專利名稱：一種快速構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種快速構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
組織工程的核心就是建立細(xì)胞與生物材料的三維空間復(fù)合體，用以對(duì)病變或受損組織進(jìn)行形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的重建并達(dá)到永久性替代。對(duì)于多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官來(lái)說(shuō)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)決定著組織器官的功能，如何制備具有生命力的復(fù)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，對(duì)于本領(lǐng)域的發(fā)展和臨床的實(shí)際應(yīng)用具有重要的作用。
常規(guī)的復(fù)層細(xì)胞構(gòu)建方法為種植細(xì)胞逐層生長(zhǎng)法，首先種植單層細(xì)胞，底層細(xì)胞可借助靜電吸附或與細(xì)胞外基質(zhì)的配體結(jié)合來(lái)粘附，經(jīng)歷足夠時(shí)間后，單層細(xì)胞間可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞融合，并進(jìn)一步形成一定強(qiáng)度的細(xì)胞連接，繼續(xù)給以一定的促生長(zhǎng)或促分化培養(yǎng)條件，使其再逐層增殖或分化為復(fù)層細(xì)胞。其基本特點(diǎn)可概括為形成單層細(xì)胞一單層細(xì)胞間連接形成一形成復(fù)層細(xì)胞。這種最為常規(guī)的培養(yǎng)細(xì)胞復(fù)層的方法被廣泛應(yīng)用于心肌、氣管、皮膚和角膜組織的復(fù)層細(xì)胞構(gòu)建研究中，雖然可最終形成與天然類似的大體組織學(xué)結(jié)構(gòu)，但卻存在如下明顯的限制性因素①構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞組織所需時(shí)間不具備臨床應(yīng)用的可行性單層細(xì)胞增殖到融合，細(xì)胞與細(xì)胞之間受體特性體連接的形成，單層細(xì)胞的2維生長(zhǎng)向復(fù)層細(xì)胞3維生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變，均需較多的構(gòu)建時(shí)間(數(shù)周)。對(duì)于需要組織工程產(chǎn)品替代的急性組織缺損來(lái)說(shuō)，數(shù)周的體外構(gòu)建時(shí)間，已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了臨床診治時(shí)所能提供的治療時(shí)限。②生物學(xué)和物理學(xué)功能不完善目前的體外生物反應(yīng)器還無(wú)法完全模擬體內(nèi)條件下細(xì)胞生長(zhǎng)所面對(duì)的真正微環(huán)境，其提供的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)方式以及代謝廢物的去除方式，與體內(nèi)條件差異仍然很大。因此，較長(zhǎng)的構(gòu)建時(shí)間通常會(huì)導(dǎo)致構(gòu)建的細(xì)胞復(fù)層出現(xiàn)細(xì)胞過(guò)度分化和老化，各種細(xì)胞的黏附和增殖功能也會(huì)不斷下降，同時(shí)細(xì)胞復(fù)層的各種物理學(xué)功能(細(xì)胞層的生物力學(xué)強(qiáng)度、電生理功能、組織極性等)也會(huì)相應(yīng)下降。這些構(gòu)建組織的各種功能學(xué)不足也嚴(yán)重制約了最終的臨床應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)建時(shí)間短，構(gòu)建的復(fù)層細(xì)胞具備更好的生物力學(xué)強(qiáng)度和更好的細(xì)胞生物學(xué)功能的快速構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞的方法。本發(fā)明的快速構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟a)將種子細(xì)胞和液態(tài)的細(xì)胞外基質(zhì)凝膠混懸得到液體混懸液；b)將液態(tài)混懸液置于構(gòu)建載體上,使載體上的液態(tài)混懸液凝固成固態(tài)凝膠,直接形成復(fù)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，然后加入培養(yǎng)液培養(yǎng)復(fù)層細(xì)胞至足夠強(qiáng)度。所述的種子細(xì)胞指的是所需構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞組織的細(xì)胞,這些細(xì)胞可以經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增或是從組織塊中新鮮分離，如角膜上皮細(xì)胞、表皮上皮細(xì)胞、成纖維上皮細(xì)胞或心肌細(xì)胞。所述的細(xì)胞外基質(zhì)凝膠是指所需構(gòu)建組織的細(xì)胞(種子細(xì)胞)相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞外基質(zhì)成分的混合物或者單一成分所形成的凝膠，如角膜上皮細(xì)胞(種子細(xì)胞)對(duì)應(yīng)角膜基質(zhì)凝膠，人表皮上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(種子細(xì)胞)對(duì)應(yīng)人皮膚基質(zhì)凝膠，心肌細(xì)胞(種子細(xì)胞)對(duì)應(yīng)心臟基質(zhì)凝膠?？梢詾樗铇?gòu)建組織的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、多糖和糖蛋白的混合物或單一成份所形成的凝膠。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)所需構(gòu)建組織的細(xì)胞，按照本領(lǐng)域的常規(guī)知識(shí)獲取其該細(xì)胞外基質(zhì)凝膠。如利用各種變性蛋白質(zhì)提取方法或非變性蛋白質(zhì)提取方法，從天然動(dòng)物組織中提取并純化出各種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的單一成分或者混合成分制備凝膠溶液。優(yōu)選利用非變性蛋白質(zhì)提取方法，提取所構(gòu)建組織的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、多糖和糖蛋白的混合物或單一成分來(lái)制備基質(zhì)凝膠。這種凝膠的突出優(yōu)點(diǎn)在于提供了種子細(xì)胞本身的基質(zhì)微環(huán)境，可有效的結(jié)合種子細(xì)胞表面的各種整合素受體，避免種子細(xì)胞凋亡。同時(shí)這種基質(zhì)凝膠可以吸附各種生長(zhǎng)因子，達(dá)到生理狀態(tài)的緩釋效果。一般可通過(guò)控制細(xì)胞外基質(zhì)凝膠的溫度和濃度使其呈液態(tài)，優(yōu)選溫度為20 37°C。所述的構(gòu)建載體指的是利用天然組織脫細(xì)胞基質(zhì)形成天然支架材料，或是利用合成材料構(gòu)建的高分子支架材料，其主要起載體作用。利用合成材料構(gòu)建的高分子支架材料可以從現(xiàn)有技術(shù)中購(gòu)買，而利用天然組織脫細(xì)胞基質(zhì)形成天然支架材料屬于常規(guī)技術(shù)。所述的構(gòu)建載體優(yōu)選為利用脫細(xì)胞角膜基質(zhì)、脫細(xì)胞皮膚基質(zhì)或脫細(xì)胞心臟基質(zhì)形成的天然支架材料。所述的將載體上的液態(tài)混懸液凝固成固態(tài)凝膠，其方法包括降低溫度或使液態(tài)混懸液脫水以提高凝膠濃度或兩者的結(jié)合來(lái)使液態(tài)混懸液凝固成固態(tài)凝膠。所述的降低溫度是指降低液態(tài)混懸液的濃度從而使液態(tài)混懸液形成固態(tài)凝膠的溫度，優(yōu)選溫度為4 200C。所述的使液態(tài)混懸液脫水以提高凝膠濃度優(yōu)選利用載體的吸水性實(shí)現(xiàn)液態(tài)混懸液的脫水從而提高凝膠濃度使液態(tài)混懸液形成固態(tài)凝膠或利用負(fù)壓蒸發(fā)的方式脫水濃縮液態(tài)混懸液形成固態(tài)凝膠。
所述的培養(yǎng)復(fù)層細(xì)胞是利用種子細(xì)胞的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)的方式包括靜態(tài)培養(yǎng)、氣液界面培養(yǎng)、連續(xù)灌注培養(yǎng)或者它們的組合。與現(xiàn)有的逐層培養(yǎng)復(fù)層細(xì)胞的技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下①更快的構(gòu)建過(guò)程可滿足臨床診治時(shí)所能提供的治療時(shí)限。使用足量的種子細(xì)胞，借助天然細(xì)胞外基質(zhì)凝膠所提供的臨時(shí)載體，可直接實(shí)現(xiàn)復(fù)層細(xì)胞的3維構(gòu)建，天然細(xì)胞外基質(zhì)凝膠成分提供了大量的細(xì)胞粘附底物，使得待構(gòu)建的種子細(xì)胞周邊包裹了足夠的細(xì)胞外基質(zhì)，從而使得原本需要更長(zhǎng)時(shí)間(2周以上)才能建立的細(xì)胞-細(xì)胞連接，轉(zhuǎn)變?yōu)檩^易形成的細(xì)胞-基質(zhì)-細(xì)胞連接(3天)。這種快速的構(gòu)建過(guò)程，為最終的臨床應(yīng)用爭(zhēng)取了治療時(shí)間，也避免了由于體外構(gòu)建時(shí)間過(guò)長(zhǎng)帶來(lái)的種子細(xì)胞生物功能的下降。②構(gòu)建的復(fù)層細(xì)胞具備更好的細(xì)胞生物學(xué)功能。這種來(lái)源于天然細(xì)胞外基質(zhì)凝膠包含大量的細(xì)胞膜結(jié)合配體，包括各種類型的膠原，蛋白多糖和糖蛋白成分，可以特異性的結(jié)合種子細(xì)胞表面的各種受體，發(fā)揮影響種子細(xì)胞生物學(xué)功能的作用。例如與細(xì)胞表面各種整合素的結(jié)合可有效減少種子細(xì)胞細(xì)胞凋亡；各種蛋白多糖成分可以抑制種子細(xì)胞在培養(yǎng)階段的細(xì)胞分化或老化。因此使構(gòu)建的復(fù)層細(xì)胞具備更好的細(xì)胞生物學(xué)功能。③構(gòu)建的復(fù)層細(xì)胞具備更好的生物力學(xué)強(qiáng)度。大量細(xì)胞外基質(zhì)凝膠的加入本身可顯著增加細(xì)胞復(fù)層的強(qiáng)度，從而使得這種短期快速構(gòu)建的復(fù)層細(xì)胞片獲得足夠的力學(xué)強(qiáng)度。
因此本發(fā)明可快速制備滿足增殖活性和力學(xué)強(qiáng)度要求的各種含有復(fù)層細(xì)胞的組織器官，是組織工程構(gòu)建技術(shù)的重大突破，同時(shí)本發(fā)明原理可靠，工藝簡(jiǎn)單靈活，產(chǎn)品重現(xiàn)性好，極易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明的快速構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞的方法，其步驟詳述如下(a)準(zhǔn)備種子細(xì)胞。按照需構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，計(jì)算所需種子細(xì)胞的種類和總量，利用體外原代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)方法擴(kuò)增所需細(xì)胞，或直接從組織塊中新鮮分離出的足夠的細(xì)胞作為種子細(xì)胞來(lái)源。離心去除培養(yǎng)液，種子細(xì)胞備用。 (b)在一定溫度下，制備細(xì)胞外基質(zhì)凝膠，使其呈液態(tài)。利用各種變性蛋白質(zhì)提取方法或非變性蛋白質(zhì)提取方法，從天然動(dòng)物組織中提取并純化出各種種子細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的單一成分或者混合成分制備凝膠溶液。優(yōu)選利用非變性蛋白質(zhì)提取方法，提取所構(gòu)建組織的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、多糖和糖蛋白的混合物或單一成分來(lái)制備基質(zhì)凝膠。這種凝膠的突出優(yōu)點(diǎn)在于提供了種子細(xì)胞本身的基質(zhì)微環(huán)境，可有效的結(jié)合種子細(xì)胞表面的各種整合素受體，避免種子細(xì)胞凋亡。同時(shí)這種基質(zhì)凝膠可以吸附各種生長(zhǎng)因子，達(dá)到生理狀態(tài)的緩釋效果。(C)將液態(tài)的細(xì)胞外基質(zhì)凝膠與種子細(xì)胞混懸。將此時(shí)液體狀細(xì)胞外基質(zhì)凝膠的流動(dòng)性可保證與種子細(xì)胞充分混勻。此時(shí)每個(gè)細(xì)胞都接觸基質(zhì)蛋白成分。其表面的整合素都被相應(yīng)的配體成分結(jié)合，可有效避免種子細(xì)胞凋亡。(d)將液態(tài)混懸液置于構(gòu)建載體上。根據(jù)構(gòu)建目的，確定混懸液液膜的厚度。也就是最終構(gòu)建組織的復(fù)層厚度。(e)將載體上的液態(tài)混懸液凝固成固態(tài)凝膠，直接形成復(fù)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)。由于這種細(xì)胞外基質(zhì)凝膠的凝固性與濃度，溫度有關(guān)，本發(fā)明就是調(diào)節(jié)影響凝固的這些因素，實(shí)現(xiàn)凝膠溶液液態(tài)-固態(tài)的轉(zhuǎn)變，從而達(dá)到液態(tài)分散細(xì)胞，固態(tài)固定細(xì)胞的目的。本發(fā)明優(yōu)選的液態(tài)混懸液凝固成固態(tài)凝膠的方法包括降低溫度、液態(tài)混懸液脫水提高凝膠濃度、或其兩者的組合。(f)加入培養(yǎng)液培養(yǎng)復(fù)層細(xì)胞至足夠強(qiáng)度。由于此時(shí)加入的大量細(xì)胞可被固體凝膠直接固定，并且粘附于凝膠之上。此時(shí)復(fù)層細(xì)胞間形成過(guò)渡性的細(xì)胞-基質(zhì)-細(xì)胞的連接，經(jīng)過(guò)體外短期培養(yǎng)或體內(nèi)植入后的重塑改建過(guò)程，最終形成天然的細(xì)胞-細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)。實(shí)施例I :利用脫細(xì)胞角膜基質(zhì)凝膠和脫細(xì)胞角膜基質(zhì)支架制備快速制備組織工程板層角膜。(a)準(zhǔn)備種子細(xì)胞。取角膜緣顳上象限的2mm組織塊4塊，常規(guī)原代培養(yǎng)并傳代至P3代，獲取的3X IO6個(gè)角膜上皮細(xì)胞，置于離心管內(nèi)，離心去除培養(yǎng)液，將此角膜上皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞備用。(b)制備脫細(xì)胞角膜基質(zhì)凝膠，控制濃度和溫度，使其呈液態(tài)。按常規(guī)方法制備的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)樣本，稱重后按I : 5v/v加入lmg/mL胃蛋白酶(P印sin)+0. lmol/L HCL(DDW，pH = 1)，50°C水浴溶解，由于釋放大量堿性氨基酸，完全溶解后，樣品PH值增加至4. 3左右。使用lmol/L NaOH(DDW,pH = 14)溶液調(diào)整樣品pH值至7. 4，按體積比9 I比例加入IOX角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，12000轉(zhuǎn)離心IOmin后，取上清液過(guò)濾除菌，得到脫細(xì)胞角膜基質(zhì)凝膠溶液。經(jīng)蛋白定量檢測(cè)后，使用IX角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整制備的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)凝膠溶液濃度至50mg/ml，置于25°C，此時(shí)凝膠呈液態(tài)，備用。(C)將液態(tài)的細(xì)胞外基質(zhì)凝膠與種子細(xì)胞混懸。向3X IO6個(gè)角膜上皮細(xì)胞中加入50 μ L脫細(xì)胞角膜基質(zhì)凝膠溶液，充分混合均勻，得到液體混懸液。(d)將液態(tài)混懸液均勻滴加于脫細(xì)胞角膜基質(zhì)支架(常規(guī)方法制備，O. 3mm厚度，IOmm直徑)上。(e)將載體上的液態(tài)混懸液凝固成固態(tài)凝膠。由于脫細(xì)胞角膜基質(zhì)支架內(nèi)保留了大量蛋白多糖成分，具備了快速吸水的特性，37°C培養(yǎng)箱內(nèi)放置20分鐘,使混懸液達(dá)到一定程度的濃縮。然后將培養(yǎng)皿放置于4°C培養(yǎng)箱內(nèi)靜置520分鐘，利用脫細(xì)胞角膜基質(zhì)支架進(jìn)一步吸水不斷增加液態(tài)混懸液的濃度，同時(shí)4°C的低溫條件使得液態(tài)混懸液快速形成固體凝膠，此時(shí)角膜上皮細(xì)胞已在脫細(xì)胞基質(zhì)表面直接形成復(fù)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)。(f)對(duì)形成的復(fù)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)至可移植強(qiáng)度。加入IOml角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液,靜止培養(yǎng)6 24小時(shí)后,轉(zhuǎn)移至連續(xù)灌注培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)24 48小時(shí)，然后再轉(zhuǎn)移至氣液界面培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)24 48小時(shí)，以上處理，使得快速制備的復(fù)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)胞連接蛋白逐漸增加，3 5天即可達(dá)到實(shí)用的可移植強(qiáng)度(細(xì)胞橋粒連接蛋白含量30000pg/cm2-35000pg/cm2)。構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞中的角膜上皮細(xì)胞的克隆形成率為9. 5±3. 5%,明顯優(yōu)于逐層培養(yǎng)復(fù)層細(xì)胞培養(yǎng)方法(克隆形成率為6. 5±2% )實(shí)施例2利用脫細(xì)胞皮膚基質(zhì)凝膠快速制備組織工程皮膚細(xì)胞片。(a)準(zhǔn)備種子細(xì)胞。取活體取材獲得的4個(gè)2mm直徑組織塊，分別常規(guī)原代培養(yǎng)，并傳代擴(kuò)增至P5代，獲取4X IO7個(gè)的人表皮上皮細(xì)胞和I X IO7個(gè)人成纖維細(xì)胞，按4 I比例，將人表皮上皮細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞混合，離心去除培養(yǎng)液，作為種子細(xì)胞備用。(b)制備脫細(xì)胞皮膚基質(zhì)凝膠，控制濃度和溫度，使其呈液態(tài)。脫細(xì)胞皮膚基質(zhì)樣本(按照常規(guī)方法制備)稱重后按I : 5v/v加入lmg/mL胃蛋白酶(pepsin) +0. lmol/L HCL (DDW, pH = I)，50°C水浴溶解，使用 lmol/L NaOH(DDW, pH =14)溶液調(diào)整樣品pH值至7. 4，按體積比9 I比例加入IOX人上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，12000轉(zhuǎn)離心IOmin后，取上清液過(guò)濾除菌，得到脫細(xì)胞皮膚基質(zhì)凝膠溶液。經(jīng)蛋白定量檢測(cè)后，使用IX人上皮細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整制備的脫細(xì)胞皮膚基質(zhì)凝膠溶液濃度至100mg/ml，置于250C，此時(shí)凝膠呈液態(tài)，備用。(C)將液態(tài)的細(xì)胞外基質(zhì)凝膠與種子細(xì)胞混懸。向混合細(xì)胞(人表皮上皮細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞)中加入500 μ L脫細(xì)胞皮膚基質(zhì)凝膠溶液，充分混合均勻，得到液態(tài)混懸液。
(d)將液態(tài)混懸液均勻滴加于脫細(xì)胞皮膚基質(zhì)支架(常規(guī)方法制備，3mm厚度，50mm直徑)上。(e)將載體上的液態(tài)混懸液凝固成固態(tài)凝膠。4°C下，利用負(fù)壓蒸發(fā)的方式脫水濃縮液態(tài)混懸液，使其快速形成固體凝膠。此時(shí)種植的混合細(xì)胞已在脫細(xì)胞 皮膚基質(zhì)表面直接形成復(fù)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)。(f)對(duì)形成的復(fù)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)至可移植強(qiáng)度。加入20ml人上皮細(xì)胞培養(yǎng)液靜止培養(yǎng)12-24小時(shí)后，轉(zhuǎn)移至氣液界面培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)3-5天。以上處理,使得快速制備的復(fù)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)胞連接蛋白逐漸增加,4 6天即可達(dá)到實(shí)用的可移植強(qiáng)度(細(xì)胞橋粒連接蛋白含量60000pg/cm2-70000pg/cm2)。構(gòu)建上皮的細(xì)胞克隆形成率為10. 5±2.5%，克隆形成率和細(xì)胞表型都明顯優(yōu)于逐層培養(yǎng)復(fù)層細(xì)胞培養(yǎng)方法(克隆形成率為4. 5±3. 5% )。實(shí)施例3利用脫細(xì)胞心臟基質(zhì)凝膠快速制備組織工程心肌細(xì)胞片。(a)準(zhǔn)備種子細(xì)胞。新鮮分離I日齡乳鼠心室肌組織，將獲取的2X106個(gè)心肌細(xì)胞置于離心管內(nèi)，離心去除培養(yǎng)液,備用。(b)制備脫細(xì)胞心臟基質(zhì)凝膠，控制濃度和溫度，使其呈液態(tài)。脫細(xì)胞心臟基質(zhì)樣本(按照常規(guī)方法制備)稱重后按I : 5v/v加入lmg/mL胃蛋白酶(pepsin) +0. lmol/L HCL (DDW, pH = I)，50°C水浴溶解，使用 lmol/L NaOH(DDW, pH =14)溶液調(diào)整樣品pH值至7. 4，按體積比9 I比例加入IOX心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，12000轉(zhuǎn)離心IOmin后，取上清液過(guò)濾除菌。經(jīng)蛋白定量檢測(cè)后，使用IX心肌細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整制備的脫細(xì)胞心臟基質(zhì)凝膠溶液濃度至80mg/ml，置于25°C，此時(shí)凝膠呈液態(tài)，備用。(c)將液態(tài)的基質(zhì)凝膠與種子細(xì)胞混懸。向2 X IO6個(gè)心肌細(xì)胞中加入100 μ L脫細(xì)胞心臟基質(zhì)凝膠溶液，充分混合均勻，得到液態(tài)混懸液。(d)將液態(tài)混懸液均勻滴加于I型膠原支架載體(常規(guī)方法制備，O. Imm厚度，IOmm直徑)上。(e)將載體上的液態(tài)混懸液凝固成固態(tài)凝膠。4°C下，利用負(fù)壓蒸發(fā)的方式脫水濃縮液態(tài)混懸液，使其快速形成固體凝膠。此時(shí)種植的細(xì)胞已在I型膠原支架表面直接形成復(fù)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)。(f)對(duì)形成的復(fù)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)至可移植強(qiáng)度。加入IOml心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，靜止培養(yǎng)6-12小時(shí)后，轉(zhuǎn)移至連續(xù)灌注培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)4 6天。以上處理,使得快速制備的復(fù)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)胞連接蛋白逐漸增加,5 7天即可達(dá)到實(shí)用的可移植強(qiáng)度(細(xì)胞橋粒連接蛋白含量50000pg/cm2-60000pg/cm2)。心肌細(xì)胞的β -半乳糖苷酶表達(dá)僅為25 %，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于逐層培養(yǎng)復(fù)層細(xì)胞的方法(β -半乳糖苷酶表達(dá)80% :細(xì)胞衰老現(xiàn)象嚴(yán)重)。
權(quán)利要求
1.ー種快速構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟 a)將種子細(xì)胞和液態(tài)的細(xì)胞外基質(zhì)凝膠混懸； b)將液態(tài)混懸液置于構(gòu)建載體上，使載體上的液態(tài)混懸液凝固成固態(tài)凝膠，直接形成復(fù)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，然后加入培養(yǎng)液培養(yǎng)復(fù)層細(xì)胞至足夠強(qiáng)度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的種子細(xì)胞是經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增或從組織塊中新鮮分離得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞外基質(zhì)凝膠是所需構(gòu)建組織的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、多糖和糖蛋白的混合物或単一成分所形成的凝膠。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述的快速構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的液態(tài)的細(xì)胞外基質(zhì)凝膠是通過(guò)控制細(xì)胞外基質(zhì)凝膠的濃度和溫度使其呈液態(tài)，其溫度為20 37°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的構(gòu)建載體是利用天然組織脫細(xì)胞基質(zhì)形成天然支架材料或是利用合成材料構(gòu)建的高分子支架材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞的方法，其特征在干，所述的天然組織脫細(xì)胞基質(zhì)為脫細(xì)胞角膜基質(zhì)、脫細(xì)胞皮膚基質(zhì)或脫細(xì)胞心臟基質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的將載體上的液態(tài)混懸液凝固成固態(tài)凝膠，其方法是降低混懸液的溫度或使液態(tài)混懸液脫水以提高凝膠濃度或兩者的結(jié)合來(lái)使液態(tài)混懸液凝固成固態(tài)凝膠。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的快速構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的降低混懸液的溫度，其混懸液的溫度為4 20°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的快速構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞的方法，其特征在干，所述的使液態(tài)混懸液脫水以提高凝膠濃度是利用構(gòu)建載體的吸水性實(shí)現(xiàn)液態(tài)混懸液的脫水從而提高凝膠濃度使液態(tài)混懸液形成固態(tài)凝膠或利用負(fù)壓蒸發(fā)的方式脫水濃縮液態(tài)混懸液形成固態(tài)凝膠。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)復(fù)層細(xì)胞是利用種子細(xì)胞的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)的方式包括靜態(tài)培養(yǎng)、氣液界面培養(yǎng)、連續(xù)灌注培養(yǎng)或者它們的組合。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種快速構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞的方法。它是將將種子細(xì)胞和液態(tài)的細(xì)胞外基質(zhì)凝膠混懸；將液態(tài)混懸液置于構(gòu)建載體上，使載體上的液態(tài)混懸液凝固成固態(tài)凝膠，直接形成復(fù)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，然后加入培養(yǎng)液培養(yǎng)復(fù)層細(xì)胞至足夠強(qiáng)度。本發(fā)明可快速制備滿足增殖活性和力學(xué)強(qiáng)度要求的各種含有復(fù)層細(xì)胞的組織器官，是組織工程構(gòu)建技術(shù)的重大突破，同時(shí)本發(fā)明原理可靠，工藝簡(jiǎn)單靈活，產(chǎn)品重現(xiàn)性好，極易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
文檔編號(hào)A61L27/38GK102614547SQ20121006651
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月13日
發(fā)明者周強(qiáng), 武征, 王智崇 申請(qǐng)人:中山大學(xué)中山眼科中心