專利名稱：一種腫瘤干細(xì)胞選擇性殺傷劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，涉及ー種腫瘤干細(xì)胞選擇性殺傷劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌(HCC)作為世界上第五大腫瘤，嚴(yán)重危害人類的身體健康。在臨床治療中，現(xiàn) 有的傳統(tǒng)化療藥物在治療早期能夠有效的降低腫瘤的體積，但是在治療后期往往出現(xiàn)腫瘤 的復(fù)發(fā)、腫瘤的多藥耐藥性或是其它嚴(yán)重的藥物毒性或副作用。腫瘤干細(xì)胞(CSCs)被認(rèn)為是腫瘤內(nèi)存在的一小群與腫瘤的生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)密切相關(guān) 的細(xì)胞。它們具有自我更新的能力，對(duì)于現(xiàn)有的傳統(tǒng)化療藥物具有很強(qiáng)的耐藥性。肝癌干 細(xì)胞能夠通過(guò)很多種標(biāo)志物進(jìn)行富集，例如CD 133和EpCAM等。傳統(tǒng)的治療策略不能將腫 瘤干細(xì)胞殺死，存活下來(lái)重新生長(zhǎng)成腫瘤。嚴(yán)重影響了腫瘤的治療效果。秀瘡花[Dicranostigmaleptopodum(Maxmi. )Fedde,DLF]為罌■粟科秀瘡花屬ニ年 生或多年生草本植物，全草有清熱解毒、消腫止痛、殺蟲(chóng)等功效；治扁桃體炎、牙痛、咽喉痛、 淋巴結(jié)核；外用于禿瘡等疾病。禿瘡花生物堿是從禿瘡花中分離提取的有效成分，在臨床觀 察中發(fā)現(xiàn)該生物堿對(duì)淋巴結(jié)核、肺結(jié)核、骨結(jié)核及竇道潰瘍總有效率達(dá)90%以上。目前，該類生物堿未用于抗腫瘤中，尤其是用于選擇性殺傷腫瘤干細(xì)胞的應(yīng)用中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個(gè)目的是提供一種異紫堇定堿或其藥學(xué)上可接受的鹽的在用于制備 治療腫瘤或選擇性殺傷腫干瘤細(xì)胞藥物組合物中的新用途。本發(fā)明的另一目的是提供ー種禿瘡花類生物堿或其藥學(xué)上可接受的鹽的在用于 制備選擇性殺傷腫干瘤細(xì)胞藥物組合物中的新用途。本發(fā)明第一方面提供了一種異紫堇定堿(Isocorydin, I⑶)或其藥學(xué)上可接受的 鹽的用途，用于制備(I)治療腫瘤、抑制腫瘤生長(zhǎng)，或抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物組合物；和/或(2)殺傷腫瘤干細(xì)胞的藥物組合物；和/或(3)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的抑制劑；或抑制腫瘤干細(xì)胞増殖或生長(zhǎng)的抑制 劑；和/或(4)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯的誘導(dǎo)劑。在另ー優(yōu)選例中，所述組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在另ー優(yōu)選例中，所述腫瘤為肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌結(jié)直腸癌、腦膠質(zhì)瘤、或腎 透明細(xì)胞癌。在另ー優(yōu)選例中，所述腫瘤干細(xì)胞為CD133或EpCAM標(biāo)志富集的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，其 中，所述CD133標(biāo)志富集的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞包括CD133+標(biāo)志富集的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞或CD133—標(biāo) 志富集的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞；所述EpCAM標(biāo)志富集的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞包括EpCAM+標(biāo)志富集的陽(yáng)性 腫瘤細(xì)胞或EpCAiT標(biāo)志富集的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、或用作腫瘤細(xì)胞凋亡 誘導(dǎo)劑或促進(jìn)劑。在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯。在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞G2/M期的阻滯。在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤細(xì)胞選自肝細(xì)胞腫瘤、肺癌、胰腺癌、胃癌結(jié)直腸癌、腦 膠質(zhì)瘤、或腎透明細(xì)胞癌的腫瘤細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物具有以下一種或多種特性(bl)上調(diào)選自截?cái)嗟?PARP(cleaved-PARP)、CYP27A1、TNFSRSF10、TNFSRSF9、 Cyclin BI、p-Q)Kl、p_Cdc25C和p-Mytl中的一種或多種分子的表達(dá)水平；(b2)不影響選自p-AKT、p_S6、p_Erkl/2和Cyclin A中的一種或多種分子的表達(dá) 水平；(b3)下調(diào)選自Cdc25C和/或p_MDM2的分子的表達(dá)水平；(b4)抑制復(fù)合物CDKl/Cyclin BI的活性。在另一優(yōu)選例中，上調(diào)Thr-14/Tyr_15-位點(diǎn)的磷酸化CDKl (p-CDKl)。在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物還具有以下一種或多種特性(cl)上調(diào) Chkl (Ser317、Ser345 和 Ser296)和 / 或 Chk2 (Thr68)的表達(dá)水平；(c2)不影響 Chk2 (Ser33/34)和 / 或 Chk2 (Serl9)的表達(dá)水平；(c3)抑制腫瘤細(xì)胞體內(nèi)成瘤。本發(fā)明第二方面提供了一種禿瘡花類生物堿(DLF)或其藥學(xué)上可接受的鹽的用 途，用于制備(i)殺傷腫瘤干細(xì)胞的藥物組合物；和/或(ii)抑制腫瘤干細(xì)胞增殖或生長(zhǎng)的抑制劑。在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤干細(xì)胞為CD133或EpCAM標(biāo)志富集的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，其 中，所述CD133標(biāo)志富集的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞包括CD133+標(biāo)志富集的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞或CD133—標(biāo) 志富集的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞；所述EpCAM標(biāo)志富集的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞包括EpCAM+標(biāo)志富集的陽(yáng)性 腫瘤細(xì)胞或EpCAiT標(biāo)志富集的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述秀瘡花類生物堿為含選自異紫堇定堿(Isocorydin, I⑶)、 原阿片堿、紫堇堿和木蘭堿中的一種或多種成分的禿瘡花類生物堿。在另一優(yōu)選例中，所述禿瘡花類生物堿為異紫堇堿、或含選自異紫堇堿、原阿片 堿、紫堇堿和木蘭堿中的多種成分的禿瘡花類生物堿。在另一優(yōu)選例中，在腫瘤細(xì)胞中，所述藥物組合物具有以下一種或多種特性(al)上調(diào) p-CDKl 和 / 或 Cyclin BI 的表達(dá)；(a2)不影響Cyclin A的表達(dá)；(a3)下調(diào)E2F1的表達(dá)；(a4)抑制復(fù)合物CDKl/Cyclin BI的活性。在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物具有以下一種或多種特性(dl)用于下調(diào)腫瘤細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞的比例；(d2)抑制腫瘤干細(xì)胞的成球能力和克隆形成能力；(d3)抑制腫瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)；
(d4)抑制腫瘤干細(xì)胞成瘤能力。本發(fā)明第三方面提供了一種非治療性的抑制腫瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)的方法， 包括步驟在禿瘡花類生物堿或其藥學(xué)上可接受的鹽存在下，體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞或腫瘤干 細(xì)胞或其混合細(xì)胞，從而抑制所述細(xì)胞的生長(zhǎng)。本發(fā)明第四方面提供了一種治療方法，包括步驟給需要的對(duì)象施用藥學(xué)有效劑 量的禿瘡花類生物堿或其藥學(xué)上可接受的鹽、或含禿瘡花類生物堿或其藥學(xué)上可接受的鹽 的藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述秀瘡花類生物堿為含選自異紫堇定堿(Isocorydin, I⑶)、 原阿片堿、紫堇堿和木蘭堿中的一種或多種成分的禿瘡花類生物堿。在另一優(yōu)選例中，所述禿瘡花類生物堿為異紫堇堿、或含選自異紫堇堿、原阿片 堿、紫堇堿和木蘭堿中的多種成分的禿瘡花類生物堿。在另一優(yōu)選例中，所述的禿瘡花類生物堿為異紫堇定堿。在另一優(yōu)選例中，所述治療方法對(duì)需要治療的對(duì)象達(dá)到以下作用(el)治療腫瘤、抑制腫瘤生長(zhǎng)，或抑制腫瘤細(xì)胞增殖；和/或(e2)殺傷腫瘤干細(xì)胞；和/或(e3)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)；或抑制腫瘤干細(xì)胞增殖或生長(zhǎng)；和/或(e4)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


圖1A顯示了以不同濃度的DLF處理SMMC_7721，Huh7和MHCC-97L細(xì)胞系24h，通 過(guò)MTT試驗(yàn)檢測(cè)DLF對(duì)細(xì)胞增殖的影響。圖1B顯示了以不同濃度的DLF處理SMMC_7721，Huh7和MHCC-97L細(xì)胞系48h，通 過(guò)MTT試驗(yàn)檢測(cè)DLF對(duì)細(xì)胞增殖的影響。圖2顯示了 DLF誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞凋亡；A、B和C圖分別為PBS、3mg/ml和4mg/ml DLF 處理Huh7細(xì)胞系48h。圖3A顯示了 DLF和PBS分別處理Huh7和MHCC-97L細(xì)胞系24h或48h后細(xì)胞周 期分布圖。圖3B顯示了 DLF和PBS處理Huh7細(xì)胞系不同時(shí)間后，細(xì)胞G2/M期比例統(tǒng)計(jì)圖。圖4A顯示了不同濃度的DLF分別處理Huh7細(xì)胞24h后，細(xì)胞周期相關(guān)分子的變 化。圖5顯示了異紫堇定堿對(duì)肝癌細(xì)胞系增殖的影響；不同濃度的ICD處理肝癌細(xì)胞系Huh7、SMMC-7721、PLC/PRF/5和人肝永生化細(xì)胞 系L-02(L02)48h后，MTT試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果。圖6 顯示了 Western blot 檢測(cè) p_AKT, p_S6 或 p-Erkl/2 的表達(dá)情況。圖7A 顯示了 Annexin V/7-AAD 雙標(biāo)法檢測(cè) 0、100、200、300 y g/ml 的 ICD 處理 Huh7
后的凋亡情況。
布圖。
Chk2的激活情況。圖13A顯示了 I⑶和長(zhǎng)春新堿對(duì)PLC/PRF/5⑶133陽(yáng)性細(xì)胞比例的影響。圖13B顯示了 ICD對(duì)Huh7和SNU-182細(xì)胞中EpCAM陽(yáng)性細(xì)胞比例的影響。圖14A顯示了 ICD對(duì)PLC/PRF/5CD133+/_細(xì)胞亞群成球能力的影響。圖14B顯示了 ICD對(duì)PLC/PRF/5CD133+/_細(xì)胞亞群克隆成形能力的影響。圖15A顯示了 ICD處理PLC/PRF/5CD133+細(xì)胞48h的抑制率。圖15B顯示了 ICD處理PLC/PRF/5CD133+細(xì)胞72h的抑制率。圖16顯示了 ICD對(duì)于PLC/PRF/5CD133+細(xì)胞體內(nèi)成瘤的影響。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人通過(guò)長(zhǎng)期而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)，禿瘡花類生物堿或其藥學(xué)上可接 受的鹽可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期(尤其是G2/M周期)阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，而 對(duì)非腫瘤細(xì)胞的幾乎完全沒(méi)有毒性；其還可以顯著降低腫瘤細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞的比例，從 而降低腫瘤干細(xì)胞引起的藥物耐受性，非常適合用于制備治療腫瘤的藥物。在此基礎(chǔ)上，發(fā) 明人完成了本發(fā)明。本發(fā)明所用“異紫堇堿”、“異紫堇定堿”、“isOCOrydine”、“ICD”可互換使用。本發(fā)明所用“禿瘡花類生物堿”、“DLF”可互換使用。本發(fā)明所用“Chkl(Ser317、Ser345 和 Ser296)，，表示 ChKl 蛋白 Ser317、Ser345 或 Ser296位絲氨酸磷酸化的構(gòu)型特異性抗體；“Chk2 (Thr68) ”表示Chk2蛋白Thr68位蘇氨酸 磷酸化的構(gòu)型特異性抗體；Chk2 (Ser33/34)表示Chk2蛋白Ser33/Ser34位絲氨酸共同磷 酸化的構(gòu)型特異性抗體；Chk2(Serl9)表示Chk2蛋白Serl9位絲氨酸磷酸化的構(gòu)型特異性 抗體。藥物組合物活性成分如本文所用，術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明化合物”指禿瘡花類生物堿或其藥學(xué)上可接受的鹽或異 紫堇定堿(Isocorydin, I⑶)或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中，所述秀瘡花類生物堿的主要成 分包括異紫堇堿、原阿片堿、紫堇堿、和木蘭堿，本發(fā)明所述禿瘡花類生物堿優(yōu)選為異紫堇 定堿、或上述各種主要成分的組合。圖7B顯不了 Western blot檢測(cè)cleaved-PARP的表達(dá)水平。
圖7C顯示了 Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的變化情況。
圖8顯示了異紫堇定堿對(duì)裸鼠體重的影響。
圖9顯示了異紫堇定堿對(duì)Huh7、SMMC-7721體內(nèi)成瘤的影響。
圖10A顯示了分別以0、200、300、400ii g/mlICD處理Huh7細(xì)胞18h后，其周期分
圖10B顯示了圖10A中G1、S和G2期比例統(tǒng)計(jì)圖。
圖11A顯示了 I⑶處理Huh7細(xì)胞后相關(guān)分子變化情況。
圖11B顯示了 I⑶處理SMMC-7721和PLC/PRF/5細(xì)胞后相關(guān)分子的變化情況。
圖12A顯示了 Western blot檢測(cè)ICD對(duì)Huh7細(xì)胞中Chkl和Chk2的激活情況。 圖 12B 顯示了 Western blot 檢測(cè) ICD 對(duì) SMMC-7721 和 PLC/PRF/5 細(xì)胞中 Chkl 和
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”指本發(fā)明化合物與酸或堿所形成的適合用 作藥物的鹽，包括無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)鹽。一類優(yōu)選的鹽是本發(fā)明化合物與酸形成的鹽。適合形 成鹽的酸包括但并不限于鹽酸、氫溴酸、磷酸等無(wú)機(jī)酸，草酸、丙ニ酸、琥珀酸、富馬酸、馬 來(lái)酸、乳酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、檸檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有機(jī)酸；以及天冬 氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。藥物組合物和施用方法本發(fā)明化合物或含有本發(fā)明化合物為主要活性成分的藥物組合物可用于治療、預(yù) 防以及緩解由腫瘤細(xì)胞(尤其是腫瘤干細(xì)胞)介導(dǎo)的疾病，例如但不限于癌癥。本發(fā)明的藥物組合物包含安全有效量范圍內(nèi)的本發(fā)明化合物或其藥理上可接受 的鹽及藥理上可以接受的賦形劑或載體。其中“安全有效量”指的是化合物的量足以明顯 改善病情，而不至于產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。通常，藥物組合物含有l(wèi)_2000mg本發(fā)明化合物/ 齊U，更佳地，含有10-200mg本發(fā)明化合物/劑。較佳地，所述的“一劑”為一個(gè)膠囊或藥片?！八帉W(xué)上可以接受的載體”應(yīng)能和本發(fā)明的化合物以及它們之間相互摻和，而不明 顯降低化合物的藥效，且適合于人使用，必須有足夠的純度和足夠低的毒性。藥學(xué)上可以接 受的載體部分例子有纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉等)、明膠、滑石、固體潤(rùn)滑劑 (如硬脂酸、硬脂酸鎂)、硫酸鈣、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等)、多元醇(如 丙ニ醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化劑(如吐溫 )、潤(rùn)濕劑(如十二烷基硫酸鈉)、著色 齊U、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、防腐剤、無(wú)熱原水等。本發(fā)明化合物或藥物組合物的施用方式?jīng)]有特別限制，代表性的施用方式包括 (但并不限于)ロ服、瘤內(nèi)、直腸、腸胃外(靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下)、和局部給藥。用于ロ服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸剤、散劑和顆粒劑。在這些固體劑 型中，活性化合物與至少ー種常規(guī)惰性賦形劑(或載體)混合，如檸檬酸鈉或磷酸ニ鈣，或 與下述成分混合(a)填料或增容劑，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b) 粘合劑，例如，羥甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚こ烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠；(C)保濕 齊U，例如，甘油；(d)崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些復(fù)合硅 酸鹽、和碳酸鈉；(e)緩溶劑，例如石蠟；(f)吸收加速劑，例如，季胺化合物；(g)潤(rùn)濕劑，例 如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酷；(h)吸附劑，例如，高嶺土 ；和(i)潤(rùn)滑劑，例如，滑石、硬脂酸 鈣、硬脂酸鎂、固體聚こニ醇、十二烷基硫酸鈉，或其混合物。膠囊劑、片劑和丸劑中，劑型也 可包含緩沖劑。固體劑型如片劑、糖丸、膠囊劑、丸劑和顆粒劑可采用包衣和殼材制備，如腸衣和 其它本領(lǐng)域公知的材料。它們可包含不透明劑，并且，這種組合物中活性化合物或化合物的 釋放可以延遲的方式在消化道內(nèi)的某一部分中釋放?？刹捎玫陌窠M分的實(shí)例是聚合物質(zhì) 和蠟類物質(zhì)。必要吋，活性化合物也可與上述賦形劑中的ー種或多種形成微膠囊形式。用于ロ服給藥的液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿或酊劑。 除了活性化合物外，液體劑型可包含本領(lǐng)域中常規(guī)采用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，增 溶劑和乳化劑，例知，こ醇、異丙醇、碳酸こ酷、こ酸こ酷、丙ニ醇、1，3-丁ニ醇、ニ甲基甲酰 胺以及油，特別是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油或這些物質(zhì)的混合物等。除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包含助劑，如潤(rùn)濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味齊U、嬌味劑和香料。除了活性化合物外，懸浮液可包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯 山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、甲醇鋁和瓊脂或這些物質(zhì)的混合物等。用于腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無(wú)菌含水或無(wú)水溶液、分散液、 懸浮液或乳液，和用于重新溶解成無(wú)菌的可注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末。適宜的含水和 非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、多元醇及其適宜的混合物。用于局部給藥的本發(fā)明化合物的劑型包括軟膏劑、散劑、貼劑、噴射劑和吸入劑。 活性成分在無(wú)菌條件下與生理上可接受的載體及任何防腐劑、緩沖劑，或必要時(shí)可能需要 的推進(jìn)劑一起混合。本發(fā)明化合物可以單獨(dú)給藥，或者與其他藥學(xué)上可接受的化合物聯(lián)合給藥。使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的本發(fā)明化合物適用于需要治療的哺乳動(dòng)物 (如人)，其中施用時(shí)劑量為藥學(xué)上認(rèn)為的有效給藥劑量，對(duì)于60kg體重的人而言，日給藥 劑量通常為1 2000mg，優(yōu)選20 500mg。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀 況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明主要優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明提供了一種異紫堇堿或其藥學(xué)上可接受的鹽新用途1. 1可用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期(尤其是G2/M周期)阻滯，抑制腫瘤細(xì) 胞增殖，而對(duì)非腫瘤細(xì)胞的幾乎完全沒(méi)有毒性。1. 2還可用于顯著降低腫瘤細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞的比例，降低腫瘤干細(xì)胞的成球能 力和克隆成形能力，抑制腫瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)，以及抑制腫瘤干細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。2.本發(fā)明提供了一種禿瘡花類生物堿或其藥學(xué)上可接受的鹽新用途用于顯著 降低腫瘤細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞的比例，降低腫瘤干細(xì)胞的成球能力和克隆成形能力，抑制腫 瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)，以及抑制腫瘤干細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。下面結(jié)合具體實(shí)施，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件， 例如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。實(shí)施例1材料和儀器1.1細(xì)胞系人肝癌細(xì)胞系Huh7，細(xì)胞編號(hào)為RCB1366，購(gòu)自日本生物資源中心細(xì)胞庫(kù)(Riken BRC Cell Bank)；人肝癌細(xì)胞系MHCC-97L，購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所；人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721，購(gòu)自中科院上海生化細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)；人肝癌細(xì)胞系PLC/PFR/5，購(gòu)自 ATCC，ATCC 序列號(hào) CRL-8024 ；人肝癌細(xì)胞系SNU-182，購(gòu)自ATCC，ATCC序列號(hào)為CRL-2235 ；永生化的肝細(xì)胞系L-02，購(gòu)自中科院上海生化細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)。1.2主要試劑
秀瘡花生物減(DicranostigmaLeptopodum(Maxim) Fedde、DLF)委托天水師范大 學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院用常規(guī)方法制備；異紫堇定堿(Isocorydine、I⑶)購(gòu)自上海展舒化學(xué)科技有限公司。1.3主要儀器微型垂直電泳槽(Bio-Rad)Mini Trans-Blot 微型電泳轉(zhuǎn)移槽 (Bio-Rad)C02 恒溫培養(yǎng)箱(REVC0 Scientific)PE160 型電子天平(Mettler)Epics Altra 流式細(xì)胞儀(Beckman coulter)低溫高速離心機(jī)(Thermo Sorvall)酶標(biāo)儀(Thermo scientific)細(xì)胞培養(yǎng)器皿為BD Biosciences公司的Falcon 聚苯乙烯材質(zhì)平皿和多孔培養(yǎng) 板。1.4培養(yǎng)基及常用溶液1. 4. 1DMEM 培養(yǎng)基；1.4. 2MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide ；Thiazolyl blue)購(gòu)于 sigma 公司；MTT 5mg/ml (PBS) 10 X 儲(chǔ)存液；1. 4. 3 細(xì)胞周期分析Triton X-100，RNA 酶 pi 購(gòu)于 Sigma-Aldrich 公司；1. 4. 4Annexin V/7-AAD 檢測(cè)凋亡7-amino_actionmycin D (7-AAD) (BD Biosciences)1. 4. 5蛋白電泳及免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot, WB)30%丙烯酰胺29% (W/V)丙烯酰胺，1% (W/V)N，N_亞甲雙丙烯酰胺；電泳緩沖液25mMTris-HCl(pH7. 5)，250mM 甘氨酸，0.1 % SDS， 1. OMTris-HCl (pH6. 8)，1. 5M Tris-HCl (pH8. 8)，10% (W/V)過(guò)硫酸銨；封閉液PBS配制的5%脫脂奶粉溶液；丙烯酰胺凝膠配方
權(quán)利要求
1.一種異紫堇定堿或其藥學(xué)上可接受的鹽的用途，其特征在于，用于制備 (1)治療腫瘤、抑制腫瘤生長(zhǎng)，或抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物組合物；和/或 (2)殺傷腫瘤干細(xì)胞的藥物組合物；和/或 (3)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的抑制劑；或抑制腫瘤干細(xì)胞增殖或生長(zhǎng)的抑制劑；和/或 (4)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯的誘導(dǎo)劑。
2.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、或用作腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑或促進(jìn)劑。
3.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯。
4.如權(quán)利要求I或5所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞G2/M期的阻滯。
5.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物具有以下一種或多種特性 (bl)上調(diào)選自截?cái)嗟?PARP、CYP27A1、TNFSRSF10、TNFSRSF9、Cyclin BI、p-CDKl、p-Cdc25C和p-Mytl中的一種或多種分子的表達(dá)水平； (b2)不影響選自p-AKT、p-S6、p-Erkl/2和Cyclin A中的一種或多種分子的表達(dá)水平； (b3)下調(diào)選自Cdc25C和/或p-MDM2的分子的表達(dá)水平； (b4)抑制復(fù)合物CDKl/Cyclin BI的活性。
6.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物還具有以下一種或多種特性 (cl)上調(diào) Chkl (Ser317、Ser345 和 Ser296)和 / 或 Chk2 (Thr68)的表達(dá)水平； (c2)不影響 Chk2 (Ser33/34)和 / 或 Chk2(Serl9)的表達(dá)水平； (c3)抑制腫瘤細(xì)胞體內(nèi)成瘤。
7.一種禿瘡花類生物堿或其藥學(xué)上可接受的鹽的用途，其特征在于，用于制備 (i)殺傷腫瘤干細(xì)胞的藥物組合物；和/或 ( )抑制腫瘤干細(xì)胞增殖或生長(zhǎng)的抑制劑。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述禿瘡花類生物堿為含選自異紫堇定堿、原阿片堿、紫堇堿和木蘭堿中的一種或多種成分的禿瘡花類生物堿。
9.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，在腫瘤細(xì)胞中，所述藥物組合物具有以下一種或多種特性 (al)上調(diào)p-CDKl和/或Cyclin B I的表達(dá)； (a2)不影響Cyclin A的表達(dá)； (a3)下調(diào)E2F1的表達(dá)； (a4)抑制復(fù)合物CDKl/Cyclin BI的活性。
10.如權(quán)利要求I或7所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物具有以下一種或多種特性 (dl)用于下調(diào)腫瘤細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞的比例； (d2)抑制腫瘤干細(xì)胞的成球能力和克隆形成能力；(d3)抑制腫瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)； (d4)抑制腫瘤干細(xì)胞成瘤能力。
11.一種非治療性的抑制腫瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其特征在于，包括步驟在禿瘡花類生物堿或其藥學(xué)上可接受的鹽存在下，體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞或其混合細(xì)胞，從而抑制所述細(xì)胞的生長(zhǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腫瘤干細(xì)胞選擇性殺傷劑及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明公開(kāi)了一種禿瘡花類生物堿(DLF)的單體成分異紫堇堿(Isocorydin，ICD)或其藥學(xué)上可接受的鹽的用途，用于制備治療腫瘤的藥物組合物。所述組合物可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，或選擇性殺傷腫瘤干細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102657653SQ20121008715
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者孫荷芬, 李錦軍 申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所