專利名稱：丹酚酸a在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬中藥領域，涉及丹酚酸A的用途，尤其涉及丹酚酸A在制藥中的應用。
背景技術：
腎臟纖維化，以腎小球硬化和腎小管間質纖維化為特征，是多種慢性腎臟疾病最終結局。本質上，腎纖維化是以細胞外基質的過度積聚和沉積為特征的過程。產生基質的細胞活化是腎纖維化形成的關鍵。生理情況下，成纖維細胞產生適量的膠原基質充填腎單位、血管和腎被膜之間的空隙。隨年齡增長腎臟體積逐漸增大，成纖維細胞主要起腎間質重塑作用。當損傷及炎癥因素持續(xù)存在時，成纖維細胞增殖并產生過量的細胞外基質。新合成的成纖維膠原成分在腎組織沉積。此外，腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞是主要的產生細胞外基質的細胞。腎纖維化早期，系膜細胞和纖維母細胞發(fā)生活化，晚期出現(xiàn)腎小管上皮細胞向間充質細胞轉分化。很多細胞因子可以促進腎臟成纖維細胞和系膜細胞的活化，加速腎臟纖維化的進程，其中以轉化生長因子-P I (TGF-0 I)作用最強。目前，國外對腎臟纖維化的機制研究較為深入，但是尚無安全有效的治療腎臟纖維化的藥物，而我國在該領域研究活血化瘀中藥的療效取得了一定的成績。丹參是唇型科植物丹參的干燥根和根莖，性苦，微寒，具有活血調經、祛瘀止痛、涼血消癰、除煩安神等功效。丹酚酸A是從丹參中提取的一類既有咖啡酞縮酚酸結構又有新木脂素骨架的水溶性成分，分子式為C26H22Oltl，分子量是494. 45，溶于甲醇、乙醇、水。具有很強的清除自由基和抗氧化作用，其在心臟保護、抗腫瘤等方面有著顯著活性。近年來研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸A還有保護肝細胞、抑制成纖維細胞增殖及抗肝纖維化的作用。劉成海等觀察了丹酚酸A對大鼠肝星狀細胞的影響，結果發(fā)現(xiàn)丹酚酸A能抑制肝星狀細胞的增殖及其膠原生成率，對膠原合成的抑制可能是其抗肝纖維化的主要作用機理之一。王曉玲等觀察了丹酚酸A對成纖維細胞增殖及膠原合成的影響，結果顯示丹酚酸A能抑制成纖維細胞增殖及細胞內膠原合成，體外最佳作用濃度為10_6mol/l。王潤平等觀察了丹酚酸A對過氧化損傷肝細胞的作用，結果顯示丹酚酸A呈濃度依賴性地降低損傷肝細胞顯著升高的ALT (丙氨酸氨基轉移酶)、AST (天冬氨酸轉氨酶)、LDH (乳酸脫氫酶)和SOD (超氧化物歧化酶)活性，改善異常的AST/ALT比值。胡義揚等研究丹酚酸A的抗肝損傷、抗肝纖維化作用及其對I型膠原基因表達的影響，結果顯示丹酚酸A可降低血清ALT、AST水平及肝組織Hyp (羥脯氨酸)含量，減輕肝纖維化程度，抑制I型膠原在基質中沉積。目前，對丹酚酸A在抑制腎成纖維細胞和系膜細胞活化中的作用、降低UUO模型和Platt模型大鼠尿蛋白(24h尿蛋白定量、a I-MG, NAG、^ 2_MG、TRF)、腎功能(Scr、BUN)、減輕腎臟炎癥及膠原沉積中的作用及改善腎纖維化相關基因和蛋白(TGF-0 UCTGF,ColIagenIII、LN、Collagen I、FN)的作用尚未見相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題在于提供丹酚酸A的新用途，即丹酚酸A在制藥中的新應用。為解決上述技術問題，在本發(fā)明的一方面，提供丹酚酸A在制備抑制腎成纖維細胞和系膜細胞活化的藥物中的應用。所述丹酚酸A抑制TGF-P I誘導的腎成纖維細胞和系膜細胞活化的有效濃度為4. 94X 10_5g/ml 4. 94X 10_6g/ml。在本發(fā)明的另一方面，提供丹酚酸A在制備降低腎纖維化的藥物中的應用。所述丹酹酸A降低腎纖維化的有效劑量為10mg/kg/d或17. lmg/kg/d。在本發(fā)明的另一方面，提供丹酚酸A在制備改善尿蛋白的藥物中的應用。所述改善尿蛋白包括改善24h尿蛋白定量、a I-MG, NAG, ^ 2_MG、TRF。在本發(fā)明的另一方面，提供丹酚酸A在制備改善腎功能的藥物中的應用。所述改善腎功能包括改善腎功能Scr、BUN。
在本發(fā)明的另一方面，提供丹酚酸A在制備減輕腎臟炎癥及膠原沉積的藥物中的應用。在本發(fā)明的另一方面，提供丹酚酸A在制備改善腎臟纖維化相關基因和蛋白的藥物中的應用。所述改善腎臟纖維化相關基因和蛋白包括改善纖維化相關基因和蛋白TGF-P I、CTGF、Collagen III、LN、Collagen I、FN。本發(fā)明以TGF-P I為刺激因子，在體外用MTT法觀察不同濃度梯度的丹酚酸A對TGF-Pl刺激下大鼠腎成纖維細胞和系膜細胞活化的作用，并在體內觀察其對UUO模型和Platt模型大鼠尿蛋白、腎功能以及腎臟纖維化相關基因和蛋白的影響。本發(fā)明設計了以TGF-P I誘導的大鼠腎成纖維細胞和系膜細胞活化的篩選平臺，觀察各濃度梯度的丹酚酸A對大鼠腎成纖維細胞和系膜細胞活化的抑制作用及有效工作濃度。結果顯示濃度為4. 94 X 10 Vml 4. 94 X 10 Vml的丹酚酸A可抑制TGF-P I誘導的大鼠腎成纖維細胞和系膜細胞活化，兩個濃度作用效果之間無統(tǒng)計學差異。此外，本發(fā)明設計了丹酚酸A對大鼠腎纖維化作用的體內實驗，觀察丹酹酸A中劑量(10mg/kg/d)及高劑量(17. lmg/kg/d)對UUO模型和Platt模型大鼠尿蛋白、腎功能以及腎臟纖維化相關基因和蛋白的影響，結果中劑量(10mg/kg/d)及高劑量(17. lmg/kg/d)的丹酚酸A均能降低UUO模型和Platt模型大鼠尿蛋白、腎功能以及腎臟纖維化相關基因和蛋白。從而本發(fā)明從體內體外實驗驗證了丹酚酸A能抑制腎成纖維細胞和系膜細胞活化，降低腎纖維化大鼠尿蛋白、腎功能以及腎臟纖維化相關基因和蛋白，即本發(fā)明驗證了丹酚酸A可用于制備降低腎纖維化的藥物。


圖I-圖6是試驗例2中丹酚酸A在UUO模型大鼠腎臟炎癥及膠原沉積研究中光鏡下腎組織結構示意圖；其中，圖I-圖3為HE染色(100 X )，圖I代表A組，圖2代表B組，圖3代表C組；圖4-圖6為Masson染色(100X)，圖4代表A組，圖5代表B組，圖6代表C組。圖7-圖14是試驗例2中丹酚酸A在Platt模型大鼠腎臟炎癥及膠原沉積研究中光鏡下腎組織結構示意圖；其中，圖7-圖10為HE染色(100X)，圖7代表A組，圖8代表B組，圖9代表C組，圖10代表D組；圖11-圖14為Masson染色(100X)，圖11代表A組，圖12代表B組，圖13代表C組，圖14代表D組。具體實施 方式以下通過試驗例對本發(fā)明丹酚酸A的藥理活性試驗及結果作進一步的闡述試驗例I體外實驗一、材料與方法(一 )材料實驗細胞正常大鼠腎臟成纖維細胞株(NRK-49F)和系膜細胞株(HBZY-I)，均購自上海復盟基因生物科技有限公司。丹酚酸A購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號110420 ； TGF-^ I生長因子購自P印roTech公司，產品編號:100_21C。胎牛血清，產品編號S1840-500 ;DMEM高糖培養(yǎng)基，產品編號LOl 103-500 ；
0.25%胰蛋白酶-0. 02%乙二胺四乙酸，產品編號L0932-500 ;青霉素-鏈霉素產品編號03-050-1B ;以上均購自Biowest公司。MTT粉末，化學名為3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5- 二苯基溴化四唑,購自Amresco公司，產品編號0793。( 二 )方法I.實驗步驟I. I MTT法先用 0. 25%胰蛋白酶-0. 02% 乙二胺四乙酸(TrypsinO. 25%-0. 02%EDTA)消化NRK-49F和HBZY-I細胞株，再用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔I X 104/ml個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100 yl。待細胞貼壁后，吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，每孔加入無血清的DMEM培養(yǎng)液100 iil，置37°C、5%的CO2孵箱中孵育24h，使細胞生長同步化。之后加入TGF- ^ I生長因子和丹酚酸A，24h后每孔加入MTT溶液(5mg/ml) 10 u 1，37°C繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內培養(yǎng)上清液(盡量洗凈殘留的培養(yǎng)液)。每孔加入IOOiU DMSO (二甲基亞砜)，振蕩lOmin，使針狀結晶充分溶解。選擇490nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值(0D值)。I. 2 ELISA法先用0. 25 %胰蛋白酶-0. 02 %乙二胺四乙酸(TrypsinO. 25% -0. 02% EDTA)消化NRK-49F和HBZY-I細胞株，再用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔I X 104/ml個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積IOOu I0待細胞貼壁后，吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，每孔加入無血清的DMEM培養(yǎng)液100 yl，置37°C、5%的CO2孵箱中孵育24h，使細胞生長同步化。之后加入TGF-P I生長因子和丹酚酸A，收集24h細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作。2.實驗分組2. I觀察NRK-49F細胞株分7組，每組設5個復孔，分組如下A 組(空白對照組)、B 組(TGF- P I 2ng/ml 組)、C 組(TGF- P I 5ng/ml 組)、D 組(TGF- P 12ng/ml+ 丹酚酸 A 4. 94 X l(T5g/ml 組)、E 組(TGF- P I 2ng/ml+ 丹酚酸 A
4.94X 10 Vml 組)、F 組(TGF- ^ I 5ng/ml+ 丹酚酸 A 4. 94X l(T5g/ml 組)、G 組(TGF- ^ I5ng/ml+丹酚酸A4. 94 X 10 Vml組)。B組和C組為模型組。2. 2觀察HBZY-I細胞株分4組，每組設6個復孔，分組如下A 組(空白對照組)、B 組(TGF- P I 2ng/ml 組)、C 組(TGF- P I 2ng/ml+ 丹酚酸A 4. 94X l(T5g/ml 組)、D 組(TGF- ^ I 2ng/ml+ 丹酚酸 A 4. 94 X 10 Vml 組)。B 組為模型組。
3.觀察指標
3. I采用MTT法觀察24h丹酚酸A對兩種細胞株的作用。3. 2采用ELISA法觀察細胞上清液中TGF- ^的分泌情況。二、結果I.丹酚酸A能抑制活化的大鼠成纖維細胞株(NRK-49F)的增殖空白對照組NRK-49F的OD值為0. 355±0. 034，加入TGF-P I生長因子(2ng/ml和5ng/ml)NRK-49F的OD值為0. 508±0. 026和0. 457±0. 042，明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0. 05)。說明TGF-P I生長因子可以促進NRK-49F的活化。丹酚酸A高劑量(4. 94Xl(T5g/ml)及中劑量(4. 94Xl(T6g/ml)組OD值分別為 0. 450±0. 019,0. 394±0. 010和 0. 389±0. 007,0. 389±0. 011，低于模型組(P < 0. 05 0. 01)(見表 I)。表I丹酚酸A對活化的大鼠成纖維細胞株(NRK-49F)的抑制作用(x±s)
M3]OD 值(24h)
空白對照組(A)0.355±0.034
+TGF-pi 2ng/ml (B)0.508±0.026 *
+TGF-PI 5ng/ml (C)0.457±0.042 *+TGF-Pl 2ng/ml+丹酚酸 A4.94xl0-5g/ml(D) 0.450±0.019#
+TGF-pi 2ng/ml+丹酚酸 A4.94xl0-6g/ml(E) 0.389±0.007#
+TGF-pi 5ng/ml+丹酚酸 A4.94xl0-5g/ml(F) 0.39牡0.010A
+TGF-pi 5ng/ml+丹酚酸 A4.94xl0-6g/ml(G) 0.389±0.011A注與A組比較，*P < 0. 05 ;與B組比較，#P < 0. 01 ;與C組比較，aP < 0. 05。2.丹酚酸A能抑制活化的大鼠系膜細胞株(HBZY-I)的增殖空白對照組HBZY-I的00值為0.204±0.018，加入丁6卩-3 1生長因子(2ng/ml)HBZY-I的OD值為0. 229±0. 019，明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0. 05)。說明TGF-P I生長因子可以促進HBZY-I的活化。丹酚酸A高劑量(4. 94X10_5g/ml)及中劑量(4. 94X l(T6g/ml)組 OD 值分別為 0. 218±0. 020 和 0. 205±0. 013，低于模型組(P < 0. 05)(見表2)。表2丹酚酸A對活化的大鼠HBZY-I的抑制作用(x±s)
M3]OD 值(24h)
空白對照組(A)0.20牡0.018+TGF-pi 2ng/ml (B)0.229±0.019 *
+TGF-pi 2ng/ml+丹酚酸 A4.94xl0-5g/ml (C)0.218±0.020A
+TGF-pi 2ng/ml+丹酚酸 A4.94xl0-6g/ml (D)0.205±0.013A注與A組比較，*P < 0. 05 ;與B組比較，aP < 0. 05。3.丹酚酸A能抑制活化的大鼠成纖維細胞株(NRK-49F) TGF- ^的分泌
空白對照組NRK-49F 的 TGF- ^ 濃度為(15. 682 ± 2. 396) pg/ml，加入 TGF- ^ I生長因子(2ng/ml 和 5ng/ml)NRK-49F 的 TGF-^ 濃度為(122. 664 ±10. 397) pg/ml 和(401.252±31.856)pg/ml，明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0. 01)。說明TGF-P I生長因子可以促進NRK-49F TGF-^的分泌。丹酚酸A高劑量(4. 94X 10_5g/ml)及中劑量(4.94X10_6g/ml)組 TGF-P 濃度分別為(84. 070±5. 726)pg/ml、(262. 198±24. 077)pg/ml 和(67. 894±10. 529)pg/ml, (200. 574±18. 181)pg/ml,低于模型組(P < 0. 05 0. 01)(見表 3)。表3丹酚酸A對活化的大鼠NRK-49F TGF- ^的分泌(x±s)
權利要求
1.丹酚酸A在制備抑制腎成纖維細胞和系膜細胞活化的藥物中的應用。
2.如權利要求I所述的應用，其特征在于，所述丹酚酸A抑制TGF-PI誘導的腎成纖維細胞和系膜細胞活化的有效濃度為4. 94X 10_5g/ml 4. 94X 10_6g/ml。
3.丹酚酸A在制備降低腎纖維化的藥物中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述丹酚酸A降低腎纖維化的有效劑量為10mg/kg/d 或 17. lmg/kg/cL
5.丹酚酸A在制備改善尿蛋白的藥物中的應用，其特征在于，所述改善尿蛋白包括改善 24h 尿蛋白定量、a I-MG, NAG, P 2_MG、TRF。
6.丹酚酸A在制備改善腎功能的藥物中的應用，其特征在于，所述改善腎功能包括改善腎功能Scr、BUN。
7.丹酚酸A在制備減輕腎臟炎癥及膠原沉積的藥物中的應用。
8.丹酚酸A在制備改善腎臟纖維化相關基因和蛋白的藥物中的應用，其特征在于，所述改善腎臟纖維化相關基因和蛋白包括改善纖維化相關基因和蛋白TGF-P I、CTGF,Collagen III、LN、Collagen I、FN0
全文摘要
本發(fā)明公開了丹酚酸A在制藥中的應用。涉及丹酚酸A在制備抑制腎成纖維細胞和系膜細胞活化的藥物中的應用、在制備降低腎纖維化的藥物中的應用、在制備改善尿蛋白的藥物中的應用、制備改善腎功能的藥物中的應用、在制備減輕腎臟炎癥及膠原沉積的藥物中的應用以及在制備減輕腎臟纖維化指標相關基因和蛋白的藥物中的應用。本發(fā)明設計了以TGF-β1誘導的大鼠腎成纖維細胞和系膜細胞活化的篩選平臺，發(fā)現(xiàn)4.94×10-5g/ml～4.94×10-6g/ml的丹酚酸A可抑制TGF-β1誘導的大鼠腎成纖維細胞和系膜細胞的活化。本發(fā)明還設計了丹酚酸A對UUO模型和Platt模型大鼠作用的體內實驗，發(fā)現(xiàn)丹酚酸A中劑量(10mg/kg/d)及高劑量(17.1mg/kg/d)均能降低UUO模型和Platt模型大鼠的尿蛋白、腎功能以及腎臟纖維化相關基因和蛋白。
文檔編號A61P13/12GK102614164SQ201210083120
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月27日 優(yōu)先權日2012年3月27日
發(fā)明者何立群, 楊雪軍, 林日陽, 王東, 王琛 申請人:上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院