和棒表不平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖10:在5mg/kg和10mg/kg下APX004顯著抑制HT29腫瘤生長。根據(jù)下面等式來計算腫瘤體積:體積=(寬)2x長/2。符號和棒表示平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差。
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圖11是實施例1所鑒定的抗-KDR抗體的VH和VL區(qū)的比對。圖1lAl顯示VH區(qū)的氨基酸1-100。圖11A2顯示VH的剩余的氨基酸。圖1lBl顯示VL區(qū)的氨基酸1_70的比對。圖11B2顯示VL區(qū)的剩余的氨基酸的比對。如概述在以下章節(jié)“序列簡述”和表3中，提供SEQ ID NO:1和17-42的顯示在比對中VH區(qū)的SEQ ID No ;提供SEQ ID NO:2和43-68的顯示在比對中VL區(qū)的SEQ ID No。⑶R為下劃線部分。序列簡述SEQ ID NO:1是克隆36兔抗-KDR抗體的VH區(qū)的氨基酸序列。SEQ ID NO:2是克隆36兔抗-KDR抗體的VL區(qū)的氨基酸序列。SEQ ID NO:3是克隆36兔抗-KDR抗體的VHCDRl區(qū)的氨基酸序列。SEQ ID NO:4是克隆36兔抗-KDR抗體的VHCDR2區(qū)的氨基酸序列。SEQ ID NO:5是克隆36兔抗-KDR抗體的VHCDR3區(qū)的氨基酸序列。SEQ ID NO:6是克隆36兔抗-KDR抗體的VLCDRl區(qū)的氨基酸序列。SEQ ID NO:7是克隆36兔抗-KDR抗體的VLCDR2區(qū)的氨基酸序列。SEQ ID NO:8是克隆36兔抗-KDR抗體的VLCDR3區(qū)的氨基酸序列。SEQ ID NO:9是克隆36兔抗-KDR抗體的VH區(qū)的人源化序列的氨基酸序列。SEQ ID NO:10是克隆36兔抗-KDR抗體的VL區(qū)的人源化序列的氨基酸序列。SEQ ID NO:11是人源化克隆36抗-KDR抗體(APX004)的VHCDRl區(qū)的氨基酸序列。SEQ ID NO:12是人源化克隆36抗-KDR抗體(APX004)的VHCDR2區(qū)的氨基酸序列。SEQ ID NO: 13是編碼人CK區(qū)的多核苷酸序列。SEQ ID NO:14是人CK的氨基酸序列。SEQ ID NO:15是編碼人IgGl CHl區(qū)的多核苷酸序列。SEQ ID NO:16是人IgGl CHl區(qū)的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 17-42是如概述在表3中兔抗-KDR抗體克隆的VH的氨基酸序列。SEQ ID NO:43_68是如概述在表3中兔抗-KDR抗體克隆的VL的氨基酸序列。SEQ ID NO:69_95是如顯示在圖11中用于兔抗-KDR抗體克隆的VHCDRl的氨基酸序列。SEQ ID NO =96-122是如顯示在圖11中用于兔抗-KDR抗體克隆的VHCDR2的氨基
酸序列。SEQ ID NO =123-149是如顯示在圖11中用于兔抗-KDR抗體克隆的VHCDR3的氨
基酸序列。SEQ ID NO =150-176是如顯示在圖11中用于兔抗-KDR抗體克隆的VLCDRl的氨
基酸序列。SEQ ID NO =177-203是如顯示在圖11中用于兔抗-KDR抗體克隆的VIXDR2的氨
基酸序列。SEQ ID NO =204-230是如顯示在圖11中用于兔抗-KDR抗體克隆的VLCDR3的氨基酸序列。發(fā)明詳述本文所述的抗-KD R抗體對于KDR具有高結(jié)合親合力(53pM)和選擇性。本文所述的抗體阻斷KDR與VEGF的相互作用，以及阻斷VEGF-誘導(dǎo)的KDR磷酸化和內(nèi)皮細(xì)胞增殖。在某些實施方案中，本文所述的抗體與鼠KDR交叉反應(yīng),使得在不需要替代抗體(surrogateantibody)下能夠在體內(nèi)動物模型中測試抗體。本文所述的抗體證實在人腫瘤異種移植模型中抑制腫瘤生長的強(qiáng)效活性。因為交叉-反應(yīng)性，依據(jù)PK、PD、生物標(biāo)志物發(fā)展、甚至在將它在非-人靈長類和人中測試前的臨床前鼠模型中潛在毒性，能夠體內(nèi)完全評價和特征化本文所述的抗-KDR抗體。本公開涉及特異性結(jié)合KDR的抗體及其抗原-結(jié)合片段，尤其具有特異的表位特異性和功能性質(zhì)的是抗體。本發(fā)明的一個實施方案涵蓋特異性人源化抗體及其片段，所述特異性人源化抗體及其片段能夠結(jié)合KDR ;阻斷KDR與VEGF的結(jié)合；和抑制VEGF誘導(dǎo)的下游細(xì)胞信號傳遞和生物作用。在本發(fā)明的更具體的實施方案中，本文所述的抗體以約
5.3X10_nM的親合力特異地結(jié)合KDR和阻斷KDR與VEGF結(jié)合。在進(jìn)一步的實施方案中，本文所述的抗體直接抑制腫瘤生長。在這點(diǎn)上，某些腫瘤表達(dá)KDR，以及可使用作為自分泌環(huán)的VEGF-KDR途徑以生長。因此，在某些實施方案中，通過本文所述的抗體介導(dǎo)的抗-腫瘤作用可包括:Q)抗-血管生成和/或(ii)直接抑制腫瘤生長。本發(fā)明的實施方案涉及抗-KDR抗體或其抗原-結(jié)合片段用于與VEGF或其畸變的表達(dá)相關(guān)的疾病和疾患的診斷、評估和治療的用途。在與VEGF或KDR表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾患的治療或預(yù)防中使用題述抗體，所述疾患包括但不限于:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、和缺血性視網(wǎng)膜病變、年齡-相關(guān)的黃斑變性、銀屑病、和與蛋白尿相關(guān)的腎小球肥大、和各種腫瘤疾病(包括血管肉瘤、腎細(xì)胞癌、胃腸癌、轉(zhuǎn)移性胃或胃食管連接部腺癌、乳癌、膀胱癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、卵巢癌、黑素瘤、和復(fù)發(fā)性多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、白血病、和實體瘤)、以及其他疾病。除非特別指出相反，本發(fā)明的操作采用在本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的病毒學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)、和重組DNA技術(shù)的常規(guī)方法，為了說明以下描述許多常規(guī)方法。在文獻(xiàn)中完全地解釋這些技術(shù)。參見，例如，Current Protocols in Molecular Biology或 Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.(2009)；Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed., Wiley & Sons,1995 ；Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第三版，2001) ；Maniatiset al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982) ；DNA Cloning:A PracticalApproach,vol.1 & II (D.Glover,ed.) ；01igonucleotide Synthesis(N.Gait,ed.,1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames & S.Higgins, eds.,1985) !Transcription andTranslation(B.Hames & S.Higgins,eds.,1984) ；Animal Cell Culture(R.Freshney,ed.,1986) ；Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)以及其他類似參考文獻(xiàn)。除非文本中明確另有說明外，如在該說明書和所附的權(quán)利要求中所使用，單數(shù)形式“ a”、“ an ”、和“ the ”包括復(fù)數(shù)形式。貫穿該說明書，除非文本另有需要，應(yīng)將詞語"包含(comprise)"、或諸如"包含(comprises)"或"使包含(comprising)"的變化形式理解為所述元素或整體、或者元素或整體的組的內(nèi)含物，但未排除任何其他的元素或整體、或者元素或整體的組。除非另有明確說明，在該說明書中將各實施方案加以必要的變更應(yīng)用至所有其他實施方案?？蓪?biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于重組DNA、寡核苷酸合成、和組織培養(yǎng)、和轉(zhuǎn)化(例如，電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書、或如在本領(lǐng)域中常規(guī)完成、或如本文所述可進(jìn)行酶促反應(yīng)和純化技術(shù)。根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法和如在各種通常與貫穿本說明書所引用和討論的更具體的參考文獻(xiàn)中所述通?？蛇M(jìn)行這些以及相關(guān)的技術(shù)和工序。除非提供具體的定義，相關(guān)使用的命名法和本文所述的分子生物學(xué)、分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)、和醫(yī)用和藥物化學(xué)的實驗室工序和技術(shù)都是本領(lǐng)域眾所周知和常規(guī)使用的那些?？蓪?biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于重組技術(shù)；分子生物；微生物 ；化學(xué)合成；化學(xué)分析；藥物制備、配方、和遞送；和患者的治療。本發(fā)明的實施方案涉及結(jié)合KDR的抗體。尤其，本文所述的抗體以出人意料地高的親合力特異地結(jié)合KDR ;阻斷VEGF與KDR的結(jié)合；阻斷VEGF活性；和具有用于治療與畸變的表達(dá)或VEGF的活性相關(guān)的疾病的治療功用。本文所述的抗體還具有諸如抑制各種VEGF/KDR-介導(dǎo)的生物作用(例如，KDR的磷酸化、血管生成、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他VEGF/KDR-介導(dǎo)的作用)的能力的有利性質(zhì)。本文所述的抗體還可具有對于KDR受體內(nèi)化的作用。SEQ ID NO:1-12和17-230表示示意性抗體、或抗原-結(jié)合片段、或其互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的序列。如本領(lǐng)域眾所周知，抗體是通過至少一種位于免疫球蛋白分子的可變區(qū)中表位識別部位能夠特異性結(jié)合靶(例如糖類、多核苷酸、脂質(zhì)、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文所使用，該術(shù)語不僅涵蓋完整的多克隆或單克隆抗體，還涵蓋其片段(例如dAb、Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv)、單鏈(ScFv)、其合成變體、天然存在的變體、包含具有所需的特異性、人源化抗體、嵌合抗體、和免疫球蛋白分子(包含所需的特異性的抗原-結(jié)合部位或片段(表位識別部位))的任何其他修飾構(gòu)型的抗原-結(jié)合片段的抗體部分的融合蛋白。通過基因融合構(gòu)建的"二體"、多價或多特異性片段(W094/13804 ;P.Holliger et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 906444-6448，1993)也是本文所涵蓋的抗體的特殊形式。包含與CH3結(jié)構(gòu)域相連的scFv的微型抗體也包括在本文中(S.Hu et al., Cancer Res.,56,3055-3061,1996)。例如，參見 Ward，E.S.et al., Nature 341,544-546(1989) ；Bird etal.， Science，242，423-426，1988 ;Huston et al.， PNAS USA，85，5879-5883，1988) ；PCT/US92/09965 ；W094/13804 ；P.Holliger et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90 6444-6448，1993 ；Y.Reiter et al., Nature Biotech,14，1239-1245，1996 ；S.Hu et al., Cancer Res.，56,3055-3061,1996。如本文所使用的術(shù)語"抗原-結(jié)合片段"是指含有結(jié)合目標(biāo)抗原(尤其為KDR)的免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈的至少一個CDR的多肽片段。在這點(diǎn)上，本文所述抗體的抗原-結(jié)合片段可包含來自結(jié)合KDR的抗體的本文所示的VH和VL序列的1、2、3、4、5、或所有6個CDR。本文所述的KDR-特異性抗體的抗原-結(jié)合片段能夠結(jié)合KDR。在某些實施方案中，抗原-結(jié)合片段或包含抗原-結(jié)合片段的抗體預(yù)防或抑制VEGF與KDR的結(jié)合和后續(xù)信號傳遞事件。在某些實施方案中，抗原-結(jié)合片段特異地結(jié)合和/或抑制、或調(diào)節(jié)人KDR的生物活性。術(shù)語"抗原"是指能夠被諸如抗體的選擇性結(jié)合劑結(jié)合的分子或分子的部分，所述分子或分子部分還能夠用于動物中以產(chǎn)生能夠結(jié)合抗原的表位的抗體?？乖删哂幸粋€或多個表位。術(shù)語"表位"包括能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白或T細(xì)胞受體的任何決定簇，優(yōu)選多肽決定簇。表位是通過抗體結(jié)合的抗原的區(qū)域。在某些實施方案中，表位決定簇包括分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)，例如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；?，而且在某些實施方案中，可具有特異性三維結(jié)構(gòu)特征和/或特異性電荷特征。在某些實施方案中。當(dāng)抗體在蛋白和/或大分子的復(fù)合混合物中優(yōu)先識別 其靶抗原時，則可以說它特異性結(jié)合抗原。當(dāng)平衡離解常數(shù)彡10_7或10_8M時，則可以說抗體特異性結(jié)合抗原。在一些實施方案中，平衡離解常數(shù)可以為< KT9M 或< 10_1QM。在某些實施方案中，如本文所述的抗體及其抗原-結(jié)合片段包括重鏈和輕鏈CDR集(set)，分別位于重鏈和輕鏈的框架區(qū)(FR)集之間，F(xiàn)R集提供對CDR的支持作用而且界定了 CDR相互之間的空間關(guān)系。如本文使用的術(shù)語“CDR集”是指重鏈或輕鏈V區(qū)中的高變區(qū)。從重鏈或輕鏈的N-端起，這些區(qū)段分別命名為"⑶Rl"、"⑶R2"，和"⑶R3"。因此，抗原-結(jié)合部位包含六個⑶R，包括重鏈和輕鏈各自V區(qū)的⑶R區(qū)。含有單一⑶R(例如CDR1、CDR2、或CDR3)的多肽在本文中是指"分子識別單位"。大量的抗原-抗體復(fù)合物的晶體學(xué)分析已經(jīng)證實=CDR的氨基酸殘基與結(jié)合的抗原形成了廣泛的接觸，其中接觸最多的是重鏈的⑶R3。因此，分子識別單位是主要負(fù)責(zé)抗原-結(jié)合部位的特異性。如本文所使用的術(shù)語"FR集"指重鏈或輕鏈V區(qū)的⑶R集中構(gòu)成⑶R兩側(cè)的四條氨基酸序列。某些FR殘基可與結(jié)合的抗原接觸；然而，F(xiàn)R主要負(fù)責(zé)V區(qū)的折疊以形成抗原-結(jié)合部位，特別是直接鄰接CDR的FR殘基。FR內(nèi)，某些氨基酸殘基和某些結(jié)構(gòu)特征是高度保守的。在這點(diǎn)上，所有的V區(qū)序列含有大約90個氨基酸殘基的內(nèi)部二硫環(huán)。當(dāng)將V區(qū)折疊成結(jié)合-部位時，CDR顯示出形成抗原結(jié)合表面的突出的環(huán)基序。通常認(rèn)為影響CDR環(huán)折疊成某些“規(guī)范”結(jié)構(gòu)的形狀的是FR的保守結(jié)構(gòu)區(qū)而不是精確的CDR氨基酸序列。而且，已知某些FR殘基參與了結(jié)構(gòu)域間的非共價接觸，所述非共價接觸穩(wěn)定了抗體重鏈和輕鏈間的相互作用。參照 Kabat, E.A.et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest.第四版.US Department of Health and Human Services.1987 及其更新(現(xiàn)在因特網(wǎng)上可獲得(immun0.bme.nwu.edu)),可測定免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和位置。"單克隆抗體"是指均一抗體群體，其中單克隆抗體由參與抗原的選擇性結(jié)合的氨基酸(天然存在的或非天然存在的)組成。單克隆抗體是高度特異的，被導(dǎo)向抗單個表位。術(shù)語“單克隆抗體”不僅涵蓋完整單克隆抗體和全-長單克隆抗體，還涵蓋其片段(例如Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv)、單鏈(ScFv)、其變體、含有抗原-結(jié)合部分的融合蛋白、人源化單克隆抗體、嵌合單克隆拉抗體、和包含所需特異性的抗原-結(jié)合片段(表位識別部位)和結(jié)合表位的能力的免疫球蛋白分子的任何其他修飾的構(gòu)型。該發(fā)明不用于限制抗體的來源或者其被產(chǎn)生的方式(例如通過雜·交瘤、噬菌體選擇、重組表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動物等)。該術(shù)語包括在"抗體"的定義下整個免疫球蛋白以及上述的片段等。木瓜蛋白水解酶優(yōu)選分裂IgG分子，從而產(chǎn)生若干片段，其中兩個片段(F(ab)片段)各含有包括完整抗原結(jié)合部位的共價異二聚體。胃蛋白酶能分裂IgG分子，從而提供若干個片段，包括含有兩個抗原結(jié)合部位的F(ab' )2片段。通過優(yōu)選的蛋白水解酶分裂IgM能夠產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案使用的Fv片段，少數(shù)情況下分裂IgG或IgA免疫球蛋白分子。然而，使用本領(lǐng)域熟知的重組技術(shù)獲得Fv片段更常見。Fv片段包括含有抗原結(jié)合部位的非共價VH:: VL異二聚體，所述抗原結(jié)合部位很大程度保留了天然抗體分子的抗原識別和結(jié)合能力。Inbar et al.(1972)Proc.Nat.Acad.Sc1.USA 69:2659-2662;Hochman et al.(1976) Biochem 15:2706-2710 ;以及 Ehrlich et al.(1980) Biochem 19:4091-4096。在某些實施方案中，涵蓋單鏈Fv或scFV抗體。例如，按照關(guān)于具有期望的特異性的選擇性受體的本申請的學(xué)說使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)可制備K體(III et al.，Prot.Eng.10:949-57(1997);微型抗體(Martin et al.，EMBO J 13:5305-9(1994) ;二體(Holliger et al.,PNAS 90:6444-8(1993)、或Janusins(Traunecker et al.,EMBO J 10:3655-59(1991)、和 Traunecker et al.，Int.J.Cancer Suppl.7:51-52 (1992)。在又一其他的實施方案中，可制備涵蓋本本開的配體的雙特異性或嵌合抗體。例如，嵌合抗體可包含來自不同抗體的CDR和框架區(qū)，同時可產(chǎn)生特異性結(jié)合KDR (通過一個結(jié)合結(jié)構(gòu)域)以及結(jié)合第二分子(通過第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的雙特異性抗體。通過重組分子生物技術(shù)可制備這些抗體，或可將這些抗體物理綴合在一起。單鏈Fv(sFv)多肽與從包括Vh-和編碼基因的基因融合表達(dá)的VH::VL異二聚體共價連接，所述Vh-和Vl1-編碼基因通過肽-編碼接頭連接。Huston et al.(1988) Proc.Nat.Acad.Sc1.USA 85(16):5879_5883。已經(jīng)描述大量方法以識別用于從抗體V區(qū)將天然聚合的-但是化學(xué)分離的-輕和重多肽鏈轉(zhuǎn)化為sFv分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，所述sFv分子會最終折疊成類似于抗原-結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)。例如，參見Huston et al的美國專利N0.5，091，513 和 5，132，405 ;和 Ladner et al 的美國專利 N0.4，946，778。在某些實施方案中，如本文所述的KDR結(jié)合抗體是以二體的形式。二體是多肽的高分子，各多肽包含第一結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域包含免疫球蛋白輕鏈和第二結(jié)構(gòu)域的結(jié)合區(qū)，所述第二結(jié)構(gòu)域包含免疫球蛋白重鏈的結(jié)合區(qū)，兩個結(jié)構(gòu)域被連接(例如通過肽接頭)，但是不能彼此締合以形成抗原結(jié)合部位:通過在高分子內(nèi)一種多肽的第一結(jié)構(gòu)域與在高分子內(nèi)另一多肽的第二結(jié)構(gòu)域的締合來形成抗原結(jié)合部位(W094/13804)。抗體的dAb 片段由 VH 結(jié)構(gòu)域組成(Ward, E.S.et al., Nature 341,544-546(1989))。使用雙特異性抗體處，可以為常規(guī)的雙特異性抗體，能夠以各種方式制備所述雙特異性抗體(HoiIiger,P.和Winter G Current Opinion Biotechnol.4,446-449 (1993)),例如化學(xué)制備或從雜交瘤制備，或可以為上述雙特異性抗體片段的任意一種。僅使用可變區(qū)能構(gòu)建無Fe區(qū)域的二體和scFv，這可能降低抗個體基因型反應(yīng)的作用。相對于完整的雙特異性抗體，雙特異性二體也是特別有用的，因為它們可在大腸桿菌(E.col1.)中容易地構(gòu)建和表達(dá)。使用噬菌體展示(W094/13804)能容易地從文庫中篩選具有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合特異性的二體(和許多其他多肽，例如抗體片段)。例如，如果二體的一個臂能保持恒定的定向抗抗原X的特異性，那么能制備其中另一臂變化的文庫并選擇具有合適特異性的抗體。可用突起進(jìn)入孔洞(knobs-1nto-hole)工程技術(shù)來制備雙特異性完整抗體(J.B.B.Ridgeway et al.，Protein Eng.,9,616-621,1996)。在某些實施方案中，可以UniBody 的形式提供本文所述的抗體。UniBody 是具有去除的鉸鏈區(qū)的IgG4抗體(參見GenMab Utrecht, The Netherlands ;例如，還參見US20090226421)。專利的抗體技術(shù)產(chǎn)生穩(wěn)定的、具有期望的更長的(與目前小的抗體形式相比)治療窗的更小的抗體形式(antibody format)。IgG4抗體被認(rèn)定為惰性的，因此其不會與免疫系統(tǒng)反應(yīng)。可修飾完全人IgG4抗體，通過消除抗體的鉸鏈區(qū)可改性完全人IgG4抗體，從而獲得相對于對應(yīng)的完整的IgG4(GenMab,Utrecht)具有不同穩(wěn)定性質(zhì)的半-分子片段。將IgG4分子二等分僅保留在UniBody 上一個區(qū)域，所述UniBody 能夠結(jié)合關(guān)聯(lián)抗原(例如，疾病靶)，因此UniBody 在靶細(xì)胞上僅共價結(jié)合一個部位。對于某些癌細(xì)胞表面抗原，該單價的結(jié)合可以不刺 激癌細(xì)胞以生長，如可看到使用具有相同的抗原特異性的二價的抗體，因此UdBody 技術(shù)可給予對于使用常規(guī)抗體可能難以治療的一些類型的癌癥的治療選擇。當(dāng)治療癌癥的一些形式時，UniBody 的小尺寸能夠是大的益處，這允許超過更大的實體瘤的分子的更好的分布和潛在性增加的功效。在某些實施方案中，本公開的抗體可采取納米體的形式。通過單一基因來編碼納米體，以及有效產(chǎn)生于幾乎所有原核和真核宿主中，例如大腸桿菌(例如，參見美國專利N0.6，765，087)、霉菌(例如曲霉屬(Aspergillus)或木霉屬(Trichoderma))、和酵母(例如酵母屬、Kluyvermyces、漢森氏酵母屬(Hansenula)、或畢赤酵母屬(Pichia))(例如,參見美國專利N0.6，838，254)。生產(chǎn)工序是可量的，并且已經(jīng)生產(chǎn)出多_千克數(shù)量的納米體?？蓪⒓{米體配方為具有長保質(zhì)期的隨時可用的溶液。基于B-細(xì)胞的自動化的高-通量選擇，納米克隆方法(例如，參見W006/079372)是用于產(chǎn)生抗期望的靶的納米體的專利方法。在某些實施方案中，如本文所公開的抗-KDR抗體或其抗原-結(jié)合片段為人源化的。這是指通常使用重組技術(shù)制備的嵌合分子，所述嵌合分子具有由來自非-人種類免疫球蛋白衍生的抗原-結(jié)合部位和基于人免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和/或序列的分子的剩余的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)。抗原-結(jié)合部位可包含融合在恒定結(jié)構(gòu)域上的完全的可變結(jié)構(gòu)域或僅包含嫁接在可變結(jié)構(gòu)域中恰當(dāng)?shù)目蚣軈^(qū)上的⑶R。表位結(jié)合部位可以為野生型或通過一種或多種氨基酸取代來修飾表位結(jié)合部位。這消除在人個體中作為免疫原的恒定區(qū)，但是仍然可能免疫應(yīng)答外源可變區(qū)(LoBuglio, A.F.et al., (1989)Proc Natl Acad SciUSA 86:4220-4224 ；Queen et al., PNAS(1988)86: 10029-10033 ；Riechmann et al.,Nature (1988) 332:323-327)。用于本文所公開的抗-KDR抗體的人源化的示意性方法包括在美國專利n0.7，462，697所述的方法。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，示意性人源化抗體包含SEQ ID NO:9，10，19和20提供的人源化序列。另一方法不僅關(guān)注提供人-衍生的恒定區(qū)，還修飾恒定區(qū)以便將它們盡可能改造為人形式。已知重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有三個互補(bǔ)-決定區(qū)(CDR)，應(yīng)答所述表位時所述互補(bǔ)-決定區(qū)會變化，并且被四個框架區(qū)(FR)側(cè)面相接的所述互補(bǔ)-決定區(qū)決定結(jié)合能力，在給定的種類中所述框架區(qū)是相對保守的，并且推定所述框架區(qū)提供CDR的骨架(scaffolding)。當(dāng)制備關(guān)于特定表位的非人抗體時,通過將衍生于非人抗體的⑶R嫁接在存在于待改性的人抗體中FR上能將可變區(qū)"重新改造(reshape)"或"人源化"。通過Sato, K., et al., (1993)Cancer Res 53:851-856.Riechmann, L., et al., (1988)Nature332:323-327 ；Verhoeyen, Μ.，et al.， (1988)Science 239:1534-1536 ；Kettleborough,C.A.,et al., (1991)Protein Engineering 4:773-3783 ；Maeda, H., et al., (1991)HumanAntibodies Hybridoma 2:124-134 ；Gorman,S.D., et al.,(1991)Proc Natl Acad Sci USA88:4181-4185 ；Tempest, P.R., et al., (1991)Bio/Technology 9:266-271 ；Co, M.S., etal.，(1991)Proc Natl Acad Sci USA88:2869-2873 ；Carter,P.,et al.，(1992)Proc NatlAcad Sci USA 89:4285-4289 ;和 Co，M.S.et al.，(1992) J Immunol 148:1149-1154,已經(jīng)報道該方法對于各種抗體的應(yīng)用。在一些實施方案中，人源化抗體保留所有CDR序列(例如，含有來自鼠抗體的所有六個CDR的人源化鼠抗體)。在其他的實施方案中，人源化抗體具有一個或多個CDR(—、二、三、四、五、六)，依據(jù)原始抗體這會變化，可將所述人源化抗體稱為來自原始抗體的一個或多個⑶R “衍生的” 一個或多個⑶R。在某些實施方案中，本公開的抗體可以為嵌合抗體。在這點(diǎn)上，嵌合抗體是由抗-KDR抗體的抗原-結(jié)合片段組成，所述抗-KDR抗體可操作地連接或否則為融合不同抗體的異源性Fe部分。在某些實施方案中，異源性Fe結(jié)構(gòu)域具有人源。在其他的實施方案中，異源性Fe結(jié)構(gòu)域可來自不同的Ig類(來自親本抗體)，包括IgA (包括亞類IgAl和IgA2)、IgD、IgE、IgG(包括亞類 IgGl、IgG2、IgG3、和 IgG4)、和 IgM0 在進(jìn)一步的實施方案中，異源性Fe結(jié)構(gòu)域可以由來自一種或多種不同的Ig類的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域組成。關(guān)于人源化抗體如上所示，嵌合抗體的抗-KDR抗原-結(jié)合片段可包含僅一種或多種本文所述的抗體的⑶R(例如，本文所述抗體的1、2、3、4、5、或6個⑶R)，或可包含整個可變結(jié)構(gòu)域(VL、VH、或兩者)。在某些實施方案中，KDR-結(jié)合抗體包含一種或多種本文所述的抗體的⑶R。在這點(diǎn)上，在一些情況下，已經(jīng)顯示:能 進(jìn)行抗體的僅VHCDR3的轉(zhuǎn)移，然而還保留期望的特異性結(jié)合(Barbas et al.，PNAS (1995) 92:2529-2533)。還參見 McLane et al.，PNAS (1995) 92:5214-5218, Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.(1994) 116:2161_2162。Marks et al (Bio/Technology, 1992,10:779-783)描述制備抗體可變結(jié)構(gòu)域的庫(repertoire)的方法,其中定向或鄰接可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域的5'末端的共有引物用于聯(lián)合至人VH基因的第三框架區(qū)的共有引物，從而提供缺失CDR3的VH可變結(jié)構(gòu)域的庫。Marks etal進(jìn)ー步描述如何將該庫與特定的抗體的CDR3合并。使用類似的技術(shù),可改組(shuffle)目前所述抗體的⑶R3-衍生的序列(使用缺乏⑶R3的VH或VL結(jié)構(gòu)域的庫)，而且改組的完整VH或VI結(jié)構(gòu)域結(jié)合同源VL或VH區(qū)來提供結(jié)合KDR的抗體或其抗原-結(jié)合片段。然后可將庫展示在合適的宿主系統(tǒng)，例如W092/01047的噬菌體展示系統(tǒng)中，以便可選擇合適的其抗體或抗原-結(jié)合片段。庫可由至少約IO4單個成員和多于若干數(shù)量級(例如，約IO6至IO8或10'或更多)的成員組成。Stemmer (Nature，1994，370:389-391)也公開類似的改組或組合的技木，Stemmer描述關(guān)于P -內(nèi)酰胺酶基因的技木，但是觀察到該方法可用于抗體的產(chǎn)生。進(jìn)ー步可選擇的是使用一個或多個選擇的VH和/或VL基因的隨機(jī)的突變來產(chǎn)生新型VH或VL區(qū)(所述新型VH或VL區(qū)攜帯本文所示的發(fā)明實施方案的ー種或多種CDR-衍生的序列)，從而產(chǎn)生在整個可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變。Gram et al (1992, Proc.Natl.Acad.Sc1.，USA,89 =3576-3580)描述該技術(shù)，其使用易錯PCR(error-prone PCR)?？墒褂玫牧愆`種方法是對VH或VL基因的CDR區(qū)進(jìn)行定點(diǎn)突變。Barbas et al.，(1994, Proc.Natl.Acad.Sc1.，USA，91:3809-3813)和 Schier et al (1996，J.Mol.Biol.263:551-567)公開該技術(shù)。在某些實施方案中，可將本文所述的抗體的特異性VH和/或VL用于篩選互補(bǔ)可變結(jié)構(gòu)域的文庫，從而鑒定具有期望的性質(zhì)(例如對于KDR增加的親合力)的抗體。這些方法描述在例如 Portolano et al.，J.Tmmuno1.(1993) 150:880-887 ；Clarkson et al.，Nature(1991) 352:624_628?？墒褂闷渌姆椒ㄒ曰旌虾推ヅ銫DR，從而鑒定具有期望的結(jié)合活性(例如結(jié)合KDR)的抗體。例如:Klimka etal., British Journal of Cancer (2000) 83:252-260 描述使用鼠VL和具有從鼠VH中保留的CDR3和FR4的人VH文庫的篩選方法。在獲得抗體后，抗人VL文庫來篩選VH，從而得到結(jié)合抗原的抗`體。Beiboer et al.，J.Mol.Biol.(2000)296:833-849描述使用整個鼠重鏈和人輕鏈文庫的篩選方法。在獲得抗體后，ー個VL與具有保留的鼠CDR3的人VH文庫合并。獲得能夠結(jié)合抗原的抗體。Rader et al.,PNAS (1998) 95:8910-8915描述類似上述Beiboer et al的方法。這些上述技木本身是本領(lǐng)域已知的。然而，根據(jù)本文所述的本發(fā)明的幾個實施方案，利用本領(lǐng)域中常規(guī)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用這些技術(shù)以獲得抗體或其抗原-結(jié)合片段。本文還公開的是用于獲得對于KDR抗原特異的抗體抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法，所述方法包括經(jīng)過在本文所述VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中一種或多種氨基酸的添加、缺失、取代、或插入來提供為VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體的VH結(jié)構(gòu)域；任選地結(jié)合VH結(jié)構(gòu)域從而提供ー個或多個VL結(jié)構(gòu)域；以及測試VH結(jié)構(gòu)域或ー種或多種VH/VL組合，從而鑒定特異性結(jié)合成員、或?qū)τ贙DR特異的與任選具有一種或多種期望性質(zhì)的抗體抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。VL結(jié)構(gòu)域可具有基本上如本文所述的氨基酸序列?？刹捎妙愃频姆椒?，其中ー個或多個本文所公開的VL結(jié)構(gòu)域的序列變體聯(lián)合一個或多個VH結(jié)構(gòu)域。"特異性結(jié)合"或"優(yōu)選地結(jié)合"(本文可交換使用)抗體或多肽的的表位是本領(lǐng)域充分理解的術(shù)語，并且測定這種特異性或優(yōu)選結(jié)合的方法也是本領(lǐng)域眾所周知的。與可選擇的細(xì)胞或物質(zhì)相比，如果分子反應(yīng)或締合更頻繁、更快、具有更久的持續(xù)時間和/或與特定細(xì)胞或物質(zhì)具有更大的親合力，分子被認(rèn)為表現(xiàn)出"特異性結(jié)合"或"優(yōu)選的結(jié)合"。與抗體結(jié)合其他物質(zhì)相比，如果抗體結(jié)合具有更大的親合力、親和力、更加容易、和/或具有更長的持續(xù)時間，抗體"特異性結(jié)合"或"優(yōu)選地結(jié)合"靶。例如，特異性或優(yōu)選地結(jié)合KDR表位的抗體是結(jié)合一種KDR表位的抗體，與抗體結(jié)合其他KDR表位或非-KDR表位相比，所述結(jié)合具有更高的親合力、親和力、更加容易、和/或具有更長的持續(xù)時間。通過閱讀該定義還應(yīng)當(dāng)理解，例如，特異性或優(yōu)選地結(jié)合第一靶的抗體(或部分或表位)可或可不特異性或優(yōu)選地結(jié)合第二靶。就其本身而論，"特異性結(jié)合"或"優(yōu)選的結(jié)合"不是必要(盡管它能夠包括)排外的結(jié)合。通常，但不是必要，參照的結(jié)合意思是優(yōu)選的結(jié)合。免疫結(jié)合通常是指類型的非-共價相互作用，所述類型出現(xiàn)在免疫球蛋白分子和抗原之間，對于所述抗原免疫球蛋白是特異的，例如通過說明但非限制性的方式，由于靜電的、離子的、親水的和/或疏水的吸引力或排斥力、位阻力(steric force)、氫鍵、范德華カ(van der Waals forces)、和其他相互作用。依據(jù)相互作用的離解常數(shù)(Kd)能夠表示免疫結(jié)合相互作用的強(qiáng)度、或親合力，其中更小的Kd表示更高的親合力。使用本領(lǐng)域眾所周知的方法能夠定量選擇的多肽的免疫結(jié)合性質(zhì)。一種這種方法需要測量抗原-結(jié)合部位/抗原復(fù)合物形成和離解的速率，其中這些速率取決于復(fù)合物配偶體的濃度、相互作用的親合力、和同等地影響在兩方向中速率的幾何參數(shù)。因此，通過計算締合和離解的濃度和實際速率能夠測定"結(jié)合速率常數(shù)"(KJ和"離解速率常數(shù)"U。KtjffZXn的比率能夠抵消與親合力無關(guān)的所有參數(shù)，因此等于離解常數(shù)Kd。通常,參見Davies et al.(1990) Annual Rev.Biochem.59:439_473。在某些實施方案中，本文所述的抗-KDR抗體具有約100，150，155，160，170，175，180，185，190，191，192，193，194，195，196，197，198 或 199 皮摩爾的親合力，以及在ー些實
施方案中，對于KDR抗體可具有甚至更高的親合力。關(guān)于表位的術(shù)語"免疫活性"或"剰余的免疫活性"是指在不同的條件下(例如，在使表位經(jīng)過還原和變性條件后)抗體(例如，杭-KDR抗體)結(jié)合表位的的能力。

根據(jù)本申請的某些優(yōu)選的實施方案的抗體或其抗原-結(jié)合片段可以為與任意本文所述的抗體競爭結(jié)合KDR的ー種，其為(i)特異性結(jié)合抗原，以及(ii)包含本文所公開的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域、或包含本文所公開的VHCDR3、或任意這些的變體。例如使用ELISA和/或通過將特異性報道分子標(biāo)記至ー種抗體(在其他未標(biāo)記的抗體的存在下，能夠檢測所述抗體)，可容易地體內(nèi)分析抗體之間的競爭，從而能夠鑒定結(jié)合相同表位或重疊的表位的特異性抗體。因此，本文中提供特異性抗體或其抗原-結(jié)合片段，所述抗體或其抗原-結(jié)合片段包含與本文所述的抗體競爭結(jié)合KDR的人抗體抗原-結(jié)合部位。在這點(diǎn)上，如本文所使用，術(shù)語“競爭”、"抑制結(jié)合"、和"阻斷結(jié)合"(例如，涉及VEGF與KDR的結(jié)合的抑制/阻斷或涉及抗-KDR抗體與KDR的結(jié)合的抑制/阻斷)可交換地使用，以及涵蓋部分和完全抑制/阻斷。VEGF結(jié)合與KDR的抑制/阻斷優(yōu)選地減少或改變在沒有抑制或阻斷下當(dāng)VEGF結(jié)合KDR時發(fā)生的細(xì)胞信號傳遞的正常水平或類型。抑制和阻斷還g在包括當(dāng)接觸如本文所公開的抗-KDR抗體時在VEGF與KDR的結(jié)合中相比于未接觸抗-KDR抗體的配體的任何可測量的減少，例如，VEGF與KDR的阻斷減少了至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%。與可變區(qū)相比，免疫球蛋白的恒定區(qū)顯示更少的序列多祥性，并且負(fù)責(zé)結(jié)合大量天然蛋白，從而引發(fā)重要的生化反應(yīng)。在人中，有五種不同種類的抗體，包括IgA(其包括亞類 IgAl 和 IgA2)、IgD、IgE、IgG(其包括亞類 IgGl、IgG2、IgG3、和 IgG4)、和 IgM0 在這些抗體種類之間的顯著特征是它們的恒定區(qū)，盡管微妙的差別可能存在于V區(qū)?？贵w的Fe區(qū)與大量Fe受體和配體相互作用，這賦予一系列重要的功能性能力，稱為效應(yīng)器功能。對于IgG，F(xiàn)e區(qū)包含Ig結(jié)構(gòu)域CH2和CH3以及引入CH2的N-末端鉸鏈。對于IgG類的Fe受體的重要家族是Fe y受體(Fe y Rs)。這些受體介導(dǎo)抗體間的通信和免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的臂(cellular arm) (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol12:181-220 ；Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290)。在人中，該蛋白家族包括 Fe y RI (CD64)(包括亞型 Fe y RIa, Fe y Rib、和 Fe y RIc) ；Fc y RII (CD32)(包括亞型 Fe Y RIIa(包括同種異型 H131 和 R131)、Fe Y RIIb (包括 Fe Y RIIb-1 和 Fe y RIIb-2)、和Fe Y RIIc);和FcyRIII(CD16)(包括亞型Fe y RIIIa(包括同種異型V158和F158)和Fe YRIIIb(包括同種異型 Fe y RIIIb-NAl 和 Fe y RIIIb-NA2)) (Jefferis et al.,2002,Immunol Lett 82:57-65)。這些受體典型地具有介導(dǎo)結(jié)合Fe的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、和可在細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)ー些信號傳遞事件的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。這些受體表達(dá)在各種免疫細(xì)胞中，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性白細(xì)胞、樹突細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、B細(xì)胞、大顆粒淋巴細(xì)胞、朗氏細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞、和T細(xì)胞。Fc/FcyR復(fù)合物的形成將這些效應(yīng)器細(xì)胞吸收至結(jié)合的抗原的部位，這典型地導(dǎo)致在細(xì)胞內(nèi)信號傳遞事件和重要的后續(xù)免疫應(yīng)答，例如炎癥介質(zhì)的釋放、B細(xì)胞激活、胞吞、吞噬、和細(xì)胞毒素攻擊。介導(dǎo)細(xì)胞毒素的和吞噬細(xì)胞的效應(yīng)器功能的能力是潛在的機(jī)制，通過該機(jī)制抗體破壞靶向的細(xì)胞。細(xì)胞-介導(dǎo)的反應(yīng)(其中表達(dá)Fe Y Rs的非特異性細(xì)胞毒素的細(xì)胞在靶細(xì)胞上識別出結(jié)合的抗體以及最終導(dǎo)致靶細(xì)胞的溶胞)被稱作抗體依賴性細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC) (Raghavan et al.，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220 ；Ghetieet al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766 ；Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol19:275-290)。細(xì)胞-介導(dǎo) 的反應(yīng)(其中表達(dá)Fe Y Rs的非特異性細(xì)胞毒素的細(xì)胞識別出在靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體以及最終導(dǎo)致靶細(xì)胞的吞噬)被稱作抗體依賴性細(xì)胞-介導(dǎo)的吞噬(ADCP)。所有Fe Y Rs在Fe上結(jié)合相同的區(qū)域，在Cg2 (CH2)結(jié)構(gòu)域和前述鉸鏈的N-終端下。該相互作用在結(jié)構(gòu)上充分特征化(Sondermann et al.,2001, J Mol Biol 309:737-749)，以及已經(jīng)解決結(jié)合人Fe YRIIIb的細(xì)胞外的結(jié)構(gòu)域的人Fe的一些結(jié)構(gòu)(pdb登記碼1E4K)(Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273) (pdb 登記碼 IIIS 和 11IX) (Radaev etal.,2001, J Biol Chem 276:16469-16477)。對于Fe Y Rs，不同IgG亞類具有不同的親合力，IgGl和IgG3與受體的典型結(jié)合幾乎優(yōu)于 IgG2 和 IgG4 (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett82:57-65)。在 IgG Fe 上所有Fe Y Rs結(jié)合相同的區(qū)域,但是具有不同的親和カ:對于IgGl,高親合力粘結(jié)劑(binder)Fe y RI具有IOl1的Kd，然而低親合力受體Fe y RII和Fe y RIII通常分別結(jié)合在10_6和1(T5下。Fe Y RIIIa和Fe Y RIIIb的胞外結(jié)構(gòu)域是96 %—致的，然而Fe y RIIIb沒有細(xì)胞內(nèi)信號傳遞結(jié)構(gòu)域。而且，然而Fe Y R1、Fe Y Rlla/c、和Fe y RIIIa是免疫復(fù)合物-觸發(fā)的激活的正調(diào)節(jié)物，其特征在于具有細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，所述細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有免疫受體絡(luò)氨酸-基激活基序(ITAM)，F(xiàn)e y RIIb具有免疫受體絡(luò)氨酸-基抑制基序(ITIM)，因此它是抑制的。因此，前者被稱為激活受體，以及Fe y RIIb被稱為抑制受體。受體還在表達(dá)模式和在不同免疫細(xì)胞上表達(dá)水平上不同。復(fù)雜度的又一水平是在人蛋白組中大量Fe YR多態(tài)現(xiàn)象的存在。具有臨床意義的特別相關(guān)的多態(tài)現(xiàn)象是V158/F158FCYRIIIa。與F158同種異型相比，人IgGl以更大的親合力結(jié)合V158同種異型。已經(jīng)顯示在親合力中差別和推測其對ADCC和/或ADCP的作用為抗-CD20抗體利妥昔(rituximab) ( Rituxan , IDECPharmaceuticals Corporation的注冊 商標(biāo))的功效的重要的決定因素。具有V158同種異型的患者較好地應(yīng)答利妥昔治療；然而，具有更低的親合力F158同種異型的患者應(yīng)答較差(Cartron et al.，2002，Blood 99:754-758)。大約 10-20% 的人是 V158/V158 純合的；45%是 V158/F158 雜合的；以及 35-45 % 的人是 F158/F158 純合的(Lehmbecher et al.，1999,Blood 94:4220-4232 ；Cartron et al.，2002，Blood 99:754-758)。因此，80-90% 的人是差的應(yīng)答者(responder)，那是他們具有F158Fc YRIIIa的至少ー種等位基因。Fe區(qū)也包括在補(bǔ)體串聯(lián)的激活中。在精典的補(bǔ)體途徑中，Cl將它的Clq亞單位結(jié)合IgG或IgM的Fe片段，這已經(jīng)形成具有抗原的復(fù)合物。在本發(fā)明的某些實施方案中，F(xiàn)e區(qū)的修飾包含改變(增加或減少)如本文所述的KDR-特異性抗體的能力的修飾，從而激活補(bǔ)體系統(tǒng)(例如，參見美國專利7，740，847)。為了評估補(bǔ)體激活，可進(jìn)行補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)分析(例如，參見 Gazzano-Santoro et al., J.Tmmuno 1.Methods, 202:163(1996))。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明提供具有修飾的Fe區(qū)的抗-KDR抗體，所述修飾的Fe區(qū)具有改變的功能性質(zhì)，例如降低的或增強(qiáng)的CDC、ADCC、或ADCP活性；或?qū)τ谔禺愋訤e Y R的增強(qiáng)的結(jié)合親合力；或增加的血漿半衰期。本文涵蓋的其他修飾的Fe區(qū)描述，例如，在發(fā)表的美國專利 7，317，091 ；7, 657, 380 ;7，662，925 ;6，538，124 ;6，528, 624 ；7，297，775 ;7，364，731 ;公開的美國專利 US2009092599 ；US20080131435 ；US20080138344 ；和公開的國際申請 W02006/105338 ；W02004/063351 ；W02006/088494 ；W02007/024249 中。因此，在某些實施方案中 ，使具有期望的結(jié)合特異性的抗體可變結(jié)構(gòu)域融合免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列。在某些實施方案中，融合使用Ig重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，所述Ig重鏈恒定結(jié)構(gòu)域包含至少一部分的鉸鏈、Ch2、和Ch3區(qū)。優(yōu)選具有含有存在于至少ー種融合中的輕鏈結(jié)合必要的部位的第一重-鏈恒定區(qū)(ChI)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合的DNA和如果需要的免疫球蛋白輕鏈插入?yún)g獨(dú)的表達(dá)載體，并且將其共同-轉(zhuǎn)染至合適的宿主細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)在結(jié)構(gòu)中使用的三個多肽鏈的不相等的比率提供期望的雙特異性抗體的最佳產(chǎn)率時，在調(diào)節(jié)實施方案中三個多肽片段的共同性質(zhì)中這提供更大的靈活性。然而，當(dāng)以相等比率至少兩個多肽鏈的表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)率時，或當(dāng)比率對于期望鏈組合的產(chǎn)率不具有重要影響時，可能將對于兩個或所有三個多肽鏈編碼序列插入單一表達(dá)載體內(nèi)。還可將本發(fā)明的抗體(和抗原-結(jié)合片段及其變體)修飾以包括表位標(biāo)簽或標(biāo)記，例如，用于純化或診斷應(yīng)用中。有許多本領(lǐng)域已知的連接基團(tuán)用于制備抗體綴合物，包括例如公開在美國專利N0.5，208，020或歐洲專利0 425 235 BI JPChari et al.,CancerResearch 52:127-131 (1992)的那些。連接基團(tuán)包括如在上述專利中所公開的ニ硫基、硫醚基、酸性不穩(wěn)定基團(tuán)、對光不穩(wěn)定基團(tuán)、肽酶不穩(wěn)定基團(tuán)、或酷酶不穩(wěn)定基團(tuán)，優(yōu)選ニ硫化物和硫醚基。在另ー涵蓋的實施方案中，可使如本文所述的KDR-特異性抗體綴合或可操作地連接至另一治療化合物，本文稱為綴合物。綴合物可以為細(xì)胞毒素劑、化療劑、細(xì)胞因子、杭-血管生成的劑、酪氨酸激酶抑制劑、毒素、放射性同位素、或其他治療活性剤?；焺⒓?xì)胞因子、抗-血管生成的劑、酪氨酸激酶抑制劑、和其他治療劑已經(jīng)描述如上，并且所有這些前述治療劑可發(fā)現(xiàn)用作抗體綴合物。在可交替的實施方案中，使抗體與毒素(包括但不限于小分子毒素和細(xì)菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體)綴合或可操作地連接。小分子毒素包括但不限于阜草素(saporin) (Kuroda K, et al.，The Prostate 70:1286-1294(2010)；Lip, WL.et al.,2007 Molecular Pharmaceutics 4:241-251 ;Quadros EV., et al.,2010 Mol Cancer Ther ；9 (11) ；3033-40 ；Polito L., et al.2009British Journal ofHaematology, 147, 710-718)、卡奇霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)(美國專利N0.5，208, 020)、單端孢霉烯毒素(trichothene)、和CC1065。毒素包括但不限于:RNase，白樹毒素(gelonin)、炔ニ烯、蓖麻毒、相思豆毒素、白喉毒素、霍亂毒素、白樹毒素、假單胞菌外毒素(PE40)、遲鈍志賀氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素、和美洲商陸抗病毒蛋白。在一個實施方案中，使本公開的抗體或其抗原-結(jié)合片段綴合至美登木素分子。美登木素是通過抑制微管蛋白聚合來作用的有絲分裂的抑制劑。美登木素首先從東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)(美國專利N0.3,896，111)中分離。最終,發(fā)現(xiàn)某些細(xì)菌也產(chǎn)生美登木素，例如美登醇和C-3美登醇酯(美國專利N0.4，151,042)。合成的美登醇及其衍生物和類似物公開，例如在美國專利N0.4，137，230 ;4，248，870 ;4，256，746 ;4，260，608 ；4，265，814 ;4，294，757 ;4，307，016 ;4，308，268 ;4，308，269 ;4，309，428 ;4，313，946 ；4，315，929 ;4，317，821 ;4，322，348 ;4，331，598 ;4，361，650 ;4，364，866 ;4，424，219 ；4，450，254 ;4，362，663 ;和4，371，533。含有美登木素的免疫綴合物和它們的治療用途公開在例如美國專利 N0.5，208，020，5，416，064 和歐洲專利 EP 0425235B1.Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 93 =8618-8623(1996)描述包含命名為 DMl的美登木素的免疫綴合物，所述DMl連接單克隆抗體C242，將單克隆抗體C242定向?qū)谷私Y(jié)腸直腸癌。對于培養(yǎng)的直腸癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)綴合物為高細(xì)胞毒素的，并且在體內(nèi)腫瘤生長分析中綴合物顯示抗腫瘤活性。在沒有顯著降低抗體或美登木素分子的生物活性下，通過化學(xué)連接抗體與美登木素分子來制備抗體-美登木素綴合物。在沒有消極影響抗體的功能或溶解性下，3-4個綴合的美登木素分子的平均值/抗體分子已經(jīng)顯示在靶細(xì)胞的增強(qiáng)的細(xì)胞毒性中功效，盡管在使用裸抗體(naked antibody)期間，甚至預(yù)期一分子的毒素/抗體增強(qiáng)細(xì)胞毒性。美登木素是本領(lǐng)域眾所周知的，并且通過已知的技術(shù)能夠合成或從植物來源來分離。合適的美登木素公開在例如美國專利N0.5，208，020和在參照本文上述的其他專利和非專利公開中。優(yōu)選的美登木素是美登醇和在芳香環(huán)中修飾的美登醇類似物、或美登醇分子的其他位置處，例如各種美登醇酷。另一目標(biāo)綴合物包含綴合至ー個或多個卡奇霉素分子的抗體。抗體的卡奇霉素家族能夠在亞-皮摩爾(sub-picomolar)濃度下產(chǎn)生雙鏈的DNA斷裂。還可使用的卡奇霉素的結(jié)構(gòu)類似物(Hinman et al., 1993, Cancer Research 53:3336-3342 ;Lodeet al.，1998，Cancer Research 58:2925-2928)(美國專利 N0.5，714，586 ;美國專利N0.5，712，374 ;美國專利 N0.5，264，586 ;美國專利 N0.5，773，001)。諸如 auristatinE(AE)和 monomethylauristatin E(MMAE)的多拉司他汀(Dolastatin) 10 類似物可發(fā)現(xiàn)用作最近公開的抗體、或其變體的綴合物(Doronina et al., 2003, Nat Biotechnol 21(7):778-84 ；Francisco et al.，2003Blood 102 (4):1458-65)。有用的酶活性毒素包括但不限干:白喉A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、a-八疊球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、垂序商陸(Phytolaca Americana)蛋白(PAP1、PAPI1、和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻風(fēng)樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素、mitogellin、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素、依諾霉素、和單端孢霉菌烯醇(tricothecene)。例如，參見PCT WO 93/21232。本公開進(jìn)ー步涵蓋其中在如本文所述的KDR-特異性抗體和具有核溶解活性的化合物之間形成綴合物或融合的實施方案，例如核糖核酸酶或諸如脫氧核糖核酸酶(DNase)的DNA核酸內(nèi)切酶。在可交替的實施方案中，可將本文-所公開的抗體綴合或可操作地連接放射性同位素，從而形成放射性綴合物?？色@得各種放射性同位素用于制備放射性綴合物抗體。例子包括但不限于 ·90Y、1231、1251、1311、186Re、188Re^211At 和 212Bi。在某些其他的實施方案中，可使本文所述的抗體綴合至治療部分，例如細(xì)胞毒素(例如，細(xì)胞抑制劑或殺細(xì)胞劑)、治療劑或放射性元素(a -輻射源、Y -輻射源等)。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒素劑包括對細(xì)胞有害的任何藥劑。例子包括紫杉醇/紫杉醇(paclitaxol)、松胞菌素B、短桿菌肽D、溴化こ錠、吐根堿、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春花堿、秋水仙堿、阿霉素、道諾紅菌素、ニ輕基炭疽菌素ニ酮(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、l_去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、和嘌呤霉素及其類似物或同系物。一種優(yōu)選的示例性細(xì)胞毒素是皂草素(從Advanced Targeting Systems, San Diego, CA可獲得)。治療劑包括但不限于:抗代謝物(例如，氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺);烷化劑(例如，氮芥、thioepa chlorambucil、苯丙氨酸氮芥、亞硝脲氮芥(BSNU)、和環(huán)己亞硝脲(CCNU)、cyclothosphamide、白消安、ニ溴甘露醇、鏈脲佐菌素、絲裂霉素C、和順式ニ氯ニ氨合鉬(II) (DDP)順氯氨鉬)、蒽環(huán)霉素(例如道諾紅菌素(原來為daunomycin)和阿霉素)，抗生素(例如更生霉素(原來為actinomycin),爭光霉素,光神霉素和氨茴霉素(AMC)以及抗-有絲分裂劑(例如長春新堿和長春花堿)。而且，在某些實施方案中，KDR-特異性抗體(包括本文提供的其功能片段，例如抗原-結(jié)合片段)可綴合治療部分，例如用于綴合放射金屬離子的放射性材料或大環(huán)螯合剤。在某些實施方案中，大環(huán)螯合劑是1，4，7，10_四氮雜環(huán)十二烷-N，N'，N"，N"，-四こ酸(DOTA)，其可通過接頭分子附接抗體。這種接頭分子是本領(lǐng)域熟知的，并且描述于Denardoet al.,1998,Clin Cancer Res.4:2483-90 ；Peterson et al.,1999,Bioconjug.Chem.10:553 ;和 Zimmerman et al.，1999, Nuc1.Med.Biol.26:943_50。在又一實施方案中，抗體可綴合"受體"(例如鏈酶親和素)以用于腫瘤的預(yù)定位，其中抗體-受體綴合物施用至患者，然后使用清除劑從循環(huán)系統(tǒng)中除去未結(jié)合的綴合物，接著施用為綴合細(xì)胞毒素劑(例如放射性核苷酸)的"配體"(例如抗生物素蛋白)。在可交替的實施方案中，抗體綴合或可操作地連接酶以應(yīng)用抗體依賴性酶介導(dǎo)的前藥療法(ADEPT)。ADEPT可以通過下列方式來使用:使抗體綴合或可操作地連接至激活前藥的酶，該酶使前藥(例如肽基化療劑，參見PCT WO 81/01145)轉(zhuǎn)化為活性抗癌藥物。例如參見PCTWO 88/07378和美國專利N0.4，975，278。用于ADEPT的免疫綴合物的酶組分包括能夠以這樣的方式作用于前藥的任何酶，該方式為使其轉(zhuǎn)化為更加活性細(xì)胞毒素形式。用于這些方法和相關(guān)實施方案的酶包括但不限于:用于將含有磷酸酯的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物的堿性磷酸酯酶；用于將含有硫酸酷的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物的芳基硫酸酯酶；用于將非毒性5-氟胞嘧碇轉(zhuǎn)化為抗癌藥物5-氟尿嘧啶的胞嘧碇脫氨酶；用于將含有肽的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物的蛋白酶，例如沙雷氏菌屬蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧基肽酶和組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B和L);用于轉(zhuǎn)化含有D-氨基酸取代基的前藥的D-丙氨?；然拿福挥糜趯⑻腔八庌D(zhuǎn)化為游離藥物的糖類-裂解酶，例如-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨糖酸苷酶；用于將使用-內(nèi)酰胺衍生化的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的￠-內(nèi)酰胺酶；以及用于將在它們的胺的氮處分別使用苯氧基こ酰基或苯基こ?；苌乃幬镛D(zhuǎn)化為游離藥物的青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，具有酶活性的抗體，在本領(lǐng)域中也稱為"抗體酶"，可用于將前藥轉(zhuǎn)化為游離活性藥物(例如參見Massey，1987，Nature328:457-458)。抗體-抗體酶綴合物可以制備以用于將抗體酶遞送至腫瘤細(xì)胞群。免疫綴合物可以使用各種雙功能性蛋白偶聯(lián)劑來制備，例如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基ニ巰基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯，亞氨基硫烷(IT)，亞氨酸酯的雙功能性衍生物(例如己ニ亞氨ニ鹽酸ニ甲酷)，活性酷(例如ニ琥珀酰亞胺基辛ニ酸酯)，醛類(例如戊ニ醛)，雙-疊氮基化合物(例如雙(P-疊氮基苯甲?；?己ニ胺)，雙-重氮衍生物(例如雙-(P-重氮苯甲?；?-こニ胺)，ニ異氰酸酯(例如甲苯2，6-ニ異氰酸酷)和雙-活性氟化合物(例如1，5_ ニ氟-2,4- ニ硝基苯)。特定偶聯(lián)劑包括N-琥拍酰亞胺基-3-(2-批唳基ニ巰基)丙酸酯(SPDP) (Carlsson et al.,Biochem.J.173:723-737 [1978])和 N-琥珀酰亞胺基-4-(2-批啶基巰基)戊酸酯(SPP)以提高ニ硫化物連接。接頭可以是促進(jìn)一種或多種可裂解的組分釋放的“可裂解的接頭”。例如，可以使用酸-不穩(wěn)定性接頭(Cancer Research 52:127-131 (1992);美國專利 N0.5，208`，020)。本文還涵蓋本發(fā)明的抗體(和多肽)的其他修飾。例如,抗體可以連接至各種非蛋白高分子中的ー種，例如聚こニ醇、聚丙ニ醇、聚氧化亞烷基、或聚こニ醇和聚丙ニ醇的共聚物。抗體還可以包封在微囊中，其例如通過在膠態(tài)藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒和納米囊)或大乳(macroemulsion)中凝聚技術(shù)或界面聚合(例如分別為羥甲基纖維素或明膠-微囊和聚_(甲基丙烯酸甲酷)微囊)。這些技術(shù)公開于Remington' s Pharmaceutical Sciences,16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)。如本文所使用的，“媒介物”包括在使用的劑量和濃度下對暴露的細(xì)胞或哺乳動物是非毒性的藥學(xué)上可接受的媒介物、賦形劑或穩(wěn)定劑。通常生理上可接受的媒介物是水性pH緩沖溶液。生理上可接受的媒介物包括緩沖鹽，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性高分子例如聚こ烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或賴氨酸；單糖、ニ糖和其他糖類(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合劑例如EDTA ;糖醇例如甘露醇或山梨糖醇；成鹽反離子例如鈉；和/或非離子型表面活性劑例如聚山梨醇酯20 (TWEEN )聚こニ醇(PEG)和泊洛沙姆(PLURONICS )等?？?KDR抗體的期望功能性能可以使用熟練技術(shù)人員已知的各種方法來評價:親合力/結(jié)合測定(例如表面等離子共振、競爭性抑制測定)；細(xì)胞毒性測定、細(xì)胞活力測定、響應(yīng)于VEGF的細(xì)胞増殖或分化測定(例如磷酸化測定)、使用體外或體內(nèi)模型抑制癌細(xì)胞和/或腫瘤生長。其他測定可以測試本文所述的抗體阻斷正常VEGF/KDR-介導(dǎo)的應(yīng)答的活性，例如但不限于KDR的磷酸化、血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞増殖。本文所述的抗體也可以被測試以對于KDR受體內(nèi)化、體外和體內(nèi)效果等的作用。在進(jìn)ー步的實施方案中，本文抗體可使用合適的動物模型體內(nèi)測試。本文所述的抗體可體外或體內(nèi)測試它們抑制腫瘤生長的能力。這些測定可以使用熟練技術(shù)人員已知的良好建立的方案來進(jìn)行(例如參見Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ.Assoc.1nc.& John Wiley &Sons,Inc.,NY,NY) ；Current Protocols in Immunology(Edited by:John E.Coligan,AdaM.Kruisbeek, David H.Margulies, Ethan M.Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley& Sons, NY, NY);或市售試劑盒。在某些實施方案中，本發(fā)明還提供編碼如本文所述的抗體或其抗原-結(jié)合片段的分離的核酸，例如編碼如本文所述的CDR或者VH或VL結(jié)構(gòu)域的核酸。核酸包括DNA和RNA。這些和相關(guān)的實施方案可包括編碼結(jié)合如本文所述的KDR的抗體的多核苷酸。如本文所使用的，術(shù)語"分離的多核苷酸"意思為基因組、cDNA或合成源或一些其組合的多核苷酸，通過其源，分離的多核苷酸(I)不 關(guān)聯(lián)于其中天然發(fā)現(xiàn)分離的多核苷酸的多核苷酸的所有或一部分，(2)連接至多核苷酸，所述多核苷酸天然是未連接的，或(3)在天然下不作為更大序列的一部分而產(chǎn)生。術(shù)語"可操作地連接"是指該術(shù)語應(yīng)用的組分處于這樣的關(guān)系，其使它們在合適的條件下實施它們內(nèi)在的功能。例如，"可操作地連接"至蛋白編碼序列的轉(zhuǎn)錄控制序列與其綁扎，使得蛋白編碼序列的表達(dá)在和控制序列的轉(zhuǎn)錄活性相容的條件下實現(xiàn)。如本文所使用的，術(shù)語"控制序列"是指多核苷酸序列，其可以影響它們綁扎或可操作地連接的編碼序列的表達(dá)、加工或細(xì)胞內(nèi)定位。這些控制序列的性質(zhì)可取決于宿主微生物。在特定的實施方案中，用于原核生物的轉(zhuǎn)錄控制序列可以包括啟動子、核糖體結(jié)合部位和轉(zhuǎn)錄終止序列。在其他特定的實施方案中，用于真核生物的轉(zhuǎn)錄控制序列可以包括啟動子，包含用于轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止序列和聚腺苷酸化序列的一個或多個識別部位。在某些實施方案中，"控制序列"可以包括前導(dǎo)區(qū)序列和/或融合配偶序列。本文涉及的術(shù)語"多核苷酸"是指單鏈或雙鏈的核酸高分子。在某些實施方案中，包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸、或者核苷酸任一類型的修飾形式。所述修飾包括堿基修飾例如溴尿核苷、核糖修飾例如阿拉伯糖苷和2'，3' -二脫氧核糖、以及內(nèi)核苷酸連接修飾例如硫代磷酸酷，ニ硫代磷酸酷，phosphoroselenoate,phospnorodiseienoate, pnosphoroanilothioate, phoshoraniladate 和貧是憐酸酷。術(shù)語"多核苷酸"特別包括單鏈和雙鏈形式的DNA。術(shù)語"天然存在的核苷酸"包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。術(shù)語"修飾的核苷酸"包括具有修飾的或取代的糖基等的核苷酸。術(shù)語"寡核苷酸連接"包括寡核苷酸連接，例如硫代磷酸酷，ニ硫代磷酸酷，phosphoroselenoate, phosphorodiselenoate,phosphoroanilothioate, phoshoraniladate,氨基憐酸酯等。例如參見 LaPlanche et al.,1986, Nuc1.Acids Res.，14:9081 ；Stec et al.，1984, J.Am.Chem.Soc.，106:6077 ；Steinet al.,1988, Nucl.Acids Res.,16:3209 ；Zon et al., 1991, Ant1-Cancer Drug Design,6:539 ；Zon et al.，1991， OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES:A PRACTICAL APPROACH,pp.87-108(F.Eckstein,Ed.), Oxford University Press,Oxford England ；Stec et al.,美國專利 N0.5，151，510 ;Uhlmann and Peyman, 1990, Chemical Reviews, 90:543,出于任何目的，其公開通過引用的方式并入此處。寡核苷酸可包括可檢測的標(biāo)記以能夠檢測寡核苷酸或其雜交。術(shù)語"載體"用于是指用于將編碼信息轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞的任何分子(例如核酸、質(zhì)粒或病毒)。術(shù)語"表達(dá)載體"是指這樣的載體，其適于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并且含有指導(dǎo)和/或控制插入的異源性核酸序列的表達(dá)的核酸序列。表達(dá)包括但不限于加工，例如轉(zhuǎn)錄、翻譯和RNA剪接(如果存在內(nèi)含子)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是，多核苷酸可包括基因組序列、外-基因組和質(zhì)粒-編碼的序列、以及更小的工程化的基因區(qū)段(其表達(dá)或可適于表達(dá)蛋白、多肽、肽等)。這些區(qū)段可以是天然分離的，或被熟練技術(shù)人員合成修飾的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還認(rèn)識到的是，多核苷酸可以是單鏈(編碼或反義)或雙鏈的，并且可以是DNA(基因組、cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子可包括:HnRNA分子，其含有內(nèi)含子并且以單對單方式對應(yīng)于DNA分子；和mRNA分子，其不含內(nèi)含子。另外編碼或非編碼序列可以但非必需存在于根據(jù)本公開的多核苷酸內(nèi)，并且多核苷酸可以但非必需連接其他分子和/或負(fù)載材料。多核苷酸可以包含天然序列或可以包含編碼這種序列的變體或衍生物的序列。因此，根據(jù)這些和相關(guān)的實施方案，本公開還提供編碼本文所述的抗-KDR抗體的多核苷酸。在某些實施方案中，提供包含編碼如本文所述的抗體的多核苷酸序列中的ー些和全部的多核苷酸、以及這種多核苷酸的組分。在其他相關(guān)的實 施方案中，多核苷酸變體可以和編碼本文所述的抗-KDR抗體的多核苷酸序列具有基本上的一致性。例如，使用本文所述的方法(例如如下面所述，使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析)，多核苷酸可以是多核苷酸，包含相比于參比多核苷酸序列(例如編碼本文所述的抗體的序列)具有至少70%序列一致性，優(yōu)選至少75%，80%，85%，90%，95 %，96 %，97 %，98 %或99 %或更高的序列一致性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，通過考慮密碼子退化、氨基酸類似性、閱讀框定位等，這些數(shù)值可以合適的調(diào)節(jié)以確定由兩個核苷酸序列編碼的蛋白的對應(yīng)的一致性。典型地，多核苷酸變體將含有ー種或多種取代、増加、缺失和/或插入，優(yōu)選使得相對于由本文特異性闡述的多核苷酸序列編碼的抗體，由變體多核苷酸編碼的抗體的結(jié)合親合力并未實質(zhì)上減弱。在某些其他相關(guān)的實施方案中，多核苷酸片段可以包含或者基本上由下列構(gòu)成:各種長度的連續(xù)序列延續(xù)，其等同于或互補(bǔ)于編碼如本文所述的抗體的序列。例如，提供多核苷酸，包含或者基本上由下列構(gòu)成:至少約5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，110，120，130，140，150，200，300，400，500 或 1000 或更多個連續(xù)核苷酸序列，其編碼本文所公開的抗體或其抗原-結(jié)合片段以及它們之間的所有的中間長度。在上下文中，容易理解"中間長度"是指引用數(shù)值之間的任何長度，例如50，51,52,53 等;100，101，102，103 等;150，151，152，153 等；包括 200-500 之間的所有整數(shù)；500-1, 000等。本文所述多核苷酸序列可以在一端或兩端通過天然序列中未發(fā)現(xiàn)的另外核苷酸而延伸。該另外序列可以由下列構(gòu)成:在編碼本文所述的抗體的多核苷酸的任一端處或者編碼本文所述的抗體的多核苷酸的兩端處的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19 或 20 個核苷酸。在另ー實施方案中，提供多核苷酸，其能夠在中度至高度嚴(yán)格條件下雜交編碼本文提供的抗體或其抗原-結(jié)合片段的多核苷酸序列、或其片段、或其互補(bǔ)序列。雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域熟知的。為了描述，用于測試本文提供的多核苷酸和其他多核苷酸雜交的合適的中度嚴(yán)格條件包括在5X SSC,0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中預(yù)洗滌；在500C-60°C, 5X SSC下雜交過夜；接著在65°C下分別使用含有0.1% SDS的2X，0.5X和0.2XSSC洗滌兩次20分鐘。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，雜交的嚴(yán)格程度可以容易地操縱，例如通過改變雜交溶液的鹽含量和/或進(jìn)行雜交的溫度。例如，在另ー實施方案中，合適的高度嚴(yán)格的雜交條件包括上述那些，除了雜交溫度升高至例如60°C -65°C或65°C _70°C。在某些實施方案中，上述多核苷酸，例如多核苷酸變體、片段和雜交序列、結(jié)合KDR的編碼抗體或其抗原-結(jié)合片段。在其他實施方案中，這些編碼抗體或抗原-結(jié)合片段或其⑶R的多核苷酸結(jié)合KDR至少約50%、至少約70%，并且在某些實施方案中，至少約90%、以及本文具體闡述的抗體序列。在進(jìn)ー步的實施方案中，這些編碼抗體或抗原-結(jié)合片段或其⑶R的多核苷酸以比本文闡述的抗體更大的親合力結(jié)合KDR，例如，以至少約105%，106%，107%，108%，109%或110%、以及本文具體闡述的抗體序列定量地結(jié)合。 如本文其他部分所述，代表性多肽(例如，本文提供的變體KDR-特異性抗體，例如具有本文提供的抗原-結(jié)合片段的抗體蛋白)的三維結(jié)構(gòu)的確定可以通過常規(guī)方法來確定，使得一種或多種氨基酸取代、增加、缺失或插入選擇的天然或非天然氨基酸可以事實上建摸，以為了確定是否這樣衍生的結(jié)構(gòu)變體保留目前公開的物種的空間充填性能。熟練技術(shù)人員已知各種計算機(jī)程序來確定抗體內(nèi)合適的氨基酸取代(或編碼氨基酸序列的合適的多核苷酸)，使得例如保 持親合力或?qū)崿F(xiàn)更佳親合力。本文所述的多核苷酸或其片段，無論編碼序列本身的長度，可以聯(lián)合其他DNA序列，例如啟動子、聚腺苷酸化信號、另外限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、其他編碼區(qū)段等，使得它們的總長度可以較大的改變。因此涵蓋，可以使用幾乎任何長度的核酸片段，其中總長度優(yōu)選被制備的容易性和在預(yù)期重組DNA方案中的用途限定。例如，涵蓋總長度約10，000，約5000，約3000，約2，000，約I, 000，約500，約200，約100，約50個堿基對長度等(包括所有中間長度)的示意性多核苷酸區(qū)段是有用的。當(dāng)比較多核苷酸序列時，如下面所述當(dāng)比對最大相應(yīng)時，如果兩種序列中的核苷酸序列是相同的，則兩種序列據(jù)稱是“相同的”。兩種序列之間的比較典型地通過下列方式進(jìn)行:相對于比較窗比較序列，以鑒定和比較序列類似的局部區(qū)域。如本文所使用，“比較窗”是指至少約20個、30至約75、40至約50個連續(xù)位置的區(qū)段，其中在兩種序列最佳比對后，序列可以比較相同數(shù)量的連續(xù)位置的參比序列。為了比較，序列的最佳比對可以使用bioinformatics軟件(DNASTAR, Inc.,Madison, WI)的Lasergene suite中的Megalign程序、利用缺省參數(shù)來進(jìn)行。該程序?qū)崿F(xiàn)下列參考文獻(xiàn)中所述的數(shù)種比對圖:Dayhoff, M.0.(1978)A model of evolutionarychange in protems-Matrices lor detecting distant relationships, in Dayhoff,M.0.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical ResearchFoundation, Washington DC Vol.5, Supp1.3, pp.345-358 ；Hein J., Unified Approachto Alignment and Phylogenes, pp.626-645 (1990) ；Methods in Enzymology vol.183,Academic Press, Inc., San Diego, CA ；Higgins, D.G and Sharp, P.M., CABIOS 5:151-153(1989) ；Myers, E.ff.and Muller ff., CAB10S4:11-17(1988) ；Robinson, E.D.，Comb.Theor 11:105(1971) ；Santou, N.Nes, M.，Mol.Biol.Evol.4:406-425(1987)；Sneath, P.H.A.and Sokal, R.R., Numerical Taxonomy-the Principles and PracticeofNumerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA(1973) ；ffilbur, ff.J.andLipman, D.J.，Proc.Natl.Acad.，Sc1.USA 80:726-730 (1983)?；蛘?，為了比較，序列的最佳比對可以通過下列方式來進(jìn)行:Smith andWaterman,Add.APL.Math 2:482(1981)的局部一致性算法、Needleman and Wunsch, J.Mol.Biol.48:443 (1970)的一致性比對算法、Pearson and Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:2444(1988)的類似方法的查詢、這些算法的計算機(jī)實施(Wisconsin GeneticsSoftware Package, Genetics Computer Group (GCG),575 Science Dr., Madison, WI 中的GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 和 TFASTA)或通過檢查。適于確定序列一致性和序列類似性百分比的ー種算法的優(yōu)選例子是BLAST和BLAST 2.0 算法，其分別描述于 Altschul et al., Nucl.Acids Res.25:3389-3402 (1977)和 Altschul et al.，J.Mol.Biol.215:403-410 (1990)。BLAST 和 BLAST 2.0 例如可以使用本文所述的參數(shù)以確定兩種或多種多核苷酸之間的序列一致性百分比。進(jìn)行BLAST分析的軟件通過 National Center for Biotechnology Information 公共可得。在一個不意性例子中，對于核苷酸序列，累積得分可以使用參數(shù)M(對于一對匹配殘基獎勵分?jǐn)?shù)；一直> 0)和N(對于失配殘基懲罰分?jǐn)?shù)；一直< 0)來計算。當(dāng)累計比對評分從其達(dá)到的最大值下降數(shù)量X吋；當(dāng)累計評分由于累積一個或多個負(fù)分殘基比對而下降到零或以下時；當(dāng)達(dá)到ニ序列之一的未端時；停止各方向 命中詞的延伸。BLAST算法參數(shù)W、T和X確定了該算法的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默認(rèn)值詞長(W)為11，期望值(E)為 10，BLOSUM 62 評分矩陣(見 Henikoff and Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89:10915(1989))比對，B為50，期望值(E)為10，M = 5，N = 4，并比較兩條鏈。在某些實施方案中，對于兩個序列最佳比対，“序列一致性百分比”的測定宜通過比較最佳比對的兩序列的至少20個位置的比較窗ロ，該比較窗ロ中的多核苷酸或多肽序列部分與參比序列(不含有添加或缺失)相比可含有20%或不到、通常5-15%或10-12%的添加或缺失(即空格)。計算此百分比通過測定核酸堿基相同的位置數(shù)目，產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，將該匹配位置數(shù)目除以參比序列的位置總數(shù)(即窗ロ大小)，再乘以100，得出序列一致性百分比。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到的是，由于基因編碼的退化，存在多種編碼如本文所述的抗體的核苷酸序列。這些多核苷酸中的ー些具有和編碼結(jié)合KDR的抗體的天然或初始多核苷酸序列的核苷酸序列的最小的序列一致性。然而，本公開明確地涵蓋由于密碼子用途的差別而改變的多核苷酸。在某些實施方案中，特異性涵蓋密碼子優(yōu)化以用于哺乳動物表達(dá)的序列。因此，在本發(fā)明的另ー實施方案中，突變方案例如定點(diǎn)突變可以用于制備本文所述的抗體的變體和/或衍生物。通過該方案，多肽序列中的特異性修飾可以通過構(gòu)成它們的潛在多核苷酸的突變而進(jìn)行。這些技術(shù)提供簡單方案以制備和測試序列變體，例如，通過將ー個或多個核苷酸序列改變引入多核苷酸而并入ー種或多種上述考慮。定點(diǎn)突變通過利用特定寡核苷酸序列產(chǎn)生突變體，該突變體編碼具有所需突變的DNA序列，足夠數(shù)目的毗鄰核苷酸提供足夠大小和序列復(fù)雜性的引物序列，以形成橫跨缺失連接區(qū)兩側(cè)的穩(wěn)定雙鏈體。利用所選多核苷酸序列中的突變提高、改變、降低、修飾或改變該多核苷酸本身的性能和/或改變其編碼多肽的性能、活性、組成、穩(wěn)定性或ー級序列。在某些實施方案中，本發(fā)明涵蓋編碼本文所公開的抗體或其抗原-結(jié)合片段的多核苷酸序列的突變，以改變編碼的多肽的ー種或多種性能，例如抗體或其抗原-結(jié)合片段的結(jié)合親合力、或特定Fe區(qū)的功能、或特定Fe Y R的Fe區(qū)的親合力。定點(diǎn)突變技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，并且廣泛用于產(chǎn)生多肽和多核苷酸的變體。例如，定點(diǎn)突變通常用于改變DNA分子的特異性部分。在這些實施方案中，使用典型地包含約14至約25個核苷酸或這樣長度的引物，在序列交點(diǎn)的兩側(cè)上約5至約10個殘基改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到的是，定點(diǎn)突變技術(shù)常采用單鏈和雙鏈形式的噬菌體載體。用于定點(diǎn)突變的典型載體包括載體例如M13噬菌體。這些噬菌體是容易市售獲得的，其用途一般為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。定向的突變也常規(guī)采用雙鏈質(zhì)粒來取消將目標(biāo)基因從質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到噬菌體的步驟。通常，進(jìn)行上述定點(diǎn)突變的第一步是獲得單鏈載體或使雙鏈載體的兩條鏈解離分開(在其序列內(nèi)含有編碼所需肽的DNA序 列)。制備攜帶有所需突變復(fù)序列的寡核苷酸引物(用合成法)。然后使該引物與單鏈載體退火結(jié)合，經(jīng)DNA聚合酶例如E.coli聚合酶IKlenow片段作用，完成含突變鏈的合成。因此，形成的異質(zhì)雙鏈體中一條鏈編碼初始非突變序列，第二條鏈含有所需的突變。然后用此異質(zhì)雙鏈體載體轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞，并選擇含有攜帯突變序列重組載體的克隆。用定點(diǎn)突變法制備所選肽編碼DNA區(qū)段的序列變體提供一種產(chǎn)生可能有用序列的方法，但不意味著限于用這些方法來獲得肽的序列變體及其編碼DNA序列。例如可用突變劑如羥胺處理編碼所需肽序列的重組載體以獲得序列變體。關(guān)于這些方法和方案的具體細(xì)節(jié)見 Maloy et al., 1994 ；Segal, 1976 ；Prokop and Bajpai, 1991 ;Kuby, 1994 ;和Maniatis et al.，1982的教導(dǎo)，處于各種目的，其通過引用的方式并入。如本文所使用，術(shù)語“寡核苷酸定向的突變過程”是指模板依賴過程和載體介導(dǎo)的増殖將導(dǎo)致特異性核酸分子的濃度比其初始濃度升高，或可檢測信號如擴(kuò)增物的濃度升高。如本文所使用，術(shù)語“寡核苷酸定向的突變過程”是指模板依賴的引物分子延伸過程。術(shù)語模板依賴分子指RNA或DNA分子的核酸合成，其中新合成的核酸鏈序列由熟知的互補(bǔ)性堿基配對規(guī)律所決定(例如參見，Watson，1987)。典型地，載體介導(dǎo)的方法涉及將核酸片段導(dǎo)入DNA或RNA載體中，克隆擴(kuò)增此載體，回收擴(kuò)增的核酸片段。這些方法的例子由美國專利N0.4，237，224提供，其通過引用的方式全部特異地并入本文。在制備多肽變體的另外方案中，可以使用美國專利N0.5，837，458中所述的遞歸序列重組。在該方案中，進(jìn)行重組和篩選或選擇的迭代循環(huán)以“進(jìn)化”具有例如增強(qiáng)的結(jié)合親合力的単獨(dú)多核苷酸變體。某些實施方案還提供質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達(dá)盒形式的構(gòu)建體，其包含如本文所述的至少ー種多核苷酸。在許多實施方案中，編碼題述單克隆抗體的核酸直接引入宿主細(xì)胞，并且在足以誘導(dǎo)編碼的抗體表達(dá)的條件下將細(xì)胞孵育。該公開的抗體使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)聯(lián)合本文提供的多肽和核酸序列來制備。多肽序列可用于確定編碼本文公開的特定抗體的合適的核酸序列。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法，核酸序列可以優(yōu)化以反映各種表達(dá)系統(tǒng)的特定密碼子"偏好"。根據(jù)某些相關(guān)的實施方案，提供重組宿主細(xì)胞，其包含如本文所述的ー種或多種構(gòu)建體；編碼任何抗體，CDR，VH或VL結(jié)構(gòu)域、或其抗原-結(jié)合片段的核酸；和制備編碼的產(chǎn)物的方法，該方法包括將其編碼的核酸進(jìn)行表達(dá)?？梢酝ㄟ^在合適條件下培養(yǎng)含有核酸的重組宿主細(xì)胞來便利地實現(xiàn)表達(dá)。在表達(dá)制備后，抗體或其抗原-結(jié)合片段可以使用任何合適的技術(shù)分離和/或純化，然后根據(jù)需要使用。本文提供的抗體或其抗原-結(jié)合片段、和編碼核酸分子與載體可以例如從它們天然環(huán)境以基本上純或同源形式分離和/或純化，或在核酸的情況下不含或基本上不含除了編碼具有期望功能的多肽的序列的核酸或源基因。核酸可以包含DNA或RNA并且可以全部或部分是合成的。涉及本文闡述的核苷酸序列時包括具有特定序列的DNA分子，并且包括具有特定序列的RNA分子，其中U取代T，除非另外需要說明。多肽在各種不同宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)的系統(tǒng)是熟知的。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、哺乳動物細(xì)胞、酵母和桿狀病毒系統(tǒng)。用于表達(dá)異源性多肽的哺乳動物細(xì)胞系是本領(lǐng)域可得的，包括中國倉鼠卵細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼地鼠腎細(xì)胞、NSO小鼠黑素瘤細(xì)胞和多種其他者。通常優(yōu)選的細(xì)菌宿主是E.coli?？贵w和抗原-結(jié)合片段在原核細(xì)胞例如E.coli中的表達(dá)是本領(lǐng)域熟知的。為了綜述，例如參見Pluckthun, A.Bio/Technology 9:545-551(1991)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可得在培養(yǎng)基中的真核細(xì)胞中表達(dá)作為抗體或其抗原-結(jié)合片段的制備的選擇，參見近年來綜述，例如 Ref，M.E.(199 3)Curr.0pinion Biotech.4:573-576 ;Trill J.J.et al.(1995)Curr.0pinion Biotech 6:553-560。合適的載體可被選擇或構(gòu)建，含有合適的調(diào)節(jié)序列，包括啟動子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)志物基因和其他序列(如果需要)。載體可以是質(zhì)粒、病毒例如噬菌體、或噬菌粒(如果需要)。為了進(jìn)一步細(xì)節(jié)，例如參見Molecular Cloning:a Laboratory Manual:2nd edition, Sambrook et al.,1989, Cold Spring HarborLaboratory Press。用于操縱核酸的多種已知技術(shù)和方案，例如在核酸構(gòu)建體制備中、突變、測序、將DNA引入細(xì)胞和基因表達(dá)、以及蛋白分析詳細(xì)描述于Molecular Biology,Second Edition, Ausubel et al.eds., John Wiley & Sons, 1992 中目前方案中或隨后更新中。術(shù)語"宿主細(xì)胞"用于表示其中已經(jīng)引入或能夠引入編碼ー種或多種本文所述抗體的核酸序列的細(xì)胞，其進(jìn)ー步表達(dá)或能夠表達(dá)選擇的目標(biāo)基因，例如編碼任何本文所述抗體的基因。該術(shù)語包括親本細(xì)胞的后代，無論是否該后代在形態(tài)學(xué)上或基因構(gòu)成上相同于初始親本，只要選擇的基因存在即可。因此，還涵蓋包括將這些核酸引入宿主細(xì)胞的方法。該引用可使用任何可得技木。對于真核細(xì)胞，合適的技術(shù)可包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖，電穿孔，使用逆轉(zhuǎn)錄酶病毒或其他病毒(例如牛痘)的脂質(zhì)體-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)，對于昆蟲細(xì)胞為桿狀病毒。對于細(xì)菌細(xì)胞，合適的技術(shù)可包括氯化鈣轉(zhuǎn)化，電穿孔和使用噬菌體的轉(zhuǎn)染。引入后面是引起或允許核酸表達(dá)，例如在用于基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。在一個實施方案中，核酸引入宿主細(xì)胞的基因組(例如染色體)中。依照標(biāo)準(zhǔn)方法，通過包括促進(jìn)和基因組重組的序列來促進(jìn)引入。在某些實施方案中，本發(fā)明還提供這樣的方法，其包括在表達(dá)系統(tǒng)中使用上述構(gòu)建體以表達(dá)特定多肽，例如如本文所述的KDR-特異性抗體。術(shù)語"轉(zhuǎn)導(dǎo)"用于表示將基因從ー種細(xì)菌轉(zhuǎn)移至另ー種，通常通過噬菌體。"轉(zhuǎn)導(dǎo)"還是指通過逆轉(zhuǎn)錄酶病毒來獲取和轉(zhuǎn)移真核細(xì)胞序列。術(shù)語"轉(zhuǎn)染"用于表示外部或外源性DNA被細(xì)胞的攝取，并且當(dāng)外源性DNA引入到膜內(nèi)時細(xì)胞被"轉(zhuǎn)染"。多種轉(zhuǎn)染技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，并且是本文所公開的。例如，參見Graham et al., 1973, Virology 52:456 ;Sambrook et al., 2001,MOLECULARCLONING，A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratories ；Davis et al.，1986，BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Elsevier ;和 Chu et al.,1981,Gene 13:197。這些技術(shù)可用于將ー種或多種外源性DNA部分引入合適的宿主細(xì)胞中。如本文所使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"是指細(xì)胞的基因特性的變化，并且當(dāng)其被修飾以含有新DNA時，細(xì)胞已經(jīng)轉(zhuǎn)化。例如，如果其被從其天然狀態(tài)基因修飾，細(xì)胞被轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)后，轉(zhuǎn)化DNA可以通過物理引入到細(xì)胞的染色體中而和其細(xì)胞的DNA重組，或者可臨時保持為游離基因元件而不會被復(fù)制，或者可作為質(zhì)粒獨(dú)立地復(fù)制。當(dāng)DNA被細(xì)胞的部分復(fù)制時，細(xì)胞被認(rèn)為已經(jīng)被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化。當(dāng)結(jié)合生物材料(如核酸分子、多肽、宿主細(xì)胞等)使用時術(shù)語"天然存在的"或"天然"是指在天然中發(fā)現(xiàn)和不被人操縱的材料。類似地，如本文所使用的，"非天然存在的"或"非天然"是指材料未在天然中發(fā)現(xiàn)或已經(jīng)被人結(jié)構(gòu)修飾或合成。術(shù)語"多肽"、"蛋白"和"肽"以及"糖蛋白"互換地使用，并且是指不限定任何特定長度的氨基酸高分子。術(shù)語不`排除修飾，例如十四烷基化、硫酸化、糖基化、磷酸化以及信號序列的増加或缺失。術(shù)語"多肽"或"蛋白"是指ー個或多個氨基酸鏈，其中各鏈包含通過肽鍵共價連接的氨基酸，并且其中所述多肽或蛋白可包括非共價和/或通過肽鍵共價連接多個鏈，其具有天然蛋白序列，即蛋白通過天然存在和特異地非重組細(xì)胞、或基因工程化或重組細(xì)胞產(chǎn)生，并且包含具有天然蛋白的氨基酸序列的分子、或缺失、増加和/或取代ー個或多個天然序列氨基酸的分子。術(shù)語"多肽"和"蛋白"特定地包括結(jié)合本公開的KDR的抗體，或缺失、增加和/或取代ー個或多個抗-KDR抗體的氨基酸的序列。因此，"多肽"或"蛋白"可以包含ー個(稱為"単體")或多個(稱為"高分子")氨基酸鏈。本文涉及的術(shù)語"分離的蛋白"是指題述蛋白(I)不含至少ー些其他典型地在天然中發(fā)現(xiàn)的蛋白，(2)基本上不含來自相同源的其他蛋白，例如來自相同物種的蛋白，(3)通過來自不同物種的細(xì)胞表達(dá)，(4)從其本質(zhì)上相關(guān)聯(lián)的至少約50%的多核苷酸、脂質(zhì)、糖類或其他材料中分離，(5)不相關(guān)聯(lián)(共價或非共價相互作用)一部分蛋白("分離的蛋白"本質(zhì)上相關(guān)聯(lián))，(6)可操作地關(guān)聯(lián)(共價或非共價相互作用)本質(zhì)上不關(guān)聯(lián)的多肽，或⑵天然不會產(chǎn)生。這種分離的蛋白可以由基因組DNA，cDNA，mRNA或其他RNA編碼，其可以是合成源或任何組合。在某些實施方案中，分離的蛋白基本上不含在其天然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的蛋白或多肽或其他污染物，其將干擾使用(治療、診斷、預(yù)防、研究或其他)。術(shù)語"多肽片段"是指可以是單體或高分子的多肽，其氨基-末端缺失，羧基-末端缺失，和/或內(nèi)部缺失或取代天然存在的或重組制備的多肽。在某些實施方案中，多肽片段可包含至少5至約500個氨基酸長度的氨基酸鏈。在某些實施方案中，將意識到的是，片段至少 5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，110，150，200，250，300，350，400 或 450 個氨基酸長度。特定有用的多肽片段包括功能結(jié)構(gòu)域，包括抗體的抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或片段。在抗-KDR抗體的情況下，有用的片段包括但不限于=CDR區(qū)，特別是重鏈或輕鏈的CDR3區(qū)；重鏈或輕鏈的可變區(qū)；一部分抗體鏈或僅僅其可變區(qū)(包括兩個CDR)等。多肽可以在蛋白的N-終端包含信號(或前導(dǎo)區(qū))序列，其共翻譯地或后翻譯地定向轉(zhuǎn)移蛋白。多肽還可以框內(nèi)融合或綴合接頭或其他序列以易于合成、純化或鑒別多肽(例如聚-His)，或增強(qiáng)多肽和固體載體的結(jié)合。肽接頭/間隔物序列還可用于通過足以確保各多肽折疊為其ニ級和/或三級結(jié)果(如果需要)的距離來分離多種多肽組分。這種肽接頭序列可以使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來引入融合多肽中。某些肽間隔物序列可以例如基于下列來選擇:(I)采用靈活延伸的構(gòu)象的能力；(2)采用可以和第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的ニ級結(jié)構(gòu)的它們的能力；和/或⑶缺少可以和多肽功能性表位反應(yīng)的疏水性或帶電殘基。在一個示意性實施方案中，肽間隔物序列含有例如Gly，Asn和Ser殘基。其他鄰近中性氨基酸例如Thr和Ala也可以包括在間隔物序列中?？梢杂杏玫赜米鏖g_物的其他氨基酸序列包括Maratea et al., Gene40:3946(1985) ；Murphy et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 83:8258 8262(1986);美國專利N0.4，935，233和美國專利N0.4，751，180中公開的那些。其他示意性間隔物可以包括例如Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp(Chaudhary et al.,1990, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.87:1066-1070)矛ロ Lys_Glu_Ser_G·ly_Ser_Val_Ser_Ser_Glu_Gln_Leu—Ala_Gln_Phe—Arg_Ser_Leu—Asp(Bird et al.，1988，Science 242:423-426)。在一些實施方案中，當(dāng)?shù)谝缓偷诙嚯木哂蟹潜匦鐽-末端氨基酸區(qū)域(可用于分離功能結(jié)構(gòu)域和防止位阻影響)時，不需要間隔物序列。兩種編碼序列可以直接融合而沒有任何間隔物或使用撓性聚接頭(例如由重復(fù)I至3次的五聚體Gly-Gly-Gly-Gly-Ser構(gòu)成)。這種間_物用于通過下列方式來構(gòu)建單鏈抗體(scFv):插入在VH和VL之間(Bird etal.，1988, Science242:423-426 ；Huston et al.，1988, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.85:5979-5883)。在某些實施方案中，肽間隔物被設(shè)計為能夠在形成單鏈抗體的可變區(qū)的兩個^-片之間進(jìn)行正確的相互作用。在某些示意性實施方案中，肽間隔物為I至5個氨基酸、5至10個氨基酸、5至25個氨基酸、5至50個氨基酸、10至25個氨基酸、10至50個氨基酸、10至100個氨基酸、或任何干擾范圍的氨基酸。
在其他示意性實施方案中，肽間隔物包含約1，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50
或更長氨基酸的長度。涵蓋本文所述的抗體的氨基酸序列修飾。例如，可以期望改善抗體的結(jié)合親合力和/或其他生物學(xué)性能。例如，抗體的氨基酸序列變體可通過下列方式來制備:將合適的核苷酸變化引入編碼抗體或其A鏈的多核苷酸，或肽合成。這種修飾包括例如在抗體的氨基酸序列內(nèi)缺失和/或插入和/或取代殘基。可以進(jìn)行缺失、插入和取代的任何組合以實現(xiàn)最終的抗體，條件是最終構(gòu)建體具有期望特性(例如和KDR的高親合力結(jié)合)。氨基酸變化還可以改變抗體的后翻譯過程，例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)量或位置。用于本發(fā)明多肽的上述任何變化和修飾可包括在本發(fā)明的抗體中。本公開提供本文所公開的抗體的變體。在某些實施方案中，這些變體抗體或抗原-結(jié)合片段、或其CDR結(jié)合KDR至少約50%，至少約70%，并且在某些實施方案中，至少約90%、以及本文具體闡述的抗體序列。在進(jìn)ー步的實施方案中，這些變體抗體或抗原-結(jié)合片段、或其⑶R以比本文闡述的抗體更大的親合力結(jié)合KDR，例如以至少約105%,106%,107%，108%，109%或110%、以及本文具體闡述的抗體序列定量地結(jié)合。在特定的實施方案中，題述抗體可具有:a)氨基酸序列和本文所述的抗-KDR抗體的重鏈可變區(qū)具有至少80%—致性，至少95%—致性，至少90%，至少95%或至少98%或99%—致性的重鏈可變區(qū)；和b)氨基酸序列和本文所述的抗-KDR抗體的輕鏈可變區(qū)具有至少80%—致性，至少85%，至少90%，至少95%或至少98%或99%—致性的輕鏈可變區(qū)。示意性重鏈和輕鏈區(qū)域的氨基酸序列闡述于SEQ ID N0:l，2，9和10。在特定的實施方案中，抗體可包含:a)重鏈可變區(qū)包含:1.氨基酸序列和本文所述的選擇的抗體的重鏈CDRl區(qū)相同的CDRl區(qū)；ii氨基酸序列和選擇的抗體的重鏈CDR2區(qū)相同的CDR2區(qū)；和ii1.氨基酸序列和選擇的抗體的重鏈CDR3區(qū)相同的CDR3區(qū)；以及b)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，包含:1.氨基酸序列和選擇的抗體的輕鏈CDRl區(qū)相同的CDRl區(qū)；i1.氨基酸序列和選擇的抗體的輕鏈CDR2區(qū)相同的CDR2區(qū)；和ii1.氨基酸序列和選擇的抗體的輕鏈CDR3區(qū)相同的CDR3區(qū)；其中抗體特異性結(jié)合選擇的靶(例如KDR)。在進(jìn)ー步實施方案中，抗體或其抗原-結(jié)合片段是變體，抗體，其中變體包含除了 VH和VL區(qū)的CDR區(qū)中的至多8，9，10，11，12，13，14，15或更多個氨基酸取代和選擇的抗體相同的重鏈和輕鏈。在這點(diǎn)上，在選擇的抗體的⑶R區(qū)中可以是1，2，3，4，5，6，7，8個，或者在某些實施方案中9，10，11，12，13，14，15更多個氨基酸取代。VH和/或VL區(qū)的⑶R中可進(jìn)行取代(例如參見Muller,1998, Structure 6:1153-1167)。代表性多肽(例如，本文提供的變體KDR-特異性抗體、本文提供的具有抗原-結(jié)合片段的抗體蛋白)的三維結(jié)構(gòu)的確定可以通過常規(guī)方法來確定，使得一種或多種氨基酸取代、増加、缺失或插入選擇的天然或非天然氨基酸可以事實上建摸，以為了確定是否這樣衍生的結(jié)構(gòu)變體保留目前公開的物種的空間充填性能。例如參見Donateet al., 1994Prot.Sc1.3:2378 ；Bradley et al., Science 309: 1868-1871 (2005)；Schueler-Furman et al., Science310:638(2005) ；Dietz et al., Proc.Nat.Acad.Sc1.USA 103:1244 (2006) ；Dodson et al., Nature 450:176(2007) ；Qian et al., Nature 450:259(2007) ；Raman et al.Science 327:1014-1018(2010)?？捎糜谶@些和相關(guān)實施方案的一些另外和非限制性計算機(jī)算法的例子， 例如用于本文提供的KDR-特異性抗體抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的合理設(shè)計，包括:VMD，其是使用3-D圖像和構(gòu)建腳本來展示、修建和分析較大生物分析體系的分子可視化程序(參見 Theoretical and Computational Biophysics Group,University of Illinois at Urbana-Champagne 的網(wǎng)站 ks.uiuc.edu/Research/vmd/。多種其他計算機(jī)程序是本領(lǐng)域已知的，并且為熟練技術(shù)人員可得，其允許從能量最小化構(gòu)象的空間填充模型(范德華半徑)來確定原子尺寸；GRID，其尋求確定不同化學(xué)基團(tuán)的高親合力區(qū)域，從而增強(qiáng)結(jié)合；Monte Carlo檢索,其計算數(shù)學(xué)比對；以及CHARMM (Brooks etal.(1983) J.Comput.Chem.4:187-217)和 AMBER (Weiner et al(1981) J.Comput.Chem.106:765),其評價カ場計算和分析(還參見 Eisenfield et al.(1991) Am.J.Physiol.261:C376-386 ;Lybrand(1991)J.Pharm.Belg.46:49-54 ；Froimowitz (1990)Biotechniques 8:640-644；Burbam et al.(1990)Proteins 7:99-111 ；Pedersen(1985)Environ.HealthPerspect.61:185-190 dPKini et al.(1991) J.Biomol.Struct.Dyn.9:475-488)。各種合適的計算性計算機(jī)程序也是市售可得的，例如來自Schr6dinger (Munich, Germany)。在本發(fā)明的另ー實施方案中，抗-KDR抗體及其人源化版本源自兔單克隆抗體，并且特別地使用RabMAb 技術(shù)產(chǎn)生。這些抗體是有利的，因為它們要求最小序列修飾，從而促進(jìn)在使用突變家系引導(dǎo)(MLG)的人源化技術(shù)(例如參見美國專利N0.7，462，697)人源化之后保持功能性能。因此，制備本公開的抗-KDR抗體的示意性方法包括RabMab 兔單克隆抗體技術(shù)，例如描述于美國專利5，675，063和7，429，487。在這點(diǎn)上，在某些實施方案中，本公開的抗-KDR抗體在兔中產(chǎn)生。在特定的實施方案中，能夠融合兔脾細(xì)胞的免-源永生B-淋巴細(xì)胞用于產(chǎn)生雜交細(xì)胞(其制備抗體)。永生B-淋巴細(xì)胞不會可檢測地表達(dá)內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈，并且在某些實施方案中可含有改變的免疫球蛋白重鏈-編碼基因。組合物和使用方法本公開提供包含KDR-特異性抗體或其抗原-結(jié)合片段的組合物、和在各種治療環(huán)境中這種組合物的施用。純的形式或在合適的藥物組合物中的本文所述的KDR-特異性抗體的施用可以通過服務(wù)類似應(yīng)用的藥劑施用的任何接受的方式來實施。藥物組合物可以通過聯(lián)合抗體或含抗體的組合物和合適的生 理上可接受的媒介物、稀釋劑或賦形劑而制備，并且可配制為固體、半固體、液體或氣體形式的制劑，例如片劑、膠囊劑、粉末劑、顆粒劑、油膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠劑、微球和氣霧劑。此外，其他藥物活性成分(包括本文別處所述的其他抗癌劑)和/或合適的賦形劑(例如鹽、緩沖劑和穩(wěn)定劑)可以存在(但非必需)于組合物內(nèi)。通過多種不同途徑可以實現(xiàn)施用，包括ロ服、腸胃外、鼻腔、靜脈內(nèi)、真皮下、皮下或局部。優(yōu)選的施用方式取決于待治療或預(yù)防的病癥的性質(zhì)。在施用后降低、抑制、預(yù)防或延遲癌癥的發(fā)展和/或轉(zhuǎn)移的量被認(rèn)為是有效的。在某些實施方案中，施加量足以導(dǎo)致腫瘤蛻變，通過活瘤的量的統(tǒng)計學(xué)上顯著地減少(例如腫瘤質(zhì)量降低至少50% )或改變(例如統(tǒng)計學(xué)上顯著地減少)掃描尺寸來指示。在其他實施方案中，施加量足以導(dǎo)致和VEGF或KDR表達(dá)和/或活性相關(guān)的病患癥狀的臨床相關(guān)的減少，包括但不限于各種腫瘤疾病、炎性疾病和血管生成相關(guān)疾病中的任ー種。因此，藥學(xué)上有效量的ー種或多種本文所述的抗體被施用以導(dǎo)致病患癥狀的臨床相關(guān)的減少，包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，糖尿病和缺血性視網(wǎng)膜病變，年齡-相關(guān)的黃斑變性，銀屑病和與蛋白尿相關(guān)的腎小球肥大、以及各種腫瘤疾病，包括血管肉瘤，腎細(xì)胞癌，胃腸癌，轉(zhuǎn)移性胃或胃食管連接部腺癌，乳癌，膀胱癌，肝細(xì)胞癌，結(jié)腸直腸癌，前列腺癌，非小細(xì)胞肺癌，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，卵巣癌，黑素瘤和復(fù)發(fā)性多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，白血病以及實體瘤。這些臨床相關(guān)癥狀是熟練醫(yī)師已知的，并且取決于待治療的疾病而改變。治療的精確劑量和持續(xù)時間是治療的疾病的函數(shù)，并且可以使用已知的測試方案或通過測試本領(lǐng)域已知的模型體系中的組成并從其外推來經(jīng)驗性地確定。還可以進(jìn)行控制的臨床試驗。隨著待減緩的病癥的嚴(yán)重性，劑量也可以改變。藥物組合物通常被配制和施用以發(fā)揮治療上有效的效果，同時使不期望的副作用最小化。組合物可以施用一次，或者可分為多次更小劑量在間斷時間來施用。對于任何特定受試者，根據(jù)個體需要，特定劑量方案可以隨著時間而調(diào)節(jié)。含有KDR-特異性抗體的組合物可以單獨(dú)或聯(lián)合其他已知癌癥治療來施用，例如放射療法、化療法、移植、免疫療法、激素療法、光動カ療法等。組合物還可以聯(lián)合抗生素施用。因此，這些和相關(guān)藥物組合物的典型施用途徑包括但不限于ロ服、局部、透皮、吸入、腸胃外、舌下、面頰、直腸、陰道和鼻內(nèi)。如本文所使用的，術(shù)語腸胃外包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸骨內(nèi)注射或輸注技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案的藥物組合物被配制以使其中含有的活性成分在將組合物施用至患者時生物可利用。將施用至受試者或患者的組合物可以采用一種或多種劑量単位的形式，其中例如片劑可以是單劑量單位，并且本文所述氣霧劑形式的KDR-特異性抗體的容器可保持多劑量單位。制備這些劑型的實際方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或明顯的；例如參見Remington:The Science and Practice ofPharmacy, 20th Edition (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)。在任何情況下，待施用的組合物含有藥學(xué)上有效量的本公開的抗體以依照本文教導(dǎo)來治療目標(biāo)疾病或病癥。藥物組合物可以為固體或液體的形式。在一個實施方案中，媒介物為顆粒，使得組合物為例如片劑或粉末形式。媒介物可以是液體，其中組合物例如是ロ服油、可注射液體或氣霧劑，其可用于例如吸入施用。當(dāng)期望ロ服施用吋，藥物組合物優(yōu)選為固體或液體形式，其中半固體、半液體、混懸和 凝膠形式包括在本文考慮形式中作為固體或液體。作為ロ服的固體組合物，藥物組合物可以被配制為粉末、顆粒、壓片、丸剤、膠囊、咀嚼膠、薄片等。這種固體組合物將典型地含有ー種或多種惰性稀釋劑或可食用媒介物。此夕卜，可以存在下列中的ー種或多種:粘合劑，例如羧甲基纖維素、こ基纖維素、微晶纖維素、黃耆膠或明膠；賦形劑例如淀粉、乳糖或糊精；崩解劑例如海藻酸、海藻酸鈉、Primogel、玉米淀粉等；潤滑劑例如硬脂酸鎂或Sterotex ;助流劑例如膠態(tài)ニ氧化娃；甜味劑例如鹿糖或糖精；調(diào)味劑例如薄荷、水楊酸甲酯或桔味調(diào)味劑；和著色劑。當(dāng)藥物組合物為膠囊(例如明膠膠囊)形式時，除了上述類型的材料，其可含有液體媒介物例如聚こニ醇或油。藥物組合物可以為液體形式，例如酏劑、糖漿、溶液、乳劑或混懸劑。作為兩個例子，液體可以用于ロ服或注射遞送。當(dāng)期望ロ服時，除了本化合物，優(yōu)選組合物含有甜味劑、防腐剤、染料/著色劑、和增味劑中的ー種或多種。在期望注射施用的組合物中，可以包括表面活性劑、防腐剤、潤濕劑、分散劑、混懸劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑和等滲劑中的ー種或多種。如果它們是溶液、混懸液等形式，液體藥物組合物可包括下列助劑中的一種或多種:無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液優(yōu)選生理鹽水、Ringer’ s溶液、等滲氯化鈉、不揮發(fā)性油例如合成單或ニ甘油酯(可用作溶劑或混懸介質(zhì))、聚こニ醇、甘油、丙ニ醇或其他溶劑；抗菌劑例如芐基醇或?qū)αu苯甲酸甲酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或硫酸氫鈉；螯合劑例如こニ胺四こ酸；緩沖劑例如こ酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽、以及用于調(diào)節(jié)毒性的藥劑例如氯化鈉或右旋糖。腸胃外制劑可以包封在安瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多劑量小瓶中。生理鹽水是優(yōu)選的助劑?？勺⑸涞乃幬锝M合物優(yōu)選是滅菌的。期望腸胃外或ロ服的液體藥物組合物應(yīng)該含有本文公開的量的KDR-特異性抗體，使得獲得合適的劑量。典型地，該量為組合物中抗體的至少0.01%。當(dāng)期望ロ服時，該量可以改變?yōu)榻M合物重量的0.1至約70%。某些ロ服藥物組合物含有約4%至約75%的抗體。在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物和制劑被制備為使得在稀釋之前腸胃外劑量單位含有0.01至10重量％的抗體。藥物組合物可期望用于局部施用，在這樣的情況下媒介物可以合適地包括溶液、乳劑、油膏或凝膠基質(zhì)。所述基質(zhì)例如可以包括下列中的ー種或多種:凡士林、羊毛脂、聚こニ醇、蜂蠟、礦物油、稀釋劑例如水和醇、以及乳化劑和穩(wěn)定劑。增稠劑可存在于藥物組合物中以用于局部施用。如果期望用于透皮施用，所述組合物可包含透皮貼劑或離子電滲裝置。藥物組合物可期望用于直腸施用，其為例如栓劑的形式，將在直腸中熔融并且釋放藥物。用于直腸施用的組合物可含有油性基質(zhì)作為合適的非刺激性賦形劑。這些基質(zhì)包括但不限于羊毛脂、可可油和聚こニ醇。藥物組合物可包括多種材料，其修飾固體或液體劑量單位的物理形式。例如，組合物可包括圍繞活性成分形成包衣外殼的材料。形成包衣外殼的材料典型地是惰性的，并且可選自例如砂糖、蟲膠和其他腸溶包衣試劑?；蛘?，活性成分可包封在明膠膠囊中。固體或液體形式的藥物組合物可包括結(jié)合本發(fā)明抗體的藥劑，從而輔助化合物的遞送。可以在該容積中發(fā)揮作用的合適藥劑包括其他單克隆或多克隆抗體、ー種或多種蛋白或脂質(zhì)體。藥物組合物可以基本上由劑量單位構(gòu)成，所述劑量単位可以作為氣霧劑來施用。術(shù)語氣霧劑用于表示從膠態(tài)性質(zhì)至由加壓包裝構(gòu)成的體系的各種體系。遞送可以通過液化或加壓氣體或配送活性成分的合適的泵系統(tǒng)來進(jìn)行。氣霧劑可以在單相、雙相或三相系統(tǒng)中遞送以遞送活性成分。氣霧劑的遞送包 括需要的容器、促進(jìn)劑、閥、子容器等，其在一起可形成試劑盒。本領(lǐng)域技術(shù)人員無需進(jìn)行試驗可確定優(yōu)選的氣霧劑。藥物組合物可以通過藥學(xué)領(lǐng)域熟知的方法來制備。例如，期望通過注射施用的藥物組合物可以通過下列方式來制備:聯(lián)合包含如本文所述的KDR-特異性抗體的組合物和任選的ー種或多種鹽、緩沖劑和/或穩(wěn)定劑、以及無菌稀釋水來形成溶液?？杉尤氡砻婊钚詣┮源龠M(jìn)形成均質(zhì)溶液或混懸液。表面活性劑是這樣的化合物，其和抗體組合物非共價地相互作用以促進(jìn)抗體在水性遞送體系中溶出或均質(zhì)混懸。組合物可以以治療有效量來施用，其將取決于多種因素來改變，包括使用的特異化合物(例如KDR-特異性抗體)的活性；化合物作用的代謝穩(wěn)定性和長度；患者的年齡、體重、大概健康、性別和飲食；施用方式和時間；排泄率；藥物聯(lián)合；特定疾患或病癥的嚴(yán)重性；和提述進(jìn)行療法。通常，治療有效毎日劑量為(70kg哺乳動物)約0.001mg/kg(即0.07mg)至約100mg/kg(即7.0g);優(yōu)選的治療有效劑量為(70kg哺乳動物)約0.0lmg/kg (即0.7mg)至約50mg/kg (即3.5g);更優(yōu)選的治療有效劑量為(70kg哺乳動物)約Img/kg(即70mg)至約25mg/kg(即1.75g)。在某些實施方案中，熟練技術(shù)人員將認(rèn)識到,可優(yōu)選使用以毫克/平方米(即mg/m2)表示的劑量。例如，為了在任何給定物質(zhì)中將mg/kg劑量表示為等同mg/m2劑量,使劑量乘以合適的km因子。在成人中，100mg/kg等同IOOmg/kgx37kg/m2 = 3700mg/m2。例如參見 FDA guidelines for Industry and Reviewers ;還參見 Freireich,EJ,et al.Quantitative comparison of toxicity of anticancer agentsin mouse, rat, dog, monkey and man.Cancer Chemother Rep.1966 ；50(4):219_244。包含本公開的KDR-特異性抗體的組合物還可在一種或多種其他治療劑的施用的同時、之前或之后施用。這種聯(lián)合治療可包括單藥物劑量制劑的施用，去含有本發(fā)明化合物和ー種或多種另外的活性藥劑，以及包含本發(fā)明抗體和均在其自身単獨(dú)藥物劑量制劑中的活性藥物的組合物的施用。例如，如本文所述的抗體和其他活性藥劑可以聯(lián)合單ロ服劑量組合物(例如片劑或膠囊劑)施用至患者，或者以單獨(dú)ロ服劑量制劑施用的各藥劑。類似地，如本文所述的抗體和其他活性藥劑可以聯(lián)合在單腸胃外劑量組合物中施用至患者，例如在鹽水溶液或其他生理可接受的溶液，或者以單獨(dú)腸胃外劑量制劑施用的各藥劑。如果使用單獨(dú)劑量制劑，包含抗體和ー種或多種另外的活性藥劑的組合物可以在基本上同時(即同吋)、或在單獨(dú)較差時間(即依次和任何次序)施用；聯(lián)合治療理解為包括所有這些方案。因此，在某些實施方案中，還涵蓋聯(lián)合一種或多種其他治療劑施用本公開的抗-KDR抗體組合物。這種治療劑在本領(lǐng)域中可接受為標(biāo)準(zhǔn)治療用于如本文所述的特定疾病，例如炎性疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其他炎性疾病)、各種腫瘤疾病和血管生成-介導(dǎo)的疾病(例如但不限于年齡-相關(guān)的黃斑變性)中的任ー種。涵蓋的示例性治療劑包括細(xì)胞因子、生長因子、類固醇、NSAID、DMARD、消炎劑、化療劑、放射治療劑或其他活性藥劑和助劑。在某些實施方案中，本文所公開的抗-KDR抗體可聯(lián)合任何數(shù)量化療劑來施用。化療劑的例子包括:烷化劑，例如噻替派和環(huán)磷酰胺(CYTOXAN );烷基磺酸酷，例如白消安，英丙舒凡和哌泊 舒凡；氮雜環(huán)丙燒，例如benzodopa,卡波醌，meturedopa和uredopa ；こ烯亞胺和三聚氰胺包括六甲蜜胺，曲他胺，trietyIenephosphoramide,triethyIenethiophosphaoramide和三甲基三聚氰胺；氮芥例如瘤可寧，萘氮芥，環(huán)磷酰氮芥，雌氮芥，異環(huán)磷酰胺，氮芥，鹽酸甲氧氮芥，苯丙氨酸氮芥，新氮芥，膽留醇對苯こ酸氮芥，潑尼氮芥，曲洛磷胺，尿嘧啶氮芥；亞硝基脲類例如亞硝脲氮芥，氯脲菌素，福替目丁，環(huán)己亞硝脲，卩密唳亞硝脲，雷諾氮芥；抗生素例如aclacinomysins,放射菌素,氨茴霉素,重氮絲氨酸，爭光霉素，放線菌素C,卡奇霉素，carabicin,洋紅霉素,嗜癌菌素，chromomycins,更生霉素，道諾紅菌素，地托比星，6- ニ氮雜-5-氧代-L-正亮氨酸，阿霉素，表柔比星，依索比星，去甲氧基柔紅霉素，麻西羅霉素，絲裂霉素，霉酚酸，諾加霉素，橄欖霉素，培洛霉素，potfiromycin,嘌呤霉素，三鐵阿霉素，羅多比星，鏈黑菌素，鏈佐星，殺結(jié)核菌素，烏苯美司，凈司他丁，佐柔比星；杭-代謝物例如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物例如ニ甲葉酸，氨甲喋呤，蝶羅呤，曲美沙特；嘌呤類似物例如氟達(dá)拉濱，6-巰基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物例如環(huán)胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、ニ脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他賓、氟尿苷、5-FU;雄激素例如卡魯睪酮、屈他雄酮丙酸鹽、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)脂；抗-腎上腺素例如魯米特、米托坦、曲洛斯坦；葉酸補(bǔ)充劑例如葉酸；醋葡醒內(nèi)酯；醒磷酰胺糖苷；氨基酮戍酸；安吖唳；bestrabucil ;比山群；依達(dá)曲沙；defofamine ;秋水仙月安;地吖醌；依氟鳥氨酸；こ酸elliptinium ;依托格魯；硝酸鎵；輕基脲；香燕多糖；氯尼達(dá)明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；nitracrine ;噴司他丁 ；phenamet ;卩比柔比星；podophyllinic acid ；2~こ基酰肼;月井；PSK.RTM ;丙亞胺；西佐喃；鍺螺胺；細(xì)格孢氮雜酸；三亞胺醌；2，2'，2"-三氯三こ胺；烏拉坦；長春地辛；氮烯唑胺；甘露氮芥；ニ溴甘露醇；ニ溴衛(wèi)矛醇；哌血生；Gacytosine ;阿拉伯糖苷("Ara-C")；環(huán)磷酰胺；噻替派；紫杉燒，例如紫杉醇(TAXOL , Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton, N.J.)和紫杉職(TAXOTERE ., Rhne-Poulenc Rorer, Antony, France)；瘤可寧；gemCitabine ;6_硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲喋呤；鉬類似物例如順氯氨鉬和碳鉬；長春花堿；鉬；依托泊苷(VP-16);異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C ;米托蒽醌；長春新堿；長春瑞賓；navelbine ;諾消靈；表鬼白毒噻吩糖苷；道諾霉素；氨基蝶呤；Xeloda ;伊班膦酸鹽；CPT-11 ;拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000 ;ニ氟甲基鳥氨酸(DMFO);視黃酸衍生物例如TargretinTM(貝沙羅汀)，PanretinTM(阿利維A酸)；0NTAK (地尼白介素-毒素連接物)；埃斯波霉素；capecitabine;和上述任一種的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。該定義也包括用來調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素劑，如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-輕基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、onapristone和托瑞米芬(Fareston);和抗雄激素，如氟他胺、尼魯米特、bicalutamide、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和上述任一種的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。多種其他治療劑可和本文所述的抗-KDR抗體聯(lián)合使用。在一個實施方案中，抗體和消炎剤一起施用。消炎剤或藥物包括但不限于類固醇和糖皮質(zhì)激素(包括倍他米松，布地縮松，地塞米松，醋酸氫化可的松，氫羥腎上腺皮質(zhì)素，氫羥腎上腺皮質(zhì)素，甲基波尼松龍，波尼松龍，強(qiáng)的松，氟羥氫化潑尼松)，非類固醇消炎藥物(NSAIDS)包括阿司匹林、布洛芬、萘普生、氨甲喋呤、硫氮磺胺吡啶，來氟米特、抗-TNF藥物，環(huán)磷酰胺和麥考酚酷。包含本文所述KDR- 特異性抗體的組合物可施加至患有如本文所述的疾病的個體，包括但不限于和VEGF或KDR表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾患，包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，糖尿病和缺血性視網(wǎng)膜病變，年齡-相關(guān)的黃斑變性，銀屑病和與蛋白尿相關(guān)的腎小球肥大、以及各種腫瘤疾病包括血管肉瘤，腎細(xì)胞癌，胃腸癌，轉(zhuǎn)移性胃或胃食管連接部腺癌，乳癌，膀胱癌，肝細(xì)胞癌，結(jié)腸直腸癌，前列腺癌，非小細(xì)胞肺癌，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，卵巢癌，黑素瘤，和復(fù)發(fā)性多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，白血病與實體瘤。對于體內(nèi)用于人疾病的治療，本文所述的抗體通常在施用之前引入藥物組合物中。藥物組合物包含ー種或多種本文所述的抗體并聯(lián)合本文其他地方所述的生理上可接受的媒介物或賦形劑。為了制備藥物組合物，有效量的一種或多種化合物混合本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何藥學(xué)媒介物或賦形劑，以適于特定的施用方式。藥學(xué)媒介物可以是液體、半液體或固體。用于腸胃外、皮膚內(nèi)、皮下或局部施用的溶液或混懸液可包括例如無菌稀釋劑(例如水)、生理鹽水、不揮發(fā)性油、聚こニ醇、甘油、丙ニ醇或其他合成溶剤；抗菌劑例如(芐基醇或?qū)αu苯甲酸甲酷)；抗氧化劑(例如抗壞血酸和硫酸氫鈉)和螯合劑(例如こニ胺四こ酸(EDTA));緩沖劑(例如こ酸鹽、檸檬酸鹽和磷酸鹽)。如果靜脈內(nèi)施用，合適的媒介物包括生理鹽水或磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)、以及含有增稠劑和增溶劑(例如葡萄糖、聚こニ醇、聚丙ニ醇及其混合物)的溶液。包含如本文所述的KDR-特異性抗體的組合物可以使用媒介物制備，所述媒介物保護(hù)抗體避免從機(jī)體快速消除，例如時間釋放制劑或包衣。這些媒介物包括控釋制劑，例如但不限于移植體和微囊遞送系統(tǒng)和生物可降解、生物相容性高分子，例如こ烯醋酸こ烯酷、聚酐、聚こ醇酸、聚原酸酯、聚乳酸和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他物質(zhì)。本文提供使用結(jié)合KDR的抗體的治療方法。在一個實施方案中，本發(fā)明抗體施用中具有涉及不合適的KDR表達(dá)的疾病的患者，在本公開的上下文中是指包括畸變的KDR表達(dá)或活性所表征的疾病和疾患，因為由于蛋白存在量、或存在突變蛋白、或兩者的改變(例如統(tǒng)計學(xué)上顯著性増加或降低)。由于任何原因可能過量，包括但不限于在分子水平過表達(dá)、在作用位點(diǎn)延長或積累的表現(xiàn)、或相對于正?？蓹z測的活性，KDR活性增強(qiáng)(例如以統(tǒng)計學(xué)上顯著性方式)。這種KDR的過量可相對于正常表達(dá)、表現(xiàn)或KDR信號傳導(dǎo)事件的活性來測量，并且所述測量可以在本文所述的抗體的開發(fā)和/或設(shè)定中發(fā)揮重要作用。尤其，本發(fā)明抗體用于治療和KDR表達(dá)相關(guān)的各種。例如，本發(fā)明的一個實施方案提供通過向癌癥患者施用藥學(xué)上有效量的本文公開的KDR-特異性抗體來治療癌癥的方法，包括但不限于和VEGF或KDR表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾患，包括但不限于各種腫瘤疾病，包括血管肉瘤，腎細(xì)胞癌，胃腸癌，轉(zhuǎn)移性胃或胃食管連接部腺癌，乳癌，膀胱癌，肝細(xì)胞癌，結(jié)腸直腸癌，前列腺癌，非小細(xì)胞肺癌，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，卵巣癌，黑素瘤，和復(fù)發(fā)性多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，白血病和實體瘤。在施用后，以統(tǒng)計學(xué)上顯著性方式(即相對于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的對照)抑制、預(yù)防或延遲癌癥的發(fā)展和/或轉(zhuǎn)移的量被認(rèn)為是有效的。另外實施方案提供通過向癌癥患者施用藥學(xué)上有效量的本文公開的KDR-特異性抗體(例如，在施用后，以統(tǒng)計學(xué)上顯著性方式(即相對于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的對照)抑制、預(yù)防或延遲癌癥的轉(zhuǎn)移)來預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的方法，包括但不限于癌癥，包括但不限于各種腫瘤疾病，包括血管肉瘤，腎細(xì)胞癌，胃腸癌，轉(zhuǎn)移性胃或胃食管連接部腺癌，乳癌，膀胱癌，肝細(xì)胞癌，結(jié)腸直腸癌，前列腺癌，非小細(xì)胞肺癌，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，卵巢癌，黑素瘤和復(fù)發(fā)性多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，白血病與實體瘤。
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另外實施方案提供通過向癌癥患者施用藥學(xué)上有效量的本文公開的KDR-特異性抗體來預(yù)防癌癥的方法，包括但不限于癌癥，包括但不限于各種腫瘤疾病，包括血管肉瘤，腎細(xì)胞癌，胃腸癌，轉(zhuǎn)移性胃或胃食管連接部腺癌，乳癌，膀胱癌，肝細(xì)胞癌，結(jié)腸直腸癌，前列腺癌，非小細(xì)胞肺癌，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，卵巣癌，黑素瘤，和復(fù)發(fā)性多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，白血病與實體瘤。另外實施方案提供向患有這些疾病中的ー種或多種的患者施用藥學(xué)上有效量的本文公開的KDR-特異性抗體來治療、抑制癌癥的進(jìn)展或預(yù)防的方法，包括但不限于各種腫瘤疾病，例如血管肉瘤，腎細(xì)胞癌，胃腸癌，轉(zhuǎn)移性胃或胃食管連接部腺癌，乳癌，膀胱癌，肝細(xì)胞癌，結(jié)腸直腸癌，前列腺癌，非小細(xì)胞肺癌，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，卵巣癌，黑素瘤，和復(fù)發(fā)性多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，白血病和實體瘤，以及和VEGF或KDR表達(dá)和/或活性相關(guān)的其他疾患，包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，糖尿病和缺血性視網(wǎng)膜病變，年齡-相關(guān)的黃斑變性，銀屑病和與蛋白尿相關(guān)的腎小球肥大。在進(jìn)ー步的實施方案中，本發(fā)明抗體用于治療各種炎性疾病。例如，本發(fā)明的ー個實施方案提供一種治療炎性疾病的方法，包括但不限于和VEGF或KDR表達(dá)和/或活性相關(guān)的炎癥，包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，糖尿病，痛風(fēng)，冷吡啉相關(guān)周期性綜合征，慢性阻塞性肺疾病和各種心血管病例如動脈硬化和脈管炎。本發(fā)明抗體用于治療炎性綜合征，其特征在于關(guān)節(jié)的無菌炎癥、漿膜炎、發(fā)燒和皮膚損害的攻擊。炎性疾病包括但不限于克羅恩病、結(jié)腸炎、皮膚炎、銀屑病、憩室炎、肝炎、腸道激惹綜合征(IBS)、紅斑狼瘡、腎炎、帕金森氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化(MS)、阿爾茨海默氏病、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘和各種心血管病例如動脈硬化和脈管炎。在一個實施方案中，本公開提供通過向需要的患者施用藥學(xué)上有效量的本文公開的組合物來治療、降低嚴(yán)重性或預(yù)防炎癥或炎性疾病的方法。在另ー實施方案中，本發(fā)明的抗-KDR抗體用于確定結(jié)合的抗原的結(jié)構(gòu)，例如構(gòu)象表位，然后例如通過化學(xué)建模和SAR方法，該結(jié)構(gòu)可用于開發(fā)具有或模擬該結(jié)構(gòu)的化合物。本發(fā)明的各種其他實施方案部分涉及檢測表達(dá)KDR的細(xì)胞或組織的存在的診斷應(yīng)用。因此,本公開提供檢測樣品中KDR的方法，例如檢測表達(dá)KDR的細(xì)胞或組織。這些方法可以各種已知的檢測 方式應(yīng)用，包括但不限于免疫組織化學(xué)(IHC)、免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)、原位雜交(ISH)、結(jié)合整體原位雜交(WISH)、熒光DNA原位雜交(FISH)、流式細(xì)胞術(shù)、酶免疫測定(EIA)和酶聯(lián)免疫測定(ELISA)。ISH是ー種雜交法，其使用標(biāo)記的互補(bǔ)DNA或RNA鏈(即初級結(jié)合劑)以在細(xì)胞或組織的一部分或區(qū)段中定位特異DNA或RNA序列(原位)，或如果組織足夠小，全部組織(結(jié)合整體)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到這不同于免疫組織化學(xué)，其使用抗體作為促進(jìn)結(jié)合劑在組織區(qū)段中定位蛋白。DNA ISH用于基因組DNA以確定染色體的結(jié)構(gòu)。熒光DNAISH(FISH)可以例如用于醫(yī)學(xué)診斷以評價染色體完整性。RNA ISH(雜交組織化學(xué))用于在組織區(qū)段或結(jié)合整體內(nèi)測量和定位mRNAs和其他轉(zhuǎn)錄體。在多種實施方案中，本文所述的抗體綴合可以直接或間接檢測的可檢測的標(biāo)記。在這點(diǎn)上，抗體"綴合物"是指共價連接可檢測的標(biāo)記的抗-KDR抗體。在本發(fā)明中，DNA探針、RNA探針、單克隆抗體、其抗原-結(jié)合片段、及其抗體衍生物(例如單鏈可變-片段抗體或表位標(biāo)簽的抗體)可全部共價連接可檢測的標(biāo)記。在“直接檢測”中，僅使用一種可檢測的抗體，即初級可檢測的抗體。因此，直接檢測是指綴合可檢測的標(biāo)記的抗體可自身檢測，而無需増加第二抗體(次級抗體)。"可檢測的標(biāo)記"是可產(chǎn)生可檢測的(例如肉眼、電子或其他方式檢測)信號的分子或材料，所述信號指示樣品中標(biāo)記的存在和/或濃度。當(dāng)綴合抗體時，可檢測的標(biāo)記可用于定位和/或定量特異性抗體定向的靶。因而，樣品中靶的存在和/或濃度可以通過檢測由可檢測的標(biāo)記產(chǎn)生的信號而檢測?？蓹z測的標(biāo)記可直接或間接檢測，并且綴合不同特異性抗體的數(shù)種不同可檢測的標(biāo)記可聯(lián)合使用以檢測一種或多種靶?？芍苯踊蜷g接檢測的可檢測的標(biāo)記的例子包括熒光染料和放射性物質(zhì)與金屬顆粒。相反，間接檢測需要在應(yīng)用初級抗體后應(yīng)用ー種或多種另外抗體，即次級抗體。因此，通過檢測次級抗體或結(jié)合劑與初級可檢測的抗體的結(jié)合來進(jìn)行所述檢測。需要添加次級結(jié)合劑或抗體的初級可檢測的結(jié)合劑或抗體的例子包括酶可檢測的結(jié)合劑和半抗原可檢測的結(jié)合劑或抗體。在一些實施方案中，可檢測的標(biāo)記綴合包含第一結(jié)合劑的核酸高分子(例如在ISH、WISH或FISH方法中)。在其他實施方案中，可檢測的標(biāo)記綴合包含第一結(jié)合劑的抗體(例如在IHC方法中)?？删Y合本公開的方法中使用的抗體的可檢測的標(biāo)記的例子包括熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物熒光標(biāo)記、高分子、高分子顆粒、金屬顆粒、半抗原和染料。熒光標(biāo)記的例子包括5_(和6)-羧基熒光素,5-或6-羧基熒光素,6_(熒光素)-5-(和6)-羧基酰氨基己酸、熒光素異硫氰酸酷、羅丹明、四甲基羅丹明、和染料(例如Cy2、Cy3和Cy5)、任選地取代的香豆素包括AMCA，PerCP,藻膽蛋白包括R-藻紅蛋白(RPE)和allophycoerythrin(APC),德克薩斯紅,普林斯頓紅,綠色突光蛋白(GFP)及其類似物，和R-藻紅蛋白或al1phycoerythrin的綴合物,無機(jī)突光標(biāo)記例如基于半導(dǎo)體材料的顆粒，例如包覆的CdSe納米微晶。高分子顆粒標(biāo)記的例子包括聚苯こ烯、PMMA或ニ氧化硅的微粒或膠乳顆粒，其可以嵌合熒光染料或含有染料、酶或底物的高分子膠束或膠囊。金屬顆粒標(biāo)記的例子包括金顆粒和涂覆的金顆粒，其可以通銀染法來轉(zhuǎn)化。半抗原的例子包括DNP、熒光素異硫氰酸酯(FITC)、生物素和洋地黃毒苷。酶標(biāo)記的例子包括辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酯酶(ALP或AP)、P -半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖_6_磷酸酯脫氫酶、3-N-こ?；被咸擒彰?、3 -葡糖醛酸酶、轉(zhuǎn)化酶、黃嘌呤氧化酶、螢火蟲熒光素酶和葡萄糖氧化酶(GO)。用于辣根過氧化物酶的通常使用的底物的例子包括3，3' -二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、鎳增強(qiáng)的ニ氨基聯(lián)苯胺、3-氨基-9-こ基咔唑(AEC)、聯(lián)苯胺ニ鹽酸鹽(BDHC) ,Hanker-Yates 試劑(HYR)、Indophane 藍(lán)(IB)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、4_ 氯-1-萘酚(CN)、a -萘酚派洛寧(a -NP)、o-聯(lián)茴香胺(OD)、5_溴_4_氯_3_吲哚基磷酸酯(BCIP)、硝基藍(lán)四氮唑ニ甲(NBT)、2-(p-碘代苯基)-3-p-硝基苯-1-5-苯基氯化四唑(INT)、四硝基四氮唑藍(lán)(TNBT)、5_溴-4-氯-3-吲羥基-P -D-半乳糖苷/鐵氰化亞鐵(BCIG/FF)。用于堿性磷酸酯酶的通常使用的底物的例子包括萘酚-AS-B 1-磷酸酷/固紅TR (NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸酷/固紅TR (NAMP/FR)、萘酚-AS-Bl-磷酸酷/-固紅TR (NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸酷/固紅TR (NAMP/FR)、萘酚-AS-Bl-磷酸酷/新品紅(NABP/NF)、溴氯吲哚基磷酸鹽/氮藍(lán)四唑(BCIP/NBT)、5_溴-4-氯-3-吲哚基-b—d_吡喃半乳糖苷(BCIG)。 發(fā)冷光標(biāo)記的例子包括發(fā)光氨、異氨基苯ニ酰肼、吖啶酷、1，2-ニ氧雜環(huán)丁烷和吡啶并噠嗪。電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的例子包括釕衍生物。放射性標(biāo)記的例子包括碘、鈷、硒、氣、碳、硫和磷的放射性同位素?？蓹z測的標(biāo)記可連接本文所述的抗體或特異性結(jié)合目標(biāo)生物標(biāo)志物的任何其他分子，例如抗體、核酸探針或高分子。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，可檢測的標(biāo)記也可綴合第二和/或第三和/或第四和/或第五結(jié)合劑或抗體等。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，用于標(biāo)識目標(biāo)生物標(biāo)志物的各另外結(jié)合劑或抗體可作為信號擴(kuò)增步驟。生物標(biāo)志物可以使用例如光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡(可檢測的物質(zhì)例如是染料、膠體金顆粒、發(fā)冷光試劑)來肉眼檢測。結(jié)合生物標(biāo)志物的肉眼可檢測的物質(zhì)還可以使用分光光度計來檢測。如果可檢測的物質(zhì)是放射性同位素，檢測可以通過自動射線照相術(shù)肉眼進(jìn)行，或使用閃爍計數(shù)器非肉眼進(jìn)行。例如參見Larsson, 1988, Immunocytochemistry:Theory andPractice, (CRC Press,Boca Raton,Fla.) ；Methods in Molecular Biology,vol.80 1998，John D.PouncUed.) (Humana Press, Totowa, N.J.)。本發(fā)明還提供在樣品中檢測KDR或表達(dá)KDR的細(xì)胞或組織的試劑盒，其中試劑盒含有:如本文所述的至少ー種抗體、多肽、多核苷酸、載體或宿主細(xì)胞。在某些實施方案中，試劑盒可含有緩沖劑、酶、標(biāo)記、底物、珠或附接本發(fā)明的抗體的其他表面等；以及使用說明書。
實施例實施例1抗-KDR抗體的制備和人源化抗-KDR抗體的產(chǎn)生將新西蘭白兔用重組KDR-兔Fe融合蛋白免疫。具有特異性結(jié)合人KDR的最高血清滴度的兔被選擇用于雜交瘤產(chǎn)生?？偣?30種雜交瘤被鑒定為結(jié)合可溶性KDR-Fc陽性。在這些230中，通過使用KDR-轉(zhuǎn)染子293細(xì)胞，100種克隆還發(fā)現(xiàn)結(jié)合細(xì)胞表面KDR陽性。雙陽性雜交瘤被選擇用于進(jìn)一歩功能性表征。雜交瘤的功能篩選阻斷KDR與VEGF的結(jié)合的功能性抗體的篩選:評價結(jié)合可溶性KDR和細(xì)胞表面KDR的雙陽性抗-KDR抗體(100個克隆)的抑制KDR與VEGF的結(jié)合的能力。在100種抗-KDR克隆中，41種發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出一致性并重組表達(dá)，以及純化用于進(jìn)一歩表征。抑制KDR與VEGF的結(jié)合的最佳10種抗-KDR抗體的效果概述于下面表2，并且示于圖1。表2:抗-KDR 抗體的 IC50
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合KDR的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段，包含:(i)包含SEQ ID N0:3或11表示的VHCDRl區(qū)、SEQ ID NO:4或12表示的VHCDR2區(qū)、和SEQ ID NO:5表示的VHCDR3區(qū)的重鏈可變區(qū)；以及(ii)包含SEQ ID NO:6表示的VLCDRl區(qū)、SEQ ID NO:7表示的VLCDR2區(qū)、和SEQ ID NO:8表示的VLCDR3區(qū)的輕鏈可變區(qū)； 或所述抗體的變體、或其抗原-結(jié)合片段，包含重鏈和輕鏈可變區(qū)，除了在所述CDR區(qū)中高達(dá)8種氨基酸取代外，所述重鏈和輕鏈可變區(qū)與(i)和(ii)的所述重鏈和輕鏈可變區(qū)相同。
2.權(quán)利要求1所述的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQID NO:1表不的氣基酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段，其中所述輕鏈可變區(qū)包含SEQID NO:2表不的氣基酸序列。
4.一種結(jié)合KDR的分 離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段，包含:(i)包含如圖11所示抗體的VHCDR1、VHCDR2、和VHCDR3的重鏈可變區(qū)；以及(ii)包含如圖11所示抗體的VLCDR1、VLCDR2、和VLCDR3的對應(yīng)的輕鏈可變區(qū)； 或所述抗體的變體、或其抗原-結(jié)合片段，包含重鏈和輕鏈可變區(qū)，除了在所述CDR區(qū)中高達(dá)8種氨基酸取代外，所述重鏈和輕鏈可變區(qū)與(i)和(ii)的所述重鏈和輕鏈可變區(qū)相同。
5.權(quán)利要求4所述的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQID NO:17-42表示的氨基酸序列的任意一種。
6.權(quán)利要求4所述的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段，其中所述輕鏈可變區(qū)包含SEQID NO:43-68表示的氨基酸序列的任意一種。
7.一種結(jié)合KDR的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段，包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求7所述的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段，包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列具有至少90% —致性的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求7所述的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段，包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:2表不的氣基酸序列。
10.一種結(jié)合KDR的分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段，包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:2表不的氣基酸序列。
11.權(quán)利要求10所述的分離的抗體、或其抗原結(jié)合片段，包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列具有至少90% —致性的氨基酸序列的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求1所述的分離的抗體，其中所述抗體為人源化的。
13.權(quán)利要求12所述的分離的抗體，其中VH區(qū)包含SEQID NO:9表示的氨基酸序列，以及VL區(qū)包含SEQ ID NO: 10表不的氣基酸序列。
14.權(quán)利要求1所述的分離的抗體，其中所述抗體選自單鏈抗體、ScFv、缺乏鉸鏈區(qū)的單價抗體、和微型抗體。
15.權(quán)利要求1所述的分離的抗體，其中所述抗體是Fab或Fab’片段。
16.權(quán)利要求1所述的分離的抗體，其中所述抗體是F(ab’)2片段。
17.權(quán)利要求1所述的分離的抗體，其中所述抗體是整個抗體。
18.權(quán)利要求1所述的分離的抗體，包含人IgG恒定結(jié)構(gòu)域。
19.權(quán)利要求18所述的分離的抗體，其中所述IgG恒定結(jié)構(gòu)域包含IgGlCHl結(jié)構(gòu)域。
20.權(quán)利要求18所述的分離的抗體，其中所述IgG恒定結(jié)構(gòu)域包含IgGlFe區(qū)。
21.一種分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段，所述分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段與權(quán)利要求I所述抗體競爭與人KDR的結(jié)合。
22.一種分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段，所述分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段以5.3xl(TnM或更低的KD結(jié)合KDR。
23.一種分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段，其中所述分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段: a.阻斷VEGF與KDR的結(jié)合； b.抑制KDR信號傳遞； c.抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖； d.抑制腫瘤血管生成； e.抑制腫瘤細(xì)胞生長； f.a.-e中任一項或多項的組合。
24.權(quán)利要求23所述的分離的抗體或其抗原-結(jié)合片段，其中所述分離的抗體或其抗原-結(jié)合片段阻斷VEGF與KDR的結(jié)合；抑制KDR信號傳遞；抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖；抑制腫瘤血管生成；和抑制腫瘤細(xì)胞生長。
25.一種分離的抗體或其抗原-結(jié)合片段，所述分離的抗體或其抗原-結(jié)合片段直接抑制腫瘤生長。
26.權(quán)利要求1、4、或21、22-25中任一項所述的分離的抗體，其中所述抗體與鼠KDR或非人靈長類KDR交叉反應(yīng)。
27.一種根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求13編碼所述分離的抗體、或其抗原-結(jié)合片段的分離的多核苷酸。
28.一種表達(dá)載體,包含權(quán)利要求24所述分離的多核苷酸。
29.一種分離的宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求28所述的載體。
30.一種組合物，包含生理上可接受的媒介物和藥學(xué)上有效量的根據(jù)權(quán)利要求1、13、或21-26中任一項所述分離的抗體或其抗原-結(jié)合片段。
31.權(quán)利要求30所述組合物在制備用于治療患者的癌癥的藥物的用途。
32.權(quán)利要求30所述組合物在制備用于治療患者的具有與畸變的VEGF或KDR表達(dá)或活性相關(guān)的癌癥的藥物的用途。
33.權(quán)利要求32所述的用途，其中所述癌癥選自:血管肉瘤、腎細(xì)胞癌、胃腸癌、轉(zhuǎn)移性胃或胃食管連接部腺癌、乳癌、膀胱癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、卵巢癌 、黑素瘤、復(fù)發(fā)性多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、和白血病。
34.權(quán)利要求30所述組合物在制備用于治療患者的炎性疾病的藥物的用途。
35.權(quán)利要求30所述組合物在制備治療患者的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物的用途。
36.權(quán)利要求30所述組合物在制備治療患者的銀屑病的藥物的用途。
37.權(quán)利要求30所述組合物在制備治療患者的血管生成-介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。
38.權(quán)利要求37所述的 用途，其中所述患者患有年齡-相關(guān)的黃斑變性。
全文摘要
本發(fā)明提供抗-KDR單克隆抗體和相關(guān)的組合物，可將其用在用于治療各種癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病和與畸變的VEGF或KDR表達(dá)和/或活性相關(guān)的其他疾病的各種治療方法的任一種中。
文檔編號A61P29/00GK103087192SQ20121006366
公開日2013年5月8日 申請日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月2日
發(fā)明者柯耀煌, 李森偉, 張永克, 余國良, 朱偉民 申請人:埃派斯進(jìn)有限公司