專利名稱：Lect2蛋白在制備病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及LECT2蛋白的應(yīng)用，具體涉及LECT2蛋白在制備病毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞衍生趨化因子(leukocytecell-derived chemotaxin 2, LECT2 蛋白)是一個(gè)多功能的蛋白質(zhì)，分子量約為16 kDa，含三個(gè)分子內(nèi)ニ硫鍵，該分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無糖基修飾。LECT2 —開始被認(rèn)為是ー種嗜中性粒細(xì)胞趨化因子，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)它還與骨骼和血管生長(zhǎng)、肝移植損傷修復(fù)、植物毒素、非病原抗原等引起的病理和生理過程有關(guān)，如公布號(hào)為CN102159238，名稱為抑制病理性血管發(fā)生作用的組合物，就公開了包括有效量的LECT2蛋白制備成抑制病理性血管發(fā)生作用和/或細(xì)胞增生性疾病的組合物。但是目前尚未發(fā)現(xiàn)LECT2對(duì)病毒有預(yù)防和治療作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供LECT2蛋白在制備病毒藥物中的應(yīng)用；其通過激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)干擾素Y和粒細(xì)胞集落刺激因子等抗病毒細(xì)胞因子的表達(dá)，從而提高巨噬細(xì)胞活性，增強(qiáng)動(dòng)物免疫能力，抑制流感病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制。本發(fā)明的上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為L(zhǎng)ECT2蛋白在制備病毒藥物中的應(yīng)用；所述病毒為正粘病毒科病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒科病毒。如甲型流感病毒和小鼠白血病病毒
坐寸ο所述LECT2蛋白為重組LECT2蛋白；重組LECT2蛋白的制備可以依據(jù)Ovejero等&開白勺し identiiication of the leukocyte ceil_derived chemotaxin 2 as a directtarget gene of beta-catenin in the liver，，( Hepatology, 2004 年 7 月、40(1)，167-176 )方法進(jìn)行制備?？梢栽趧?dòng)物細(xì)胞、低等真核生物或原核生物中重組表達(dá)，如在粟酒裂殖酵母、克魯維酵母菌株、念球菌屬或任何可表達(dá)異源性蛋白的酵母菌中表達(dá)得到重組LECT2蛋白?；蛟诖竽c桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌或細(xì)菌等原核生物進(jìn)行表達(dá)得到重組LECT2蛋白。LECT2蛋白可在哺乳動(dòng)物中提取,可以依據(jù)Yamagoe等公開的“Purification andprimary amino acid sequence of a novel neutrophil chemotactic factor LECT2，，、Immunol Lett, 1996年8月、52 (I)，9-13)方法進(jìn)行提取，如包括猴COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、人類腎臟293細(xì)胞、人類表皮A431細(xì)胞、人類Colo205細(xì)胞、3T3細(xì)胞、CV-I細(xì)胞、其它經(jīng)轉(zhuǎn)化的靈長(zhǎng)類細(xì)胞、正常的二倍體細(xì)胞、由體外培養(yǎng)的原生組織衍生的細(xì)胞株、原生移植體、Hela細(xì)胞、老鼠L細(xì)胞、BHK、HL-60、U937、HaK或Jurkat細(xì)胞等動(dòng)物細(xì)胞中提取。LECT2蛋白制備的病毒藥物，可以是純制劑，也可以是與藥學(xué)上可接受的載體組成的各種制劑，如注射劑、ロ服液、丸劑、片劑、膠囊等?？梢允钎矸?、非腸胃吸入、直腸、陰道、皮內(nèi)、經(jīng)皮或局部給予；本發(fā)明的LECT2蛋白可一次給予，24小時(shí)內(nèi)多次給予或連續(xù)給予，劑量可以為每天純LECT2蛋白O. 02 -2 μ g /g體重。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于LECT2蛋白在制備病毒藥物中的應(yīng)用，其中病毒為正粘病毒科病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒科病毒，大量試驗(yàn)表明該LECT2蛋白可以通過激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)干擾素Y (IFN-Y)和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)等抗病毒細(xì)胞因子的表達(dá)，從而提高巨噬細(xì)胞活性，增強(qiáng)動(dòng)物免疫能力，抑制流感病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制，抑制F-MLV感染小鼠的脾增大，提高流感病毒感染小鼠的存活率效果顯著，且無副作用。


圖I為L(zhǎng)ECT2蛋白提高巨噬細(xì)胞抑制流感病毒復(fù)制能力的示意 圖2為L(zhǎng)ECT2蛋白提高流感病毒感染小鼠存活率的示意 圖3為L(zhǎng)ECT2蛋白處理的巨噬細(xì)胞回輸后提高流感病毒感染小鼠存活率的示意 圖4為L(zhǎng)ECT2蛋白抑制F-MLV引起的小鼠脾增大的示意 圖5為L(zhǎng)ECT2蛋白減少小鼠血清中F-MLV的含量的示意 圖6為L(zhǎng)ECT2蛋白處理的巨噬細(xì)胞回輸后減少F-MLV引起的小鼠脾增大的示意圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)描述。實(shí)施例I
1.1材料甲型流感病毒株(H1N1，A/Puerto Rico/8/1934)購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，病毒復(fù)蘇后接種9日齡SPF (無特定病原)雞胚，72小時(shí)培養(yǎng)收取感染雞胚尿囊液，檢測(cè)病毒血凝效價(jià)，SPF雞胚傳至2 3代，-70°C保存。LECT2蛋白為重組LECT2蛋白，重組LECT2蛋白的制備可以依據(jù)OvejeiO等公開方法進(jìn)行制備，在此不作敘述。I. 2重組LECT2蛋白促進(jìn)巨噬細(xì)胞IFN- Y分泌
I.2. I肺巨噬細(xì)胞培養(yǎng)小鼠麻醉并固定，頸部去毛并消毒，在頸部正中切ロ，暴露剝離氣管。并在氣管近端穿線打活結(jié)，活結(jié)要比較松，在所打活結(jié)的遠(yuǎn)端，剪開氣管的1/2，行氣管插管，插入后線打死結(jié)。用5 ml注射器抽取I. 2 ml的滅菌生理鹽水，通過氣管插管注入氣管內(nèi)，反復(fù)抽吸3次，將液體抽出，放入滅菌離心管內(nèi)。重復(fù)上面的操作兩次，灌洗液置于離心管，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。棄上清，沉淀用滅菌生理鹽水沖洗，懸浮細(xì)胞后再離心，重復(fù)三次。然后棄上清，用1640培養(yǎng)液(invitrogen公司)稀釋成lX106/ml,于六孔培養(yǎng)板(corning公司)培養(yǎng)。37° C 5% ニ氧化碳培養(yǎng)2小時(shí)后，吸取上面的液體，重新加入含胎牛血清(FBS) (invitrogen公司)的1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，等細(xì)胞貼壁后，獲得肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液。I. 2. 2 Elisa檢測(cè)重組LECT2蛋白加入培養(yǎng)的肺巨噬細(xì)胞，10小時(shí)和20小時(shí)以后分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用IFN-Y和G-CSF酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(Elisa，R&D system公司)，檢測(cè)上清中IFN-γ的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞上清培養(yǎng)中的IFN-Y和G-CSF表達(dá)含量顯著性上調(diào)，在依5 yg/ml的量將純重組LECT2蛋白加入至巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中，20h后，IFN-Y 由 O pg/ml 上調(diào)到 259. 8 pg/ml，而 G-CSF 由 70. O pg/ml 上調(diào)到 1140. O pg/ml。該結(jié)果說明重組LECT2蛋白處理巨噬細(xì)胞可分泌抑制病毒活性的蛋白。
I.3重組LECT2蛋白抑制流感病毒在肺巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制實(shí)驗(yàn)例用純重組LECT2蛋白(劑量5 μ g/ml)處理肺巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液24小吋，對(duì)比例用相同劑量的生理鹽水處理肺巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液24小時(shí)，再將甲型流感病毒株按感染復(fù)數(shù)(MOI) O. 01，加入培養(yǎng)的肺巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中。于感染0、10、20小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，收集上清液，稀釋以后為病毒懸液，用于檢測(cè)病毒效價(jià)。檢測(cè)方法將狗腎轉(zhuǎn)化細(xì)胞(MDCK細(xì)胞)接種入6孔板，用DMEM培養(yǎng)基(invitrogen公司)培養(yǎng)24-36 h后長(zhǎng)至100%滿，棄掉上清，將細(xì)胞先用磷酸緩沖液(PBS)洗2次，再用無血清DMEM培養(yǎng)基洗I次。再將病毒檢懸液加入孔中，每組三個(gè)復(fù)孔，毎次設(shè)兩個(gè)6孔板重復(fù)，在37° C孵育I h后，棄掉上清，將細(xì)胞先用PBS洗2次，再用無血清DMEM培養(yǎng)基洗I次，以去除沒有吸附的病毒粒子。預(yù)先熔化3%的低熔點(diǎn)瓊脂糖，放至室溫后取6 ml加入到等量的預(yù)熱至37° C的無血清DMEM培養(yǎng)基和胰酶(invitrogen公司),混勻后加入孔中，
Iml/孔，室溫正放30 min以上，待瓊脂凝固后，倒置于37° C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2_4天，待噬斑出現(xiàn)于顯微鏡下觀察。根據(jù)噬斑的數(shù)量和病毒的稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒原液的噬斑效價(jià)，采用PFUs/ml表示(PFU為卩遼斑形成單位-plaque formation unit的縮寫)。結(jié)果如圖I顯示，實(shí)驗(yàn)例用重組LECT2蛋白處理肺巨噬細(xì)胞明顯抑制流感病毒的復(fù)制，甲型流感病毒感染IOh、20h時(shí)間點(diǎn)重組LECT2處理的巨噬細(xì)胞中病毒含量都大大低于生理水處理的巨噬細(xì)胞中病毒含量，20h點(diǎn)的重組LECT2處理的巨噬細(xì)胞中病毒含量?jī)H為55. O PFUs/ml，而對(duì)比例用生理鹽水處理的肺巨噬細(xì)胞流感病毒出現(xiàn)快速復(fù)制，病毒含量達(dá)到1540.0 PFUs/ml。該結(jié)果說明重組LECT2蛋白處理的巨噬細(xì)胞可以抑制流感病毒的復(fù)制。I. 4重組LECT2蛋白提高流感病毒感染小鼠的存活率將1.0X104 PFU甲型流感病毒株溶于30 μ I PBS，通過鼻內(nèi)注射感染小鼠，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各16只小鼠。在病毒感染I天以后，實(shí)驗(yàn)組按小鼠體重O. 2 μ g/g劑量腹腔注射的純重組LECT2蛋白，對(duì)照組注射相同劑量的生理鹽水。每天記錄小鼠存活率，持續(xù)20天。結(jié)果如圖2顯示，病毒感染以后20天，對(duì)照組小鼠存活率為31%，而實(shí)驗(yàn)組小鼠存活率為75%，該結(jié)果說明重組LECT2可用于治療流感病毒感染小鼠，提高其存活率。I. 5重組LECT2蛋白處理的巨噬細(xì)胞回輸可提高流感病毒感染小鼠的存活率采用純重組LECT2蛋白(5 μ g/ml)、生理鹽水分別處理巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液24 h。將I. OX IO4 PFU甲型流感病毒株溶于30 μ I PBS通過鼻內(nèi)注射感染小鼠。在病毒感染I天以后，采用細(xì)胞刮刀將巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中貼壁巨噬細(xì)胞刮下來，制備巨噬細(xì)胞懸液，2Χ IO6個(gè)巨噬細(xì)胞注射到每ー只小鼠。生理鹽水和重組LECT2蛋白處理的巨噬細(xì)胞各注射18只小鼠。每天記錄小鼠存活率，持續(xù)20天。結(jié)果如圖3顯示，病毒感染以后20天生理鹽水處理巨噬細(xì)胞回輸組小鼠存活率為22%，而重組LECT2蛋白處理巨噬細(xì)胞回輸組小鼠存活率為72%，該結(jié)果說明重組LECT2蛋白通過巨噬細(xì)胞來抑制小鼠體內(nèi)的流感病毒，同時(shí)也說明重組LECT2蛋白不僅可以直接用于治療流感病癥，也可以通過激活免疫細(xì)胞來治療流感病癥。實(shí)施例2、與實(shí)施例I基本相同，所不同的只是重組LECT2蛋白由直接從動(dòng)物中提取的LECT2蛋白替代，實(shí)施方法同上，在此不一一列挙，結(jié)果提取的LECT2蛋白都具有相同的上述效果。HlNl病毒也可以由其它正粘病毒科成員替代，可以得到上述效果。實(shí)施例3
2.I LECT2蛋白處理抑制小鼠白血病病毒(MuLV，其中Friend型縮寫為F-MLV)感染引起的小鼠脾增大=F-MLV引自美國經(jīng)典培養(yǎng)物收藏中心，經(jīng)小鼠體內(nèi)傳代，制成10%脾懸液，-70°C保存。并測(cè)定其病毒滴度PFU。把小鼠隨機(jī)分為正常組(未注射F-MLV +生理鹽水處理)、對(duì)照組(注射F-MLV+生理鹽水處理)、實(shí)驗(yàn)組(注射F-MLV+ LECT2處理)，每組小鼠各為12只，除正常組外，F(xiàn)-MLV注射量為每只小鼠通過腹腔注射給與0. 5ml病毒液(病毒滴度100 PFU)。實(shí)驗(yàn)組在注射F-MLVl小時(shí)后用純LECT2蛋白(0.2 U g/g)腹腔注射，正常組和對(duì)照組用相同劑量的生理鹽水代替LECT2蛋白。注射F-MLV后30天，處死小鼠，小鼠處死前禁食禁水4小時(shí)以上，稱量小鼠體重，脾重，脾指數(shù)=小鼠脾重/小鼠體重*100，結(jié)果如圖4發(fā)現(xiàn)，LECT蛋白2處理的實(shí)驗(yàn)組小鼠脾指數(shù)為2. 69%，生理鹽水處理的對(duì)照組小鼠脾指數(shù)達(dá)到12. 67%，正常組小鼠脾指數(shù)為0. 61%，該結(jié)果說明重組LECT2蛋白可抑制F-MLV感染小鼠的脾腫大，LECT2蛋白可明顯減輕F-MLV引起的病癥。2.2 LECT2蛋白處理減少了 F-MLV病毒感染模型小鼠血清中的病毒含量注射F-MLV后30天，取上述2. I各組小鼠的全血標(biāo)本，室溫靜置I小時(shí)，4° C離心10分鐘，小心吸取上層血清，于_70°C保存?zhèn)溆谩２捎脽晒舛縋CR的方法確定血清中病毒的含量。突光定量 PCR 方法可以依據(jù) He 等公開！“Development of a real-time quantitativereverse transcriptase PCR assay for detection of the Friend leukemia virus loadin murine plasma” (Journal of Virological Methods,2008 年 2 月、147(2),345-350)的方法進(jìn)行制備，在此不作敘述。從血清里提取病毒RNA，溶于RNAase滅活的水中，轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用20 U I Taqman熒光定量PCR體系(T0Y0B0公司)檢測(cè)病毒含量。反應(yīng)在熒光 定量PCR (ABI公司)儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?5°C，預(yù)變性10 s ；95°C 10 s, 60°C 30 s,40個(gè)循環(huán)。結(jié)果如圖5顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠的病毒含量?jī)H為對(duì)照組小鼠的病毒含量的7. 1%。該結(jié)果說明LECT2蛋白處理，可抑制F-MLV在體內(nèi)的增殖。2. 3 LECT2蛋白處理的巨噬細(xì)胞回輸減少F-MLV引起的小鼠脾增大巰基乙酸肉湯注射小鼠之后4天脫頸處死小鼠,75%乙醇浸泡5min。用不完全1640培養(yǎng)基5ml反復(fù)灌洗腹腔，收集灌洗液，4°C，離心10 min。用完全1640培養(yǎng)基(含10% FBS，100kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和臺(tái)盼藍(lán)染色，檢測(cè)細(xì)胞存活率大于95%，調(diào)整細(xì)胞濃度至2X IO6 ml，鋪于24孔板內(nèi)，置于CO2培養(yǎng)箱中(37°C，5% CO2)培養(yǎng)2小時(shí)后洗去未貼壁細(xì)胞，剩余貼壁細(xì)胞即原代腹腔巨噬細(xì)胞，原代腹腔巨噬細(xì)胞用LECT2蛋白(5U g/ml)或者生理鹽水分別處理24小時(shí)。每只小鼠通過腹腔注射給與0. 5 mlF-MLV病毒液(100 PFU)，在小鼠感染F-MLV病毒I天以后，采用細(xì)胞刮刀將貼壁巨噬細(xì)胞刮下來，制備巨噬細(xì)胞懸液，2X IO6個(gè)巨噬細(xì)胞注射到每一只小鼠，LECT2蛋白和生理鹽水處理的巨噬細(xì)胞各注射8只小鼠，感染后30天，處死小鼠計(jì)算脾指數(shù)，結(jié)果如圖5、6發(fā)現(xiàn)，LECT2蛋白處理的巨噬細(xì)胞回輸?shù)男∈笃⒅笖?shù)為2. 92%，生理鹽處理的巨噬細(xì)胞回輸?shù)男∈笃⒅笖?shù)為
11.94%，該結(jié)果說明LECT2蛋白處理可能是通過激活巨噬細(xì)胞來達(dá)到抑制F-MLV增殖的效果。
實(shí)施例4、與實(shí)施例3基本相同，所不同的只是直接提取的LECT2蛋白由重組LECT2蛋白替代，實(shí)施方法同上，在此不一一列舉，結(jié)果重組LECT2蛋白都具有相同的上述效果，F(xiàn)-MLV病毒可以由其它型的MuLV病毒替代，也可以為HIV病毒替代等，者具有上述實(shí)施例3相同的結(jié)果。實(shí)施例5
LECT2蛋白對(duì)小鼠毒性檢測(cè)采用20 u g/g的純LECT2蛋白或重組LECT2蛋白的劑量注射小鼠一周內(nèi)，未產(chǎn)生明顯的病理癥狀，未發(fā)生死亡。采用2iig/g的LECT2蛋白對(duì)小鼠腹腔注射兩個(gè)月，未發(fā)現(xiàn)毒性作用。該結(jié)果說明LECT2蛋白對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無毒無害。
權(quán)利要求
1.LECT2蛋白在制備病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述病毒為正粘病毒科病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒科病毒。
2.如權(quán)利要求I所述的LECT2蛋白在制備病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述LECT2蛋白為重組LECT2蛋白。
3.如權(quán)利要求I所述的LECT2蛋白在制備病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述正粘病毒科病毒為甲型流感病毒。
4.如權(quán)利要求I所述的LECT2蛋白在制備病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述逆轉(zhuǎn)錄病毒科病毒為小鼠白血病病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了LECT2蛋白在制備病毒藥物中的應(yīng)用，其中病毒為正粘病毒科病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒科病毒，該LECT2蛋白可以通過激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)干擾素γ和粒細(xì)胞集落刺激因子等抗病毒細(xì)胞因子的表達(dá)，從而提高巨噬細(xì)胞活性，增強(qiáng)動(dòng)物免疫能力，抑制流感病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制，抑制F-MLV感染小鼠的脾增大，提高流感病毒感染小鼠的存活率效果顯著，且無副作用。
文檔編號(hào)A61P31/16GK102671187SQ20121007377
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月20日
發(fā)明者史雨紅, 虞朝輝, 陸新江, 陳炯 申請(qǐng)人:寧波大學(xué), 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院