專利名稱：竹葉青蛇毒l-氨基酸氧化酶的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制備方法及應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
長期以來，一直被認(rèn)為是“不治之癥”的腫瘤是醫(yī)藥界研究熱門課題之一?，F(xiàn)有的抗腫瘤藥物療效很有限，而且大多有嚴(yán)重的副作用，使用效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到人們的預(yù)期。目前市場(chǎng)上還有一類免疫治療藥物，即經(jīng)過激活人的免疫功能以達(dá)到促進(jìn)攻擊癌細(xì)胞的藥物也不少，但因各種癌細(xì)胞本身具有免疫力，所以療效并不理想。因此，目前抗腫瘤藥物的開發(fā)也成為本世紀(jì)新藥研究的重大課題。蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)是一種有潛力的抗腫瘤制劑，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，但目前采用提取蛇毒L-氨基酸氧化酶的工業(yè)化生產(chǎn)還不現(xiàn)實(shí)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制備方法及應(yīng)用，為研制新型的抗腫瘤藥物打下基礎(chǔ)并使得大規(guī)模制備蛇毒L-氨基酸氧化酶成為可能。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案一種竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制備方法。該方法按照下列步驟進(jìn)行(I)竹葉青蛇毒毒腺總RNA的提取和RT從_70°C冰箱取出竹葉青蛇的毒腺，置于研缽中磨成粉末，然后按RNA提取試劑盒說明提取竹葉青總RNA ；以抽提的總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)按照Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒手冊(cè)進(jìn)行，其反應(yīng)體系為42°C 60min,95°C 10min，4°C保存；(2)竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的PCR擴(kuò)增以cDNA為模板，根據(jù)Genebank中公布的竹葉青L-氨基酸氧化酶的基因序列的開放閱讀框利用Primer Primer 5. O軟件設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述引物中，上游引物為含 BamHI 酶切位點(diǎn) 5’ -CGCGGATCCCCACAGTCTTCAAGCCAATA-3 ';含 HindIII 酶切位點(diǎn) 5， CCCAAGCTT GGGACTATAGCTCCTAGAAT-3'；(3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于O. 8 %瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離30min后，在紫外燈下觀察并切下含有目的條帶的凝膠，按照膠回收試劑盒說明回收DNA片段，回收產(chǎn)物保存于_20°C ；(4)竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的克隆與測(cè)序?qū)U(kuò)增竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶目的片段與pMD18-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，并將其鋪于含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板中進(jìn)行培養(yǎng)，在37°C培養(yǎng)12 16h后觀察結(jié)果；挑取菌落進(jìn)行接種在含50 μ g/mL氨芐青霉素(AMP)的LB培養(yǎng)液中，取2μ L為模板進(jìn)行PCR鑒定，陽性的克隆菌株進(jìn)行測(cè)序；
(5)竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶序列分析通過BLAST搜索與其同源性高的基因序列，通過ORF Finder軟件預(yù)測(cè)竹葉青蛇毒 L-氨基酸氧化酶基因開放閱讀框，并用BLAST驗(yàn)證；用信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件Signal IP進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，并通過BLAST搜索與竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶基因閱讀框編碼的氨基酸序列同源性高的其他同系物,并作比較。上述的竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制備方法，步驟⑵中，PCR反應(yīng)體系為 2 X TaqPCR MasterMix 25μ L ;cDNA 產(chǎn)物3μ L ;無菌水19 μ L，上下游引物各 I. 5μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，57°C退火30s，72°C延伸45s，循環(huán)擴(kuò)增30次，最后 72°C延伸 IOmin0竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。為驗(yàn)證竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的治療效果，發(fā)明人進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如下I.試劑與材料I. I試劑IPTG，Sigma公司產(chǎn)品;Taq酶，捷瑞生物公司產(chǎn)品；BamH I和Hind III， MBI 公司產(chǎn)品；SDS,TaKaRa 公司產(chǎn)品；DNA Marker DL2000,TaqPCR MasterMix,BL21 (DE3), 大連寶生物公司產(chǎn)品；DNA回收試劑盒，QIAGEN公司產(chǎn)品產(chǎn)品；PCR引物，由上海生工合成； pMD18-T-ALAg,由貴陽中醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室制備；Pet28a(+), Invitrogen產(chǎn)品。I. 2材料竹葉青蛇毒，采自貴州省思南縣；白兔，購自貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心； 癌細(xì)胞株，購于中科院細(xì)胞所。2 方法2. I兔抗竹葉青蛇毒LAAO陽性血清的制備竹葉青蛇毒用甲醛脫毒后，按《海峽藥學(xué)》，2009，21 (12) :217_220 (張明芳、齊元麟)“眼鏡蛇毒L-氨基酸氧化酶的純化、性質(zhì)鑒定及細(xì)胞毒性測(cè)定”方法進(jìn)行純化竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶，加油佐劑(濃度為O. 2g/L)，免疫分為基礎(chǔ)免疫和超免疫，在兔子的背部?jī)蓚?cè)肌肉注射(O. Iyg)進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，每次間隔3周，在皮下和肌肉、穴位交替進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每只兔子lmg，每次免疫間隔2周。免疫后采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)免疫血清效價(jià)，達(dá)到 28時(shí)進(jìn)行采血分離血清。2. 2質(zhì)粒DNA的小量提取從冰箱取出含pMD18-T-LAA0的DH5 α的EP管于冰浴溶解，1000r/min離心5min， 加入IOyL的LB液體培養(yǎng)基，37 °C 200rpm振蕩培養(yǎng)lh，涂布于含有氨芐青霉素(Amp， 100 μ g/mL)的LB瓊脂平扳上，37°C培養(yǎng)12 16h，挑取菌落進(jìn)行加入100 μ L的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，離心取沉淀進(jìn)行質(zhì)粒DNA提取。2. 3Pet28a (+) -LAAO 構(gòu)建和酶切鑒定pMD18-T-LAA0和Pet28a(+)質(zhì)粒經(jīng)BamH I和Hind III分別進(jìn)行雙酶切，回收目的片段進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化DH5 α，并將其鋪于含有Amp的LB培養(yǎng)基平板中，挑取單個(gè)菌落加入 LB液體培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)過夜，PCR檢測(cè)為陽性菌落進(jìn)行抽提質(zhì)粒DNA。采用BamH I和 Hind III進(jìn)行雙酶切鑒定，將雙酶切鑒定正確的菌株送往大連寶生物公司測(cè)序。2. 4重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE將測(cè)序正確的菌株抽提Pet28a(+)_LAA0質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，加入100 μ L的LB液體培養(yǎng)基，370C 200rpm培養(yǎng)lh，涂布于含有Amp的LB瓊脂平扳上37°C培養(yǎng)12 16h，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行PCR，PCR陽性菌株加入5mL培養(yǎng)物經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3h，同時(shí)設(shè)未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)菌株作為對(duì)照。取誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物離心后，分別取沉淀和上清液按I : I 的比例加入2x上樣緩沖液于煮沸5min，瞬間離心。在樣品孔內(nèi)分別加入待檢樣品(10 μ L/ 孔)進(jìn)行電泳，同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，采用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色。2. 5重組蛋白的純化按I : 100比例將培養(yǎng)過夜的BL21 (DE3)接種到新的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至OD55tl= 1.0。在IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3h進(jìn)行大量表達(dá)，收集誘導(dǎo)表達(dá)菌。用I % PBS (pH 7.2) 洗滌菌體2次，然后用菌體裂解液重懸菌體并經(jīng)超聲破碎來裂解菌體，最后收集沉淀在4°C 溫度下lOOOOgxlOmin離心，并通過去污劑的充分洗滌得到包涵體。將包涵體溶解于7mol/ L尿素中，經(jīng)梯度透析復(fù)性法復(fù)性，即獲得初步純化的復(fù)性液，過濾除菌后備用。2. 7ffestern-blot將純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和Western-blot分析。用0. OlM PBS洗膜3次，5min/次(以下同);加入包被液室溫孵育2h ;棄包被液，洗膜；加入兔抗竹葉青蛇毒陽性血清(按I : 500的比例)，4°C孵育12h以上；棄一抗，洗膜3次；加入羊抗兔辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(作I : 8，000稀釋)，室溫孵育2h;棄二抗，用PBS洗膜4 次；加入顯色液(TMB)避光顯色。2. 8重組蛋白對(duì)抑瘤率的影響分別取出凍存人鼻咽癌、人宮頸癌和卵巢癌細(xì)胞株復(fù)蘇后進(jìn)行培養(yǎng)。用0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞率。當(dāng)活細(xì)胞率彡95%時(shí)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為I X IO6個(gè)/ml，分別于小鼠右腋下注射接種0. 2ml/只。建立小鼠鼻咽癌、人宮頸癌和卵巢癌實(shí)體瘤模型。動(dòng)物隨機(jī)分5組其中3個(gè)組為人鼻咽癌、人宮頸癌和卵巢癌細(xì)胞株組，接種癌細(xì)胞24h后，每組又分為重組蛋白高、中、低劑量三個(gè)小組(100、50和20mg/kg)灌胃；另外2 個(gè)組分別為PBS陰性和CTX陽性對(duì)照組腹腔注射(0. lml/10g體重)。所有動(dòng)物每天給藥I 次，連續(xù)10d。停藥第2d脫頸處死小鼠，剖取瘤塊進(jìn)行稱重，采用腫瘤抑制率(％)=(對(duì)照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重X 100公式計(jì)算抑瘤率。停藥后觀察小鼠存活天數(shù)，計(jì)算小鼠生命延長率。生命延長率(％)=(給藥組平均存活天數(shù)-對(duì)照組平均存活天數(shù))/對(duì)照組平均存活天數(shù)X 100。2. 9數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用SPSS軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用“X土s”來表示。3 結(jié)果3. lPet28a(+)ALAg 質(zhì)粒的酶切鑒定將Pet28a(+)_LAA0質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后DH5 α，挑取單個(gè)菌落提取質(zhì)粒，用BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切鑒定，可得到pET32a(+)載體骨架片段和750bp IOOObp的目的片段，目的片段與預(yù)期大小相符(圖I)。結(jié)果表明，LAAO基因片段已連接到Pet28a⑴載體中。3. 2SDS-PAGE 和 Western-blot 分析將構(gòu)建Pet28a(+)-LAAO轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α，挑取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，將正確的克隆菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Ε. coli BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，取菌液離心取上清，沉淀經(jīng)超聲波破碎后離心，分別經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)蛋白主要以包涵體表達(dá)。取誘導(dǎo)表達(dá)3h的菌液進(jìn)行 SDS-PAGE，表達(dá)產(chǎn)物大小約為58kDa，而含空載體的細(xì)菌經(jīng)誘導(dǎo)后無大小為58KDa條帶，將純化后的蛋白進(jìn)行Western-blot分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)含空載體菌表達(dá)產(chǎn)物不能和兔抗竹葉青蛇毒LAAO陽性血清發(fā)生反應(yīng)，而含重組載體菌表達(dá)產(chǎn)物能與兔抗陽性血清發(fā)生反應(yīng)，結(jié)果如圖2。3. 2重組蛋白對(duì)荷瘤小鼠抑瘤率的影響純化蛋白對(duì)荷瘤小鼠抑瘤率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠灌服重組蛋白后，低、中、高3個(gè)劑量組(50、100、150mg/kg體重，此劑量為換算成藥物劑量)對(duì)小鼠實(shí)體瘤均有明顯的抑制作用。3個(gè)劑量組與陰性對(duì)照組相比，實(shí)體瘤重明顯降低，體積變小，抑瘤率分別達(dá)到 55. 3%,55. 4%和60. 3%。結(jié)果分析顯示低、中、高劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異均極顯著(P <0.01)，但與CTX對(duì)照組相比較，也均表現(xiàn)為差異極顯著(P <0.01)。表明灌服重組蛋白可顯著的抑制小鼠實(shí)體瘤的生長(表1、2和3)。表I重組蛋白對(duì)荷瘤小鼠抑瘤率的影響(X土s，η = 10)
權(quán)利要求
1.一種竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制備方法，其特征在于按照下列步驟進(jìn)行(1)竹葉青蛇毒毒腺總RNA的提取和RT從_70°C冰箱取出竹葉青蛇的毒腺，置于研缽中磨成粉末，然后按RNA提取試劑盒說明提取竹葉青總RNA ；以抽提的總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)按照Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒手冊(cè)進(jìn)行，其反應(yīng)體系為42°C 60min,95°C 10min，4°C保存；(2)竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的PCR擴(kuò)增以cDNA為模板，根據(jù)Genebank中公布的竹葉青L-氨基酸氧化酶的基因序列的開放閱讀框利用Primer Primer 5. O軟件設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述引物中，上游引物為含 BamHI 酶切位點(diǎn) 5，CGCGGATCCCCACAGTCTTCAAGCCAATA-3 '；含 HindiII 酶切位點(diǎn) 5， CCCAAGCTT GGGACTATAGCTCCTAGAAT-3'；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于O. 8 %瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離30min后，在紫外燈下觀察并切下含有目的條帶的凝膠，按照膠回收試劑盒說明回收DNA片段，回收產(chǎn)物保存于_20°C ；(4)竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的克隆與測(cè)序?qū)U(kuò)增竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶目的片段與PMD18-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，并將其鋪于含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板中進(jìn)行培養(yǎng)，在37°C培養(yǎng)12 16h后觀察結(jié)果；挑取菌落進(jìn)行接種在含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，取2 μ L為模板進(jìn)行PCR鑒定，陽性的克隆菌株進(jìn)行測(cè)序；(5)竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶序列分析通過BLAST搜索與其同源性高的基因序列，通過ORF Finder軟件預(yù)測(cè)竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶基因開放閱讀框，并用BLAST驗(yàn)證；用信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件Signal IP進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，并通過BLAST搜索與竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶基因閱讀框編碼的氨基酸序列同源性高的其他同系物，并作比較。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制備方法，其特征在于步驟(2)中，PCR反應(yīng)體系為2XTaqPCR MasterMix 25μ L ;cDNA產(chǎn)物3μ L ;無菌水19 μ L，上下游引物各I. 5yL ;反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，57°C退火30s， 72°C延伸45s，循環(huán)擴(kuò)增30次，最后72°C延伸IOmin0
3.竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明是一種竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制備方法及應(yīng)用，該方法從-70℃的冰箱已保存的竹葉青蛇毒腺進(jìn)行總RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)Genebank中公布的序列(AY277739)利用引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，以cDNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶基因，并進(jìn)行克隆和測(cè)序；試驗(yàn)表明本發(fā)明的重組蛋白能被兔抗竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)陽性血清所識(shí)別且重組蛋白低、中、高劑量組荷瘤小鼠生命延長率與陰性對(duì)照組均存在差異極顯著。本發(fā)明為深入開發(fā)利用竹葉青蛇毒提供了依據(jù)，為進(jìn)一步研制新型的抗腫瘤藥物打下了良好的基礎(chǔ)，具有廣闊的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K38/44GK102604970SQ201210074428
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月20日
發(fā)明者何光志, 曹鋒, 王安宇, 王平, 王文佳, 田維毅, 許滔, 黃高 申請(qǐng)人:貴陽中醫(yī)學(xué)院