專利名稱：抗α_vβ₆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及抗ανβ6整聯(lián)蛋白抗體。

背景技術(shù)：
整聯(lián)蛋白是ー個細(xì)胞表面受體超家族，介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)粘附。這些蛋白質(zhì)被認(rèn)為在發(fā)育和組織損傷過程中為細(xì)胞的生長、遷移和分化提供錨定以及信號。整聯(lián)蛋白還與細(xì)胞的去分化和侵入有夫，特別是在細(xì)胞失去它們的特化形態(tài)，而成為轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞吋。整聯(lián)蛋白是由兩個非共價連接的亞基-α和β組成的異源ニ聚體蛋白質(zhì)。整聯(lián)蛋白的結(jié)合特異性是由18種不同α鏈中的ー些與8種不同β鏈中的一些組合所規(guī)定的。ανβ6整聯(lián)蛋白能夠結(jié)合多種配基，包括纖連蛋白、腱生蛋白、玻連蛋白和最近鑒定的潛伏相關(guān)肽(LAP)，即ー種278個氨基酸的肽，其作為前體TGF- β蛋白的一部分合成(Munger等人，Cell96(3) :319-328 (1999))。在分泌過程中，LAP作為N端肽從TGF-β的成熟形式上切下，但是仍然與TGF-β非共價結(jié)合，從而保持潛伏狀態(tài)。該復(fù)合物不能與TGF-β受體結(jié)合，因此無生物學(xué)活性。α νβ 6整聯(lián)蛋白能夠直接結(jié)合LAP內(nèi)所含的RGD基序，導(dǎo)致LAP的釋放和TGF- β的激活。由于α ν β 6與LAP的結(jié)合對于TGF- β轉(zhuǎn)化為活性狀態(tài)可能非常重要，因此阻斷這種結(jié)合可導(dǎo)致ανβ6介導(dǎo)的TGF-β激活的抑制和相關(guān)的纖維化病理學(xué)。發(fā)明概述本發(fā)明是基于抗ανβ6高親和カ抗體的發(fā)現(xiàn)和表征，包括這些抗體的互補決定區(qū)(CDRs)中關(guān)鍵氨基酸殘基的鑒定和分析。本發(fā)明包括ー種單克隆抗體，其可以(a)特異性結(jié)合avi36;(b)抑制ανβ6與其配體(如LAP、纖連蛋白、玻連蛋白和腱生蛋白)的結(jié)合，其IC5tl值低于10D5的IC50值(國際專利申請公開文本W(wǎng)O 99/07405) ； (c)阻斷TGF-β的激活；(d)含有提供ανβ6結(jié)合特異性的CDR中的某些氨基酸序列(如圖7Α和7Β所示)；(e)特異性結(jié)合β 6亞基；和/或(f)在免疫染色程序，如石蠟包埋組織的免疫染色中識別ανβ6。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與ανβ6結(jié)合的抗體可以被分類為生物物理學(xué)上不同的類和亞類。一類抗體顯示阻斷配體(如LAP)與ανβ6結(jié)合的能力(阻斷剤)。這類抗體可以被進(jìn)一歩分為依賴陽離子的阻斷劑和不依賴陽離子的阻斷劑之亞類。一些依賴陽離子的阻斷劑含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽序列，而不依賴陽離子的阻斷劑不含RGD序列。另ー類抗體顯示與ανβ6結(jié)合的能力，并且不能阻斷ανβ6與配體的結(jié)合(非阻斷劑)。因此，在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的ー些抗體與ανβ6的結(jié)合是依賴ニ價陽離子的，而有些是不依賴ニ價陽離子的。示例性的陽離子是Ca2+、Mg2+和Mn2+。在一些實施方案中，抗體包含與雜交瘤6. 1A8、6. 3G9、6. 8G6、6. 2Β1、6. 2Β10、
6.2Α1、6. 2Ε5、7. 1G10、7. 7G5或7. 1C5產(chǎn)生的抗體相同的重鏈和輕鏈多肽序列。在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的互補決定區(qū)(CDR) 1、2和3分別基本(即除了ー些保守性變異之外)由SEQ ID NOs :1、4和7的序列組成，該輕鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs :10、13和15的序列組成。
在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的⑶Rs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs :3、5和8的序列組成，該輕鏈的⑶Rs 1、2和3分別基本由SEQ IDNOs : 11、14和17的序列組成。在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的⑶Rs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs :3、6和9的序列組成，該輕鏈的⑶Rs 1、2和3分別基本由SEQ IDNOs : 12、14和18的序列組成。在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的⑶Rs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs 2,46和47的序列組成，該輕鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ IDNOs 48,13和16的序列組成。在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的⑶Rs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs :49、51和53的序列組成，該輕鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ IDNOs 55,57和59的序列組成。在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的⑶Rs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs :50、52和54的序列組成，該輕鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ IDNOs 56,58和60的序列組成。在一些實施方案中，抗體包含SEQ ID NOs :19-36和61-62中任何一個的重鏈可變域序列。在一些實施方案中，抗體分別包含下列重鏈和輕鏈可變域序列(I)SEQ ID NOs : 19 和 37 ;(2) SEQ ID NOs :20 或 21，和 SEQ ID NO 38 ；(3) SEQ ID NOs 22 和 43 ；(4) SEQ ID NOs 23 和 44 ；(5) SEQ ID NOs 24 和 45 ；(6) SEQ ID NOs 25 或 26，和 SEQ ID NOs 42 ；(7) SEQ ID N0s27、28 或 29，和 SEQ ID NOs 39 ；(8) SEQ ID NOs 34 或 35，和 SEQ ID NOs 40 ；(9) SEQ ID NOs 36 和 41 ；(IO)SEQ ID NOs 61 和 63 ;或(Il)SEQ ID NOs 62 和 64。在一些實施方案中，抗體可特異性結(jié)合ανβ6，但是不抑制ανβ6與潛伏相關(guān)肽(LAP)的結(jié)合。至少有些這樣的抗體能夠與石蠟包埋組織切片中的ανβ6結(jié)合，因此能夠用于診斷用途。示例性的抗體包括6. 2Α1和6. 2Ε5。 本發(fā)明也包括可結(jié)合與上述任何抗體相同表位的抗體。本發(fā)明也包括含有本發(fā)明的ー種或多種抗體和藥學(xué)可接受的載體的組合物。在一 些這樣的組合物中，抗體與細(xì)胞毒性劑(即影響細(xì)胞的存活力和/或功能的物質(zhì))如毒素或放射性核素偶聯(lián)。這些組合物中的抗體可以是依賴陽離子的抗體。這些組合物能夠?qū)加谢蛘呔哂谢鸡力挺?介導(dǎo)的疾病危險的對象(例如哺乳動物，如人)施用，以治療(例如緩解、減輕、降低、阻止、延遲發(fā)生)該疾病。這類疾病的例子包括，但不限于纖維化(例如硬皮病、結(jié)瘢、肝纖維化、肺纖維化和腎纖維化)；銀屑病；癌癥(例如上皮癌；口腔、皮膚、子宮頸、卵巣、咽、喉、食道、肺、乳房、腎或結(jié)腸直腸癌)；奧爾波特綜合征；急性及慢性肺、肝、腎和其它內(nèi)臟損傷；肺、肝、腎和其它內(nèi)臟的硬化。患這些疾病的危險可能是由于遺傳誘因；某些生活方式，如吸煙和酗酒；接觸環(huán)境污染物，如石棉；生理疾病，如糖尿病、肝炎病毒感染(例如丙型肝炎病毒感染)、自身免疫??；和醫(yī)學(xué)治療，如放射治療。本發(fā)明還包括檢測來自哺乳動物(例如人)的組織標(biāo)本中α ν β 6的方法，包括使組織標(biāo)本接觸本發(fā)明的抗體，如6. 2Α1和6. 2Ε5。本發(fā)明還包括雜交瘤6. 1Α8、6· 2Β10、6· 3G9、6. 8G6、6. 2Β1、6· 2Α1、6· 2Ε5、7· 1G10、 7.7G5和7. 1C5的細(xì)胞；包含編碼SEQ ID NOs :19-45和61-64中任何ー種的序列的分離的核酸；包含SEQ ID NOs 19-45和61-64中任何一種的氨基酸序列的分離的多肽。本發(fā)明的抗體是指完整抗體，例如，含有兩條重鏈和兩條輕鏈的抗體，或者是指完整抗體的抗原結(jié)合片段，如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2K段或F(V)片段。本發(fā)明的抗體可以是鼠抗體或其同源物，或者是完整的人抗體。本發(fā)明的抗體也可以是人源化抗體、嵌合抗體或單鏈抗體。本發(fā)明的抗體可以是任何同種型和亞型的，如IgA(例如IgAl和IgA2)、IgG(如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)、IgE、IgD、IgM，其中免疫球蛋白的輕鏈可以是κ型或λ型。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體可以在重鏈的ー個或多個(例如2、3、4、5或6個)特定位點處含有突變(例如缺失、置換或添加)，使得該抗體的效應(yīng)物功能(例如該抗體結(jié)合Fe受體或補體因子的能力)發(fā)生改變，而不影響抗體的抗原結(jié)合能力。在另外ー些實施方案中，本發(fā)明的抗體可以在作為糖基化位點的氨基酸殘基處含有突變，使得糖基化位點消除。這種抗體可能具有臨床上有益的、降低的效應(yīng)物功能或其它不希望的功能，而保留其抗原結(jié)合親和力。糖基化位點的突變也可能有利于エ藝發(fā)展(例如蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化)。在另外ー些實施方案中，重鏈或輕鏈可能含有提高親和力或效能的突變。幾種融合#6和融合#7雜交瘤根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏已在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC ；Ρ. O. Box 1549，Manassas, VA 20108，USA)。雜交瘤克隆 6. 1Α8、6· 2Β10、6· 3G9、
6.8G6和 6· 2Β1 于 2001 年8 月 16 日保藏，保藏號分別是ATCC ΡΤΑ-3647、-3648、-3649、-3645和-3646。雜交瘤克隆 6. 2Α1、6· 2Ε5、7· 1G10、7. 7G5 和 7. 1C5 在 2001 年 12 月 5 日保藏，保藏號分別是 ATCC PTA-3896、-3897、-3898、-3899 和-3900。見下文表 I。本發(fā)明的抗體可用于治療由α νβ 6與配體(如LAP和纖連蛋白)結(jié)合介導(dǎo)的任何臨床上不希望的病癥或疾病(如此處所述)。由于更高的親和カ或親合力，以及與配體結(jié)合的陽離子依賴性或非依賴性，這些抗體可能比以前所知的α νβ 6抗體更有效。除了本發(fā)明的抗體特別是阻斷劑的治療用途之外，非阻斷劑類的抗體也能夠用于診斷目的，如用于抗原捕獲測定、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、免疫組化等。通過下列詳述、附圖和權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將是顯而易見的。附圖簡述圖IA和IB是顯示細(xì)胞捕獲測定結(jié)果的條形圖，該試驗是測定多種抗ανβ6單克隆抗體(“mAb”)結(jié)合β 6轉(zhuǎn)染的FDC-Pl細(xì)胞的能力(未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照)。圖2Α是顯示ELISA測定結(jié)果的圖，該試驗是測定多種純化的抗ανβ6 “融合6”單克隆抗體結(jié)合可溶性重組人ανβ6( “hsav06”)的能力。這些抗體通過用截短的可溶性人ανβ6免疫β6-/-小、鼠產(chǎn)生。圖例中的數(shù)字表示克隆數(shù)。相應(yīng)的克隆名稱見表2。
圖2B是顯示ELISA測定結(jié)果的圖，該試驗是測定多種純化的抗α νβ 6“融合7”單克隆抗體結(jié)合可溶性重組hsaj 6的能力。這些抗體通過用β6轉(zhuǎn)染的NIH 3Τ3細(xì)胞(融合#7)免疫β6_/_小鼠產(chǎn)生。圖3A-F是顯示多種抗α νβ 6單克隆抗體與hs α νβ 6結(jié)合的不同陽離子依賴性的圖。圖4Α和4Β是顯示融合#6和融合#7單克隆抗體分別抑制生物素_hs α ν β 6與LAP結(jié)合的圖。圖5A-E是顯示本發(fā)明的示例性單克隆抗體抑制β 6轉(zhuǎn)染的FDC-Pl細(xì)胞與LAP結(jié)合的圖。圖5Α和5Β顯示融合#6抗體的結(jié)果。圖5C-E顯示融合#7抗體的結(jié)果。圖6Α和6Β是顯示融合#6和融合#7抗體分別抑制α ν β 6_介導(dǎo)的TGF- β激活的圖，其中使用PAI-I螢光素酶報道基因測定監(jiān)測TGF-β的激活。圖7Α顯示%36單克隆抗體6.1八8、6.866(亞克隆六和抝、7.765、6.281、6.369、6. 2Β10 (亞克隆 A 和 B)、6. 2G2、6. 2Α1、6· 4Β4 (亞克隆 A、B 和 C)、7· 10Η2、7· 9Η5、7· 4Α3 (亞克隆A和Β)、7. 1C5(亞克隆A和B)和7. IGlO的重鏈可變域的氨基酸序列。抗體6. 1A8、6. 8G6和7. 7G5與α νβ6的結(jié)合是依賴陽離子的，而抗體6. 2BU6. 2AU6. 3G9.6. 2Β10、
6.4B4、7. 1C5和7. IGlO則是不依賴陽離子的(見下文)。括號中的數(shù)字代表氨基酸殘基位點。CDR在大框中，而含有斜體氨基酸的小框則代表具體抗體在不同克隆中的多態(tài)性。圖7Β 顯示 α νβ 6 單克隆抗體 6. 1A8、6. 8G6、6. 4Β4、6· 2Α1、7· 1C5、7. 1G10、6. 2B10、
7.7G5、6. 2B1和6. 3G9的輕鏈可變域的氨基酸序列。圖8是ー張散布圖，顯示人乳腺癌和人鱗狀癌組織切片中α νβ 6的表達(dá)。正常人組織只顯不可以忽略的ανβ6表達(dá)水平。圖9Α和9Β是二次曲線圖，顯示兩種抗α νβ 6抗體6. 8G6和6. 3G9分別對可溶性α νβ6的溶液結(jié)合親和力。圖IOA和IOB是兩張條形圖，證實純化的單克隆抗體與生物素化的6. 3G9和生物素化的6. 8G6分別競爭結(jié)合α ν β 6的能力。

圖11是ー張條形圖，顯示在用抗α νβ6單克隆抗體治療處理的UUO動物的腎臟中，平滑肌肌動蛋白染色的百分比。圖12顯示根據(jù)FACS分析，腫瘤細(xì)胞系上α ν β 6的表達(dá)(圖右側(cè))，以及單克隆抗體6. 3G9和6· 4Β4對腫瘤細(xì)胞系與LAP配體結(jié)合的抑制(圖左側(cè))。圖13是ー張條形圖，證實抗0,6單克隆抗體6.369、6.866和6.484對三種腫瘤細(xì)胞系與LAP配體結(jié)合的抑制。單克隆抗體的結(jié)合與不添加試驗單克隆抗體的總結(jié)合(TB)并與單獨BSA対照的非特異性結(jié)合(NSB)相比較。圖14Α和14Β顯示在33天的研究期內(nèi)，抗α νβ 6單克隆抗體6. 3G9和6. 4Β4分別對皮下植入Detroit 562細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤的作用。圖15A-C顯示抗α νβ 6單克隆抗體對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的作用。㈧使用
6.3G9單克隆抗體的抗體治療在第O天施用博來霉素時開始，監(jiān)測30天；(B)使用6. 3G9單克隆抗體的抗體治療在博來霉素治療15天后開始，監(jiān)測30天；(C)使用6. 3G9、6. 8G6和
6.4B4單克隆抗體的抗體治療在博來霉素治療15天后開始，監(jiān)測延長的60天。在圖15A和15B中，左側(cè)的條圖代表yg羥脯氨酸/肺，而右側(cè)的條圖顯示與鹽水處理的小鼠(無博來霉素)相比，羥脯氨酸的増加百分?jǐn)?shù)。在圖15C中，該圖顯示每個肺的羥脯氨酸含量。發(fā)明詳述本發(fā)明表征了對于整聯(lián)蛋白ανβ6特異的抗體的類和亞類。至少ー類抗體(阻斷劑)能夠阻斷α ν β 6與LAP的結(jié)合或者阻止TGF- β的激活。以下描述了制備本發(fā)明的抗體的多種方法。本領(lǐng)域公知但是在此沒有具體描述的方法也包含在發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，本發(fā)明的抗體也能夠用噬菌體展示抗體文庫鑒定，如 Smith, Science 228 :1315-7(1985);美國專利 5，565，332,5, 733，743,6, 291，650和6，303，313所述。本發(fā)明的另外ー些抗體能夠如下制備將此處鑒定的重鏈與非相關(guān)(noncognate)輕鏈(例如通過曬菌體展示技術(shù)鑒定的輕鏈)相偶聯(lián)。非人雜交瘤抗體本發(fā)明的單克隆抗體能夠通過眾所周知的雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生。為此，β 6-/_動物(例如小鼠、大鼠或免)用如下材料免疫純化的或粗ανβ6制品，用編碼αν、β6或這兩種抗原的cDNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，組成型表達(dá)ανβ6的細(xì)胞，等等?？梢宰鳛榧兓牡鞍踪|(zhì)、在細(xì)胞上表達(dá)的蛋白質(zhì)、其蛋白質(zhì)片段或肽，或者作為裸DNA或編碼該蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段或肽的病毒載體遞送這些抗原。然后檢測免疫動物的血清中抗ανβ6抗體的存在。從檢測為陽性的動物中分離B細(xì)胞，用這些B細(xì)胞制備雜交瘤。篩選雜交瘤分泌的抗體，這是根據(jù)它們特異性結(jié)合ανβ6(例如結(jié)合@6轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，而不結(jié)合未轉(zhuǎn)染的親本細(xì)胞)的能力，和其它任何希望的特征，例如含有希望的CDR共有序列，以低于已知抗ανβ6抗體10D5的IC5tl值抑制(或者對于非阻斷劑，不抑制)LAP與α ν β 6的結(jié)合，或抑制TGF- β的激活。篩選實驗中檢測為陽性的雜交瘤細(xì)胞于使細(xì)胞向培養(yǎng)基內(nèi)分泌單克隆抗體的條件下在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后收集條件雜交瘤培養(yǎng)上清液，純化上清液中所含的抗體。另外，希望的抗體也可以通過向未免疫的動物(例如小鼠)的腹腔內(nèi)注射雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。雜交瘤細(xì)胞在腹腔內(nèi)増殖，分泌抗體，積累為腹水。然后可以用注射器從腹腔中吸出腹水，收集抗體。單克隆抗體也能夠如下產(chǎn)生從希望的雜交瘤中分離編碼抗體的cDNA，用此cDNA轉(zhuǎn)染哺乳動物宿主細(xì)胞(例如CHO或NSO細(xì)胞)，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，從培養(yǎng)基中回收抗體。嵌合抗體本發(fā)明的單克隆抗體也能夠通過工程構(gòu)建相關(guān)(cognate)雜交瘤(例如鼠、大鼠或免)抗體產(chǎn)生。例如，可以通過重組DNA技術(shù)改變相關(guān)抗體，使得重鏈和/或輕鏈的部分或全部鉸鏈區(qū)和/或恒定區(qū)被替換為來自另外ー個種(例如人)的抗體的相應(yīng)成分。通常，工程化抗體的可變域與相關(guān)抗體的可變域相同或基本相同。這種工程化抗體被稱為嵌合抗體，當(dāng)對作為鉸鏈區(qū)和/或恒定區(qū)來源的種(例如人)的個體施用時，抗原性低于相關(guān)抗體。制備嵌合抗體的方法在本領(lǐng)域公知。
本發(fā)明包括的嵌合抗體可包含一個重鏈可變域和/或ー個輕鏈可變域，重鏈可變域含有與SEQ ID NOs :19-36中任何一個相同(或基本相同)的序列，輕鏈可變域含有與SEQ ID NOs 37-45中任何一個相同(或基本相同)的序列。優(yōu)選的人恒定區(qū)包括來源于IgGl和IgG4的恒定區(qū)。
完全人抗體本發(fā)明的單克隆抗體還包括完全人抗體。它們可以用體外免疫(prime)的人脾細(xì)胞制備，如Boerner等人，J. Immunol. 147 :86-95 (1991)所述,或者用曬菌體展示抗體文庫制備，如美國專利6，300，064所述。生產(chǎn)完全人抗體的其它ー些方法包括使用含有滅活的內(nèi)源Ig基因座并且對于未重排的人抗體重鏈和輕鏈基因而言是轉(zhuǎn)基因的非人動物。這些轉(zhuǎn)基因動物可以用ανβ6 免疫，然后由來源于它們的B細(xì)胞制備雜交瘤。這些方法在下列文獻(xiàn)中描述，例如關(guān)于含有人Ig小基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠的多篇GenPharm/Medarex(Palo Alto, CA)公開文本/專利(例如，Lonberg 美國專利 5，789，650);關(guān)于 XEMOMICE 的多篇 Abgenix (Fremont, CA)公開文本 / 專利(例如，Kucherlapati 美國專利 6，075，181,6, 150，584 和 6，162，963 ；Green等人，Nature Genetics 7:13-21(1994);和 Mendez 等人，15 (2) :146-56(1997);和關(guān)于“transomic”小鼠的多篇Kirin(日本)公開文本/專利(例如，EP 843961,和Tomizuka等人，Nature Genetics 16:133-1443(1997))。人源化抗體本發(fā)明的單克隆抗體還包括來源于其它種的人源化形式的相關(guān)抗α νβ 6抗體。人源化抗體是通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的抗體，其中用抗原結(jié)合不需要的人免疫球蛋白輕鏈或重鏈的ー些或全部氨基酸(例如可變域的恒定區(qū)和框架區(qū))置換來自相關(guān)非人抗體的輕鏈和重鏈的相應(yīng)氨基酸。例如，針對特定抗原的一種人源化鼠抗體在其重鏈和輕鏈上均含有(I)人抗體的恒定區(qū)；⑵來自人抗體的可變域的框架區(qū)；和(3)來自鼠抗體的CDR。必要時，能夠?qū)⑷丝蚣軈^(qū)中的ー個或多個殘基改變?yōu)槭罂贵w相應(yīng)位點的殘基，以保持人源化抗體與抗原的結(jié)合親和力。這種改變有時被稱為“回復(fù)突變”。人源化抗體在人體中引發(fā)免疫反應(yīng)的可能性通常低于嵌合人抗體，因為前者含有相當(dāng)少的非人成分。制備人源化抗體的方法在下列文獻(xiàn)中描述，例如Winter EP 239400 Jones等人，Nature 321 :522-525 (1986) ;Riechmann 等人，Nature332 :323-327 (1988);Verhoeyen 等人，Science 239 1534-1536 (1988) ；Queen 等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA86 10029 (1989);美國專利 6，180，370 ；和 Orlandi 等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86 3833(1989)。鼠(或其它非人)CDR向人抗體上的移植通常如下實現(xiàn)。從雜交瘤中分離編碼重鏈和輕鏈可變域的cDNA?？勺冇颍á荝的DNA序列通過測序測定。編碼⑶R的DNA通過定點誘變轉(zhuǎn)移到人抗體重鏈或輕鏈可變域編碼序列的相應(yīng)區(qū)。然后添加希望的同種型的人恒定區(qū)基因片段(例如對于CH添加Y1，對于CL添加K)。人源化重鏈和輕鏈基因在哺乳動物宿主細(xì)胞(例如CHO或NSO細(xì)胞)中共表達(dá)，產(chǎn)生可溶性人源化抗體。為了促進(jìn)抗體的大規(guī)模生產(chǎn)，通常希望在含有抗體表達(dá)細(xì)胞的生物反應(yīng)器中生產(chǎn)這些人源化抗體，或者生產(chǎn)在乳汁中表達(dá)該抗體的轉(zhuǎn)基因哺乳動物(例如山羊、母牛或綿羊)(參見，例如美國專利 5，827，690)。 有吋，CDR向人框架的直接轉(zhuǎn)移導(dǎo)致獲得的抗體丟失抗原結(jié)合親和力。這是因為在有些相關(guān)抗體中，框架區(qū)內(nèi)的某些氨基酸與CDR相互作用，從而影響抗體的總抗原結(jié)合親 和力。在這種情況下，為了保留相關(guān)抗體的抗原結(jié)合活性，在接受抗體的框架區(qū)內(nèi)引入“回復(fù)突變”(同上)是很關(guān)鍵的。形成回復(fù)突變的普通方法在本領(lǐng)域中公知。例如，Queen等人(同上)，Co等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88:2869-2873(1991)和 W090/07861 (Protein Design LabsInc.)描述了ー種包括兩個關(guān)鍵步驟的方法。首先，通過計算機分析與相關(guān)鼠抗體V區(qū)框架的最佳蛋白質(zhì)序列同源性，選擇人V框架區(qū)。然后，用計算機模擬鼠V區(qū)的三級結(jié)構(gòu)，以顯示可能與鼠CDR相互 作用的框架氨基酸殘基，然后將這些鼠氨基酸殘基疊加到同源的人框架上。對于這種兩個步驟的方法，有幾個標(biāo)準(zhǔn)用來設(shè)計人源化抗體。第一個標(biāo)準(zhǔn)是用來自通常與非人供體免疫球蛋白同源的特定人免疫球蛋白的框架作為人受體，或者使用來自多種人抗體的共有框架。第二個標(biāo)準(zhǔn)是，如果人受體殘基異常且供體殘基在框架的特定殘基處是人序列典型的，則使用供體氨基酸而不是受體氨基酸。第三個標(biāo)準(zhǔn)是在緊鄰CDR的位置處使用供體框架氨基酸殘基而不是受體氨基酸殘基。也可以使用一種不同的方法，如Tempest, Biotechnology 9:266-271(1991)所述。對于這種方法，分別用來源于NEWM和REI重鏈和輕鏈的V區(qū)框架進(jìn)行CDR移植，而不根本引入小鼠殘基。使用該方法的ー個優(yōu)點是NEWM和REI可變區(qū)的三維結(jié)構(gòu)通過X射線結(jié)晶學(xué)已知，因此⑶R與V區(qū)框架殘基的特異性相互作用能夠容易地模擬。其它部分本發(fā)明的單克隆抗體還可包含用來實現(xiàn)希望的功能的其它部分。例如，這些抗體可以包括毒素部分(例如破傷風(fēng)類毒素或篤麻毒素)或放射性核素(例如mIn或9°Y),用于殺傷抗體靶向的細(xì)胞(參見，例如美國專利6，307，026)。這些抗體可以含有易于分離或檢測的部分(例如生物素、熒光部分、放射性部分、組氨酸尾或其它肽標(biāo)簽)。這些抗體也可含有一個能夠延長其血清半衰期的部分，例如聚こニ醇(PEG)部分。病情和動物模型本發(fā)明的抗體可用于ανβ6介導(dǎo)的疾病的治療，包括預(yù)防。例如，這些抗體通過阻斷TGF-β的激活或阻斷ανβ6與其它任何配體(如纖連蛋白、玻連蛋白和腱生蛋白)的結(jié)合，能夠用來治療纖維化(如肺纖維化、急性肺損傷、腎纖維化、肝纖維化、奧爾波特綜合征和硬皮病)。該方法的新穎性包括(I)阻斷TGF-β的激活，而不是TGF-β與其受體的結(jié)合，⑵能夠局部抑制TGF-β (即在ανβ6上調(diào)位點處)，而不是全身抑制，(3)抑制ανβ6與配體的結(jié)合。除了纖維化疾病以外，本發(fā)明的抗體還可用于治療癌癥或癌癥轉(zhuǎn)移(包括腫瘤生長和侵襲)，特別是上皮癌。上皮癌的ー個亞類是鱗狀細(xì)胞癌，例如頭頸癌、ロ、乳房、肺、前列腺、子宮頸、咽、結(jié)腸、胰腺和卵巣癌。我們使用新的ανβ6單克隆抗體的研究證實ανβ6在多種上皮癌中高表達(dá)，特別是在腫瘤的前緣。這些新抗體也能夠用于ανβ6介導(dǎo)的其它任何疾病，包括銀屑病。本發(fā)明的治療對罹患這些疾病的人和動物對象都有效。本發(fā)明適用的動物對象擴展到作為寵物或為了商業(yè)目的獲得的家畜和牲畜。例子包括狗、貓、牛、馬、綿羊、豬和山羊。本發(fā)明的抗體的效能可以用不同的動物模型檢驗。肺纖維化小鼠模型包括博來霉素誘導(dǎo)的(Pittet 等人，J. Clin. Invest. 107(12) 1537-1544(2001);和 Munger 等人，同上)和放射誘導(dǎo)的肺纖維化(Franko等人，Rad. Res. 140 =347-355 (1994)) 在博來霉素處理的小鼠中，ανβ6的表達(dá)在肺上皮肺泡細(xì)胞中増加。但是36敲除小鼠受到保護(hù)，免遭博來霉素誘導(dǎo)的損傷和纖維化。腎纖維化小鼠模型包括C0L4A3-/-小鼠(參見，例如Cosgrove等人，Amer.J. Path. 157 1649-1659 (2000))、具有阿霉素誘導(dǎo)的損傷的小鼠(Wang等人，KidneyInternational 58 :1797-1804(2000) ；Deman 等人，Nephrol Dial Transplant 16:147-150(2001))、db/db 小鼠(Ziyadeh 等人，PNAS USA 97 :8015-8020(2000))和單側(cè)輸尿管阻塞的小鼠(Fogo等人,Lab Investigation 81 :189A(2001))。在所有這些模型中，小鼠發(fā)展為腎損傷和纖維化，能夠進(jìn)展為腎衰竭。對于C0L4A3-/-小鼠、阿霉素處理的小鼠和單側(cè)輸尿管阻塞的小鼠，在其腎臟的上行小管和下行小管的上皮層中ανβ6上調(diào)。在多種腎損傷模型中，ανβ6的表達(dá)也可能増加。也能夠在作為標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移模型的這些動物模型中檢驗抗ανβ6單克隆抗體抑制腫瘤生長、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的能力。參見，例如，Rockwell等人，J. Natl. Cancer Inst. 49 :735(1972) ；Guy 等人，Mol. Cell Biol. 12 :954(1992) ；ffyckoff 等人，CancerRes. 60 :2504(2000);和 0ft 等人，Curr. Biol. 8 :124(1998)。癌癥中重要的 ανβ6 配體可能包括與轉(zhuǎn)移有關(guān)的TGF-β (綜述見Akhurst等人，Trends in Cell Biology 11:S44-S51(2001))、纖連蛋白和玻連蛋白。本發(fā)明的治療的效能可以用多種可以獲得的診斷方法檢驗，包括身體檢查、血液檢查、蛋白尿測定、肌酐水平和肌酐清除率、肺功能檢查、血漿尿素氮(BUN)水平、瘢痕或纖維化損傷的觀察和評分、胞外基質(zhì)(如膠原蛋白、平滑肌肌動蛋白和纖連蛋白)的沉積、腎功能檢查、超聲波、磁共振成像(MRI)和CT掃描。藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物包含一種或多種本發(fā)明的抗體，或其藥學(xué)可接受的衍生物，任選地含有任何一種藥學(xué)可接受的載體。如此處所用的術(shù)語“載體”包括已知的可接受的佐劑和載體。根據(jù)本發(fā)明，藥物組合物可以是無菌注射制劑的形式，例如無菌注射用水或油懸液。該懸液可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的技術(shù)用適當(dāng)?shù)姆稚?、濕潤劑和懸浮劑配制而成。本發(fā)明的藥物組合物可以按需要ロ服、局部、靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、髓內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑液內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)或顱內(nèi)施用，或者只是在炎癥或腫瘤生長部位局部施用。本發(fā)明的藥物組合物也可以通過使用如噴霧器、干粉吸入器或計量劑量吸入器吸入施用?？捎行Мa(chǎn)生希望的效應(yīng)的本發(fā)明之抗體的劑量和劑量率取決于多種因素，如所治療的疾病的性質(zhì)、受試者的體重、治療目的、使用的具體藥物組合物和主治醫(yī)生的判斷。約0. 001-約100mg/kg體重姆天,例如約0. I-約50mg/kg體重姆天的活性成分化合物的劑量水平是有用的。例如，本發(fā)明的抗體將以1-14天的間隔，以約0.01mg/kg體重/天到約20mg/kg體重/天,例如約0. lmg/kg體重/天到約10mg/kg體重/天的劑量施用。在另ー個實施方案中，當(dāng)抗體腹膜內(nèi)施用吋，以約0. 3-lmg/kg體重的劑量施用。在另ー個實施方案中，當(dāng)抗體靜脈內(nèi)施用時，以約在5-12. 5mg/kg體重的劑量施用。在一個實施方案中，抗體組合物以有效產(chǎn)生至少lmg/ml的血漿抗體水平的量施用。診斷方法本發(fā)明的抗體能夠用來診斷與ανβ6表達(dá)水平改變有關(guān)的疾病。來自受試者的組織標(biāo)本，如組織活檢、體液標(biāo)本或灌洗液(如肺泡灌洗液)，可以通過使用這些抗體的抗原捕獲測定、ELISA、免疫組化測定等來檢測。來自正常個體的組織標(biāo)本作為對照。
除非另外指出，本發(fā)明的實施將使用細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、蛋白化學(xué)和免疫學(xué)常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)屬于本領(lǐng)域的技能。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中描述。參見，例如《分子克隆實驗室指南》，第二版(Sambrook等人編)，1989 ;《寡核苷酸合成》(M. J. Gait編)，1984 ;授予Mullis等人的美國專利4，683，195 ;《核酸雜交》(B. D. Hames和 S. J. Higgins)，1984 :《轉(zhuǎn)錄和翻譯》(B. D. Hames 和 S. J. Higgins)，1984 :《動物細(xì)胞培養(yǎng)》(R. I. Freshney編)，1987 ;《固定的細(xì)胞和酶》，IRL Press, 1986 :《分子克隆實用指南》(B. Per bal)，1984 ;《酶學(xué)方法》，第154和155卷(Wu等人編),Academic Press,紐約；《用于哺乳動物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體》(J. H. Miller和M. P. Calos編)，1987 ；《細(xì)胞和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法》(Mayer和Walker編)，1987 ；《實驗免疫學(xué)手冊》，第I-IV卷(D. M. Weir和C. C. Blackwell編)，1986 ;《小鼠胚胎的操作》，1986。除非另外定義，在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。典型的方法與材料在下文中描述，但是與此處所述相似或相當(dāng)?shù)姆椒ㄅc材料也能夠在本發(fā)明的實施中使用。此處提到的所有公開文本和其它參考文獻(xiàn)在此全文引用作為參考。如果沖突，以本說明書，包括定義，為準(zhǔn)。材料、方法和實施例只是說明性的，而非意在限制。在本說明書中，單詞“包含”或其時態(tài)變化意味著包含所述整體或整體組，但是并不排除其它任何整體或整體組。
實施例下列實施例g在說明本發(fā)明的方法與材料。在抗體領(lǐng)域通常遇到的，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，所述條件和參數(shù)的適當(dāng)修改和改變，在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。在下列實施例中，β6-/-小鼠如Huang等人，J. Cell Biol. 133 :921(1996)所述產(chǎn)生。重組人 LAP 購自 R&D Systems (Minneapolis,MN)?？贵w 10D5 購自 Chemicon (Temecula,CA)。L230雜交瘤購自ATCC，分泌的抗體通過在固定的蛋白A上親和層析從飽和培養(yǎng)物的上清液中純化?？贵w的同種型分型用IS0STRIP試劑盒(Roche Diagnostics)根據(jù)廠商說明書進(jìn)行。β 6 轉(zhuǎn)染的 SW480 細(xì)胞系如 Weinacker 等人，J. Biol. Chem. 269 :6940-6948 (1994)所述制備。實施例I : β 6轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定細(xì)胞系的產(chǎn)生β 6轉(zhuǎn)染的NIH 3Τ3和FDC-Pl細(xì)胞如下產(chǎn)生用含有全長鼠β 6cDNA和新霉素選擇性標(biāo)記的DNA構(gòu)建體電穿孔親本細(xì)胞系。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞如下篩選在含有G418的培養(yǎng)基中傳代細(xì)胞14天，隨后通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分離表達(dá)最高水平的表面β6的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的FDC-PI細(xì)胞在DMEM中培養(yǎng)，其中補充了 4mM L-谷氨酰胺，調(diào)節(jié)為含有1. 5g/L碳酸氫鈉、4. 5g/L葡萄糖和I. OmM丙酮酸鈉、10% FBS,2. 5%小鼠IL-3培養(yǎng)添加物和I. 5mg/ml活性G418。轉(zhuǎn)染的NIH 3T3細(xì)胞在補充了 10% FBS、2mM L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素和lmg/ml活性G418的DMEM中培養(yǎng)。實施例2 :可溶性人α ν β 6的純化α νβ 6蛋白質(zhì)基本如上文的Weinacker所述純化。培養(yǎng)ー種表達(dá)hs α νβ 6的CHO細(xì)胞系，離心收集獲得的上清液。使用抗αν抗體L230通過親和層析純化整聯(lián)蛋白。純化的L230與CNBr激活的Sepharose 4Β(Sigma)以4. 8mg抗體/ml樹脂的比例交聯(lián)。α νβ 6上清液以O(shè). 5mg抗體/ml樹脂的比例加到L230親和柱上，用10倍體積的下列每種溶液洗柱(l)50mM Tris-Cl, pH 7· 5，IM NaCl, ImM MgCl2 ； (2) 50mM Tris-Cl, pH 7. 5,50mM NaCl，ImM MgCl2 ;和(3) IOmM Na3PO4, pH 7. 0。hs α νβ 6 用 IOOmM 甘氨酸，pH 2. 5 洗脫到 I 10體積的IM Na3PO4, pH 8. O內(nèi)。蛋白質(zhì)對磷酸緩沖液(PBS)透析，期間更換幾次PBS，貯存于-20°C。實施例3 β 6-/-小鼠的免疫β 6-/-小鼠通過腹膜內(nèi)(IP)注射在完全弗氏佐劑(CFA)中乳化的25 μ g純化重組人α νβ 6而免疫，其體積比為I : 1，總體積為200 μ I。此外，β 6-/-小鼠也通過IP注射4Χ106β6轉(zhuǎn)染的NIH 3Τ3細(xì)胞而免疫，這些細(xì)胞重懸浮于補充了 lmg/ml CaCl2和lmg/mlMgCld^lOOyl PBS中，同一小鼠也在相鄰部位注射100 μ I CFA。開始免疫2周和4周后，用相同的試劑類似地加強免疫小鼠，不同之處是使用不完全弗氏佐劑代替CFA。小鼠在最后ー次加強7天后采血，根據(jù)血清與純化的重組人α ν β 6或與β 6轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的結(jié)合，測定抗β 6滴度。對于用純化的重組人α νβ 6免疫的小鼠，使小鼠休息3個月，用與ImmunEasy (Qiagen)混合的相同抗原再次免疫。在為了雜交瘤融合分離脾臟前3天，通過IP和靜脈內(nèi)注射，用12.5yg純化的重組人ανβ6蛋白免疫小鼠。在融合當(dāng)天，殺死動物，取出脾臟，制成單細(xì)胞懸液。脾細(xì)胞通過與可藥物選擇的細(xì)胞融合配偶體融合而成為無限増殖的。實施例4 :雜交瘤的篩選通過β6_/_小鼠的免疫產(chǎn)生兩組抗體。ー組抗體通過用截短的可溶性人ανβ6 (融合#6)免疫產(chǎn)生。另ー組抗體通過用鼠β6轉(zhuǎn)染的NIH 3Τ3細(xì)胞(融合#7)免疫產(chǎn)生?？功力挺?抗體的篩選用如下所述的基于細(xì)胞的和無細(xì)胞的結(jié)合和功能測定進(jìn)行。陽性克隆的最初篩選是基于與純化的hsavi36和β6轉(zhuǎn)染的人和鼠細(xì)胞的結(jié)合(未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照)。使選擇的克隆擴增，利用細(xì)胞捕獲試驗再次評價終培養(yǎng)物與β 6轉(zhuǎn)染的和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的結(jié)合(實施例5b，同上)(圖IA和IB顯示的代表性實施例，其中省略了mAb名稱的前綴“6. ”或“7. ”，它們分別是指融合6和融合7 ;參見下表2)。某些抗體偏愛結(jié)合β 6轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，而有些與轉(zhuǎn)染的和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞都結(jié)合，表明只有一個亞類的抗體具有β 6偏好性(圖IA和1Β)。進(jìn)ー步的篩選是基于抗體阻斷生物素化的hs α νβ 6和β 6轉(zhuǎn)染的鼠細(xì)胞與LAP結(jié)合的能力。使用FACS亞克隆選擇的克隆，凍存到使用前。根據(jù)與ανβ6結(jié)合的特異性篩選單克隆抗體，這是基于它們結(jié)合β6轉(zhuǎn)染的細(xì)胞而不結(jié)合未轉(zhuǎn)染的親本細(xì)胞的能力。根據(jù)它們不能與表達(dá)ανβ3、Q νβ 8> Q 1> ανβ 或CiJ1的細(xì)胞系結(jié)合，這些單克隆抗體進(jìn)ー步被證實為ανβ6而不是其它Civ整聯(lián)蛋白或非特異性整聯(lián)蛋白(即與含RGD的配體結(jié)合的非Civ整聯(lián)蛋白)的特異結(jié)合剤。其中包括穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以及未轉(zhuǎn)染的JY、K562、SW480、NIH 3T3和FDCPl細(xì)胞系。已經(jīng)由ATCC保藏的其中ー些抗體在下面表I中列出。表I保藏的雜交瘤
權(quán)利要求
1.ー種單克隆抗體，其(a)特異性結(jié)合ανβ6;和(b)抑制ανβ6與潛伏相關(guān)肽的結(jié)合，其IC50值低于10D5的IC50值。
2.ー種單克隆抗體，其特異性結(jié)合ανβ6，但是不抑制ανβ6與潛伏相關(guān)肽(LAP)的結(jié)ムロ ο
3.一種組合物，其含有權(quán)利要求I或2的抗體，和藥學(xué)可接受的載體。
4.權(quán)利要求3的組合物用于制備治療研究對象患有ανβ6介導(dǎo)的疾病的藥物的用途，其中所述疾病是纖維化、急性肺損傷、銀屑病、癌癥和奧爾波特綜合征，所述藥物用于緩解該疾病或延遲其發(fā)作。
5.權(quán)利要求4的用途，其中研究對象是人。
6.權(quán)利要求4的用途，其中所述纖維化是硬皮病、結(jié)瘢、肝纖維化、腎纖維化或肺纖維化。
7.權(quán)利要求4的用途,其中所述疾病是上皮癌。
8.權(quán)利要求4的用途，其中所述癌癥是口腔、皮膚、子宮頸、卵巣、咽、喉、食道、肺、乳房、腎或結(jié)腸直腸癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及抗αvβ6抗體。
文檔編號A61K51/10GK102659946SQ201210066438
公開日2012年9月12日 申請日期2003年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月13日
發(fā)明者D·R·利昂, D·舍帕德, K·J·西蒙, P·H·維尼爾博, S·M·維歐雷特 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會, 拜奧根Idec馬薩諸塞公司