專利名稱：微型核糖核酸作為癌癥進(jìn)展的預(yù)測(cè)因子及其治療癌癥的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于微型核糖核酸(HiiciX)RNA)作為癌癥進(jìn)展的預(yù)測(cè)因子及其治療癌癥的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)、第IV級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤為惡性度最高的主要腦部腫瘤，且具有相當(dāng)不良的預(yù)后；盡管結(jié)合多種療法，其平均存活年數(shù)仍約為 12 個(gè)月(Dehdashti, A. R.，Hegi, Μ. E.，Regli, L.，Pica, A.，and Stupp, R. 2006.Neurosurg Focus 20，E6. ；Stupp, R.，Hegi, Μ. E.，Gilbert，M. R.，and Chakravarti,A. 2007. J Clin Oncol 25，4127-4136.)。為了提高病患的存活，故需要了解GBM的腫瘤形成機(jī)制。部分研究指出癌干細(xì)胞(cancer stem cell, CSC)的亞細(xì)胞群是使癌細(xì)胞具抗放 射線性的一個(gè)主要因素，并且也與腫瘤發(fā)展，以及經(jīng)傳統(tǒng)療法后的癌癥周期性復(fù)發(fā)有關(guān)系。然而，迄今仍無(wú)適當(dāng)?shù)闹笜?biāo)(marker)可用以分離癌細(xì)胞的該等重要的亞細(xì)胞群，根據(jù)CSC的腫瘤形成假說，該等亞細(xì)胞群在活體內(nèi)(in vivo)具有重新形成新腫瘤的能力，且與腫瘤復(fù)發(fā)為惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤有關(guān)系。微型核糖核酸(miRNAs)為高度保守的小型RNA分子，其可調(diào)控基因表達(dá)-可做為癌癥的標(biāo)記、致癌基因或腫瘤抑制劑。miRNAs可能可標(biāo)靶致癌基因、細(xì)胞周期調(diào)控子及轉(zhuǎn)錄因子，并且可調(diào)控腦部腫瘤的發(fā)展。在腦部腫瘤中，多種miRNAs，包括miR7、miR21、miR26a、miR124、miR137、miR184、及 miRNA 221/222 與 GBM 致病機(jī)理有關(guān)連。多種 miRNAs可能可作為預(yù)后的指標(biāo)，像是miRlOb及miR26a可為高度的神經(jīng)膠質(zhì)瘤作為預(yù)后的指標(biāo)。miRNAs涉及腦部腫瘤發(fā)展的許多方面，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性化發(fā)展。miR125b、miR326、及miR324-5p可于小腦神經(jīng)性前驅(qū)物及腫瘤中作為標(biāo)記型miRNAs,其有助于預(yù)測(cè)預(yù)后及病患癥狀。再者，過量表達(dá)miR34可降低腦部腫瘤及胰臟癌干細(xì)胞(CSCs)的自我更新能力。近來(lái)，miR145被發(fā)現(xiàn)可調(diào)控胚胎干細(xì)胞的分化；該單一的miRNA同時(shí)地可調(diào)控多種干細(xì)胞性基因，包括 KLF4、0ct4、及 Sox2(Xu, N. , Papagiannakopoulos, T. , Pan, G. , Thomson, J. A.,and Kosik，K. S. 2009. Celll37，647-658.)。然而，目前對(duì)于GBM的復(fù)發(fā)，以及藉由調(diào)控干細(xì)胞性(sternness)以調(diào)控二次的GBM復(fù)發(fā)、腫瘤誘發(fā)能力、或間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，miRNAs是否在其中扮演該等角色皆尚未明了。miR142是首個(gè)被報(bào)告具有可用于調(diào)控造血作用及T細(xì)胞發(fā)育的功能的基因(Chen, C. Z. , Li, L. , Lodish, H. F. , and Bartel, D. P. 2004. Science 303,83-86·)。miR142-3p的表達(dá)是藉由LM02結(jié)合至miR142基因的推測(cè)的啟動(dòng)子區(qū)域而調(diào)控(Yuan，ff. , Sun, ff. , Yang, S. , Du, J. , Zhai, C. L. , Wang, Z. Q. , Zhang, J. , and Zhu, T. H. 2008.Leukemia 22，1067-1071.)。該miR142基因位于t (8 ;17)易位交界處，可能與惰性淋巴瘤發(fā)展為急性的B細(xì)胞淋巴瘤有關(guān)，這可能歸因于c-Myc高度地向上調(diào)控。Qian等人(2008)發(fā)現(xiàn)于老鼠肺臟的支氣管肺泡干細(xì)胞(bronchioalveolar stem cell, BASCs)的miR142-3p及miR142_5p是向上調(diào)控的；異常的miR142表達(dá)可能與將BASCs轉(zhuǎn)變?yōu)榉伟└杉?xì)胞有關(guān)。近來(lái)，Sun 等人(Sun, ff.，Shen.，ff.，Yang, S.，Hu, F.，Li, H.，and Zhu,T. Η. 2010. Cell Res 20,1158-1169.)指出miR-142可用于弱化造血細(xì)胞的增生作用，是藉由miR-223-CEBP- β -LM02軸調(diào)控。分離自神經(jīng)膠質(zhì)瘤或GBM之CSCs具有提高表達(dá)的干細(xì)胞性基因，該基因像是 Sox2 (Gangemi, R. M. , Griffero, F. , Marubbi, D. , Perera, Μ. , Capra,Μ. C. , Malatesta, P. , Ravetti, G. L. , Zona, G. L. , Daga, A. , and Corte, G. 2009. Stem Cells27,40-48.)。Sox2為高移動(dòng)性群組的DNA結(jié)合蛋白，為神經(jīng)干細(xì)胞的重要指標(biāo)，并且對(duì)維持該神經(jīng)干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)十分重要。相同地，推測(cè)Sox2的表達(dá)可作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤及神經(jīng)管胚細(xì)胞瘤，以及維持CSC 干細(xì)胞性的指標(biāo)。重要的是，神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞具有高度的Sox2表達(dá),且將Sox-2剔弱(knockdown)可進(jìn)一步抑制致腫瘤性及神經(jīng)膠質(zhì)瘤CSCs 的干細(xì)胞性(Decarvalho, A. C.，Nelson, K.，Lemke, N.，Lehman, N. L.，Arbab, A. S.，Kalkanis, S. , and Mikkelsen, T. Stem Cells 28,181-190.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)miR142-3p的新穎功能,其新穎功能在于miR142_3p可調(diào)控Sox2、腺苷酸環(huán)化酶9 (adenylyl cyclase 9, AC9)、及CD133的表達(dá)，以及進(jìn)而調(diào)控復(fù)發(fā)性的GBM細(xì)胞及CSCs細(xì)胞之整體干細(xì)胞性，且在復(fù)發(fā)性GBM細(xì)胞中，該miR142_3p可調(diào)節(jié)其腫瘤誘發(fā)特性。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種以微型核糖核酸(miRNA)為主的新穎療法，可用以治療腦瘤。因此，在一方面，本發(fā)明提供一種利用有效量的miR142_3p制備抑制細(xì)胞中目標(biāo)基因表達(dá)的醫(yī)藥制劑的應(yīng)用，其中該目標(biāo)基因?yàn)棰?33、S0X2、或AC9。在一具體實(shí)施例中，該miR142-3p直接與目標(biāo)基因的mRNA的3’端非轉(zhuǎn)譯區(qū)(3，UTR)連結(jié)。在另一具體實(shí)施例中，該細(xì)胞為復(fù)發(fā)性多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)個(gè)體在治療后是否具有或具有發(fā)展為復(fù)發(fā)性多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的風(fēng)險(xiǎn)的套組，其包含miR142-3p反義寡核苷酸及可檢測(cè)樣本中miR142-3p表達(dá)量的試劑。在某些具體實(shí)施例中，該可檢測(cè)一樣本中miR142_3p表達(dá)量的試劑為聚合酶鏈鎖反應(yīng)(PCR)、突光原位雜交反應(yīng)、或薄膜上的Northern blot中所使用的反應(yīng)緩沖液及酵素。在另一具體實(shí)施例中，該套組可用于檢測(cè)下列組織樣本的miR142-3p的表達(dá)水平(a)患有原發(fā)性GBM的個(gè)體的對(duì)照組樣本；及(b)經(jīng)治療后，該相同個(gè)體的試驗(yàn)組樣本，其中(b)試驗(yàn)組樣本中miR142-3p的水平低于(a)對(duì)照組樣本中miR142_3p的水平，代表經(jīng)治療后，該個(gè)體具有或具有發(fā)展為復(fù)發(fā)性多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的風(fēng)險(xiǎn)。在一具體實(shí)施例中，該個(gè)體接受之治療為外科手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射性治療、或其組合。在另一具體實(shí)施例中，該個(gè)體為患有第I、II、III、或IV級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的病患。在另一方面中，本發(fā)明提供一種利用醫(yī)藥上有效量的miR142_3p制備治療多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的醫(yī)藥制劑的應(yīng)用。該醫(yī)藥制劑可藉由立體定位裝置以投放至腫瘤所在位置。該多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤可為復(fù)發(fā)性多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。該miR142-3p可為具有經(jīng)LNA-及硫代磷酸酯-修飾骨架修飾的微型核糖核酸(microRNA)，其中該修飾的微型核糖核酸可被包埋于微脂體中。在一具體實(shí)施例中，本文所用之miR142_3p由核酸所編碼。該核酸是位于載體上，其中該載體是選自由質(zhì)體、黏質(zhì)體、噬菌質(zhì)體、及病毒所組成之群組。在另一方面中，本發(fā)明提供一種用以產(chǎn)生多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模式動(dòng)物的方法，包含(a)準(zhǔn)備原發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞；(b)將miR142-3p反義寡核苷酸導(dǎo)入該原發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，以得到miR142_3p缺失的細(xì)胞；(c)將該miR142-3p缺失的細(xì)胞植入動(dòng)物中，以得到患有多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞 瘤的動(dòng)物。在另一方面中，本發(fā)明提供一種利用miR142_3p制備用以增加多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)于放射性療法敏感性的醫(yī)藥制劑的應(yīng)用。


為了闡述本發(fā)明的目的，將具體實(shí)施例以優(yōu)選方式呈現(xiàn)于圖中。但是，本發(fā)明并非局限于所展示的優(yōu)選具體實(shí)施例。在圖中圖I顯示miR142_3p作為復(fù)發(fā)性GBM指標(biāo)之一反向的預(yù)測(cè)因子。圖2顯示低量miR142_3p以及高量Sox2及AC9表達(dá)水平的情況，其為復(fù)發(fā)性GBM及低總存活率的預(yù)測(cè)指標(biāo)。圖3 顯示 miR-142-3p 直接標(biāo)靶 GBM 細(xì)胞中的 Sox2、ADCY9、及 CD1333' UTRs 區(qū)域。圖4顯示miR142_3p弱化GBM細(xì)胞的自我新生能力及致腫瘤性。圖5顯示miR142-3p SPONGE恢復(fù)原發(fā)性GBM細(xì)胞的干細(xì)胞性及腫瘤誘發(fā)能力。圖6顯示miR142_3p及Sox2/AC9表達(dá)可調(diào)控GBM的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化以及原神經(jīng)(proneuronal)轉(zhuǎn)變。圖7顯示miR142-3p、SoX2及AC9調(diào)控GBM細(xì)胞的腫瘤誘發(fā)能力及放射線敏感性。圖8顯示miR142_3p調(diào)控復(fù)發(fā)性GBM細(xì)胞的致腫瘤性及放射線的敏感性。圖9A和圖9B顯示對(duì)于原發(fā)性(N=70)及復(fù)發(fā)性(N=30)GBM病患的22個(gè)miRNAs表達(dá)量的定量 RT-PCR 分析，包括在復(fù)發(fā)性 GBM 中 miR223、miR451、miR181a、miR9、miR142-3p、miR195、miR145、miR181c、miR132、及 miR497 的下降的表達(dá)量，其中以 miR142_3p 的 p 值(P=O. 0016)，于原發(fā)性(第一次發(fā)生)及復(fù)發(fā)性(第二次發(fā)生)GBM之間，最為顯著(此處數(shù)據(jù)顯示三次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值土SD的結(jié)果)。圖10 顯示將 Sox2 (A)、AC9 (B)、及 CD 133 (C)的野生型(wild-type, WT)或突變的(mutated，mut) 3’ UTR報(bào)信子，與(或不與)對(duì)miR142_3p反義的miRNA及SPONGE —起共同轉(zhuǎn)染，其中測(cè)量每一個(gè)報(bào)信子質(zhì)體的熒光酵素(Iuciferase)活性，其顯示無(wú)論是突變的3’ UTR、反義的 miR142-3p、或 SP0NGE-miR142-3p 皆可消除 miR142_3p 對(duì)于 Sox2、AC9、及CD1333’ UTR 的抑制作用(*p < O. 05)。圖11顯示Sox2及AC9在GBM細(xì)胞的致腫瘤性的探討。(A、B、C、D)建立pGBM/pLV、pGMB/Sox2、pGBM/AC9、rGBM/shScr、rGBM/shSox2、及 rGBM/shAC9 細(xì)胞株，并將之進(jìn)行軟瓊脂細(xì)胞聚落形成試驗(yàn)(A、B)及聚球形成試驗(yàn)(C、D) ；(E)過量表達(dá)的Sox2或AC9可增加pGBM的非貼附性及自我更新的能力，而Sox2或AC9的剔弱則會(huì)減少該rGBM的兩種能力；該 rGBM/miR142-3p 細(xì)胞進(jìn)一步被用以生成 rGBM/miR142_3p/shSox2+shAC9 及 rGBM/miR142-3p/Sox2+AC9細(xì)胞株；并藉由Western blot法分析Sox2及AC9的蛋白量；(F)測(cè)量異種移植的腫瘤大小，其中該異種移植腫瘤是源自植入所指細(xì)胞的老鼠。Sox2/AC9共同過量表達(dá)會(huì)增加rGBM/miR142-3p腫瘤的大小(*p < O. 05)。圖12顯示CD133于GBM細(xì)胞中的致腫瘤性的研究(A)pGBM/⑶133細(xì)胞株是自病患GBMl及GBM2的細(xì)胞衍生而得；并藉由Western blot法評(píng)估于每個(gè)細(xì)胞株之⑶133蛋白表達(dá)量；(B、C、D)將pGBM/⑶133、rGBM/sh⑶133及其對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行軟瓊脂聚落形成試驗(yàn)(B)、聚球試驗(yàn)(C)及細(xì)胞侵襲 / 轉(zhuǎn)移試驗(yàn)(TransWell invat ion/migration) (D) ;Q)133的存在與否對(duì)于兩種pGBM細(xì)胞株的非貼附性、自我更新以及侵襲/轉(zhuǎn)移能力僅有輕微的影 響；(E)評(píng)估經(jīng)異種移植rGBM/shScr及rGBM/sh⑶133的NOD-SCID小鼠的腦紋狀體中腫瘤生長(zhǎng)及體積。經(jīng)觀察無(wú)顯著差異；以及(F)經(jīng)植入所指細(xì)胞的NOD-SCID小鼠的腫瘤體積，于移植后28天測(cè)量；其中在rGBM/shScr與rGBM/shCD133腫瘤之間，以及在pGBM/pLV與pGBM/tD133腫瘤之間，皆無(wú)顯著差異。圖13顯示自7個(gè)GBM病患分離之癌類干細(xì)胞的miR142_3p表達(dá)情形⑷左圖兩個(gè)個(gè)別的GBM細(xì)胞株(GBM1及GBM2)的球形體的顯微鏡影像，其中右圖顯示7個(gè)病患的球形體形成GBMs中的miR142-3p表達(dá)量是降低的；(B)左圖miR142_3p的內(nèi)源性表達(dá)，是藉由 FISH(突光原位雜交(fluorescent in situ hybridization);箭頭代表 miR142_3p有表達(dá)；GBM1)測(cè)量。右圖在7個(gè)病患組中，相較于⑶133-GBM細(xì)胞，結(jié)果顯示⑶133陽(yáng)性(⑶133+)GBM細(xì)胞的miR142-3p表達(dá)為向下調(diào)控的；(C)左圖將GBM細(xì)胞的側(cè)群細(xì)胞(Sidepopulations)分離，并藉由細(xì)胞分類器(GBMl)分離。右圖7個(gè)病患中側(cè)群細(xì)胞(SP)為陽(yáng)性的GBM細(xì)胞的降低的miR-142-3p表達(dá)。*p < 0. 05。圖14顯示胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ESCs)及GBMs中轉(zhuǎn)錄體圖譜的生物信息分析結(jié)果該多維度分析說明了于ESCs、rGBM、具有miR142-3p的rGBM、pGBM、及具有miR142_3p SPONGE 的 pGBM 之間的平均譜是轉(zhuǎn)錄體距離(average lineage transcriptomedistance)。圖15顯示分離自5個(gè)病患之pGBM細(xì)胞經(jīng)具有SPONGE的miR142_3p剔弱方法處理后的腫瘤誘發(fā)能力的評(píng)估；以及分別將50、100、1000、及10000的細(xì)胞數(shù)量同位(orthotopically)注射入所指的SCID小鼠的腦紋狀體中；miR142_3p SPONGE的腫瘤誘發(fā)能力，于PGBM細(xì)胞中藉由Sox2/AC9雙重基因靜默被進(jìn)一步弱化。圖16顯示Sox2及AC9涉及miR142_3p所調(diào)控的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化⑷將、pzGBM/Spg、pGBM/Spg/shSox2+shAC9、rGBM/pLV、rGBM/miR142_3p、及 rGBM/miR142_3p/Sox2+AC9細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR,分析間充質(zhì)傾向的標(biāo)記(YKL40、波形蛋白(vementin)、纖維粘連蛋白(fibronectin))的表達(dá)情形；(B)傷口愈合移動(dòng)試驗(yàn)是以所指細(xì)胞進(jìn)行；(C)計(jì)算不同組的移動(dòng)活性，并以相對(duì)值呈現(xiàn)于表中;* p < 0. 05, PLV v. s. pLV-miR142/Vector ；# p< O. 05, pLV-miR142/Vector v. s. pLV_miR142/Sox2+AC9。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合各種具體實(shí)施例及申請(qǐng)專利范圍的詳細(xì)說明及圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，以使屬于本發(fā)明領(lǐng)域的具有通常知識(shí)者，可基于本文的敘述，并且不需進(jìn)一步闡述，即可實(shí)施本發(fā)明，并將其應(yīng)用至最寬廣的范圍，而非用以限制本發(fā)明。神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)為最常見的主要的腦部腫瘤，且其預(yù)后通常不佳。此外，在多數(shù)病患中，經(jīng)放射化療后會(huì)在數(shù)月內(nèi)復(fù)發(fā)。在本發(fā)明中，在復(fù)發(fā)性GBM的miR142-3p表達(dá)量較原發(fā)性GBM低，且具有同時(shí)表達(dá)(co-expression)的Sox2和AC9以及被抑制的miR142-3p之GBM病患會(huì)導(dǎo)致較差的預(yù)后及存活率。藉由標(biāo)靶Sox2及AC9，MiR142_3p可調(diào)控復(fù)發(fā)性GBM的腫瘤誘發(fā)能力及間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。在復(fù)發(fā)性GBM中增加的miR142-3p可降低 致腫瘤性、間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及抗放射線性；當(dāng)在原發(fā)性GBM中miR142-3p為向下調(diào)控時(shí)，則會(huì)促進(jìn)腫瘤誘發(fā)、抗放射線性及間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，此點(diǎn)可能可用于GBM病患之病癥發(fā)展及復(fù)發(fā)的指標(biāo)。因此，miR142-3p可能涉及CSC重新程序設(shè)計(jì)改造(reprogramming)的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，以及涉及于腦部腫瘤中調(diào)控間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。更重要地，LNA-修飾的miR142-3p寡核苷酸可有效地阻斷復(fù)發(fā)性GBM所衍生的原位異種移植物的腫瘤的生長(zhǎng)以及間充質(zhì)轉(zhuǎn)化特性，以及可協(xié)同增強(qiáng)放射療法的功效。本發(fā)明為第一個(gè)發(fā)現(xiàn)及證明miR142-3p可作為癌癥類干細(xì)胞特性(cancer stem-1 ikeproperty)及GBM復(fù)發(fā)的一重要調(diào)控因子，并且該miR142_3p可能為一具潛力的臨床預(yù)后指標(biāo)，以及一種新穎的以miRNA為基礎(chǔ)的GBM療法。對(duì)于miRNAs用于致腫瘤性的應(yīng)用日趨被重視，越來(lái)越多的證據(jù)指出miRNAs涉及類CSC特性。例如，異位表達(dá)let-7、miR200c、及miR30可抑制乳房的CSCs的致腫瘤性(Shimono, Y. ，Zabala, M. ，Cho, R. ff. ，Lobo, N. ，Dalerba, P. ，Qian, D. ，Diehn, M. ，Liu,H. , Panula, S. P. , Chiao, E. , et al. 2009. Cell 138, 592-603. ；Yu, F. , Deng, H. , Yao,H. , Liu, Q. , Su, F. , and Song, E. 2010. Oncogene 29,4194-4204.)。近來(lái)，Iliopoulos 及其同僚報(bào)告miR200b可透過直接標(biāo)靶Suzl2以調(diào)控CSC特性，該Suzl2為一多齒梳抑制子復(fù)合物(polycomb repressor complex)的次單位(Iliopoulos, D. , Lindahl-Alien,Μ. , Polytarchou, C. , Hirsch, H. A. , Tsichlis, P. N. , and Struhl, K. 2010. Mol Cell 39，761-772.) ο在本發(fā)明中，miR142-3p可直接標(biāo)靶Sox2、AC9、及CD1333' UTRs，以及藉由抑制復(fù)發(fā)性GBM細(xì)胞的Sox2及AC9表達(dá)來(lái)壓抑其干細(xì)胞性及致腫瘤性。更重要地，將miR142-3p表達(dá)剔弱，可明顯地活化GBM-CSC自我更新能力，以及抑制多能性基因的表達(dá)。再者，本人證實(shí)SP0NGE-miR142-3p可在活體內(nèi)(in vivo)增加原發(fā)性GBM的腫瘤誘發(fā)能力約10至10000倍(圖5H及圖15)。此證據(jù)支持了于GBM中向下調(diào)控miR142_3p表達(dá)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致類干細(xì)胞特性，此即給予GBM細(xì)胞誘發(fā)及重新生成新腫瘤的能力。再者，已知Sox2于調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的腫瘤誘發(fā)能力上扮演一重要角色。過量表達(dá)Sox2會(huì)促進(jìn)神經(jīng)管胚細(xì)胞瘤腫瘤誘發(fā)細(xì)胞生成，以及與神經(jīng)管胚細(xì)胞瘤病患存活率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性(Sutter，R.，Shakhova, 0. , Bhagat, H. ,Behesti, H. , Sutter,C. ,Penkar, S. ,Santuccione, A. ,Bernays,R.，Heppner, F. L.，Schuller, U.，et al. 2010. Oncogene 29,1845-1856.)。數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)同時(shí)剔弱(co-knockdowm)Sox2及AC9，而沒有剔弱⑶133，會(huì)抑制GBM細(xì)胞的腫瘤誘發(fā)能力及抗放射線性，此點(diǎn)可藉由miR142-3p之向下調(diào)控誘發(fā)(圖4、圖7及圖15)。11^1 142-3 可負(fù)調(diào)控干細(xì)胞性基因之表達(dá)，而降低miR142-3p表達(dá)會(huì)促進(jìn)CSC相關(guān)的自我更新及抗放射線性。進(jìn)一步探討miR142_3p所調(diào)控的GBM或GBM-CSC的去分化作用(de-differentiation)或重新程序設(shè)計(jì)改造，將可更深入了解miR142-3p在GBM發(fā)展上所扮演的角色。癌干細(xì)胞(CSCs)已于尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)家族性腫瘤中被發(fā)現(xiàn),其仍保有間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的可塑性；EWS-FLI-1及miRNA-145是以相互抑制的回饋循環(huán)方式互動(dòng)、辨識(shí)其共同標(biāo)靶基因Sox2，并接著誘發(fā)MSC重新程序設(shè)計(jì)改造以轉(zhuǎn)變成尤文氏肉瘤CSCs (Riggi, N. , Suva, M. L. , De Vito, C. , Provero, P. , Stehle, J. C. , Baumer, Κ. , Cironi,L. , Janiszewska, Μ. , Petricevic, T. , Suva, D. , et al. Genes Dev 24,916-932.)。在自我新生之人類胚胎干細(xì)胞中miR145表達(dá)為低的，且內(nèi)源性miR145會(huì)抑制多能性因子0ot4、Sox2、及 Klf4 之 3' UTRs (Xu, N. , Papagiannakopoulos, T. , P·an, G. , Thomson, J. A. , andKosik，K. S. 2009. Cell 137，647-658.)。近來(lái)，完整的基因體分析顯示異常的基因表達(dá)會(huì)決定GBM之典型、間充質(zhì)型及原神經(jīng)的類型，且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤特異性的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中涉及一轉(zhuǎn)錄模塊，其可活化惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的間充質(zhì)基因表達(dá)。因此，miRNAs可能調(diào)控腦腫瘤及GBM-CSCs的自我新生及間充質(zhì)特性。此資料證實(shí)，miR142-3p表達(dá)與GBM的發(fā)展為負(fù)相關(guān)性，且將原神經(jīng)型GBM細(xì)胞的內(nèi)源性miR142-3p靜默可誘導(dǎo)該等細(xì)胞重新程序設(shè)計(jì)改造以轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)型態(tài)或GBM的CSCs。再者，同時(shí)表達(dá)Sox2及AC9亦可調(diào)控GBM之間充質(zhì)特性。于復(fù)發(fā)性M型GBM細(xì)胞中，同時(shí)消除Sox2及AC9則會(huì)促進(jìn)間充質(zhì)性特征性改變?yōu)樵窠?jīng)性的外表型，而當(dāng)Sox2及AC9同時(shí)過量表達(dá)于原發(fā)性GBM細(xì)胞時(shí)，將重新程序設(shè)計(jì)改造原神經(jīng)性的外表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)的特征性。因此，miR142-3p可能為Sox2及AC9之上游調(diào)控因子，以調(diào)控間充質(zhì)及原神經(jīng)性的轉(zhuǎn)變。此外，高度GBM的分子指標(biāo)包括葡萄糖作為主要神經(jīng)元細(xì)胞能量的來(lái)源，以及IDHl基因之突變(Zhao，S.，Lin, Y.，Xu, ff.，Jiang, ff.，Zha, Z. , Wang, P. , Yu, ff. , Li, Z. , Gong, L. , Peng, Y. , et al. 2009. Science 324, 261-265.)。既然cAMP可調(diào)控丙酮酸鹽脫氫酵素(Pyruvate dehydrogenase), cAMP可能可調(diào)控糖解路徑以及改變腦部之葡萄糖依賴性。cAMP的生成以及糖解代謝路徑的改變是否與IDHl所調(diào)控的TCA循環(huán)阻斷相互作用仍屬未知。然而，cAMP及IDHl皆涉及糖解路徑，且cAMP為二級(jí)訊息傳遞者。因此，若能發(fā)現(xiàn)GBM的AC9受器，將可有助于找到新穎的GBM療法。⑶133，一 5-穿膜糖蛋白，為造血干細(xì)胞及內(nèi)皮前驅(qū)物的指標(biāo)，且可能涉及血管新生作用。⑶133表達(dá)已被推測(cè)可作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的腫瘤再生長(zhǎng)、惡性發(fā)展、及腫瘤狀況的予頁(yè)后指標(biāo)(Zeppernick, F. , Ahmadi, R. , Campos, B. , Dictus, C. , HeImke, B. Μ. , Becker,N. , Lichter, P. , Unterberg, A. , Radlwimmer, B. , and Herold-Mende, C. C. 2008. ClinCancer Res 14，123-129.)。近來(lái)由Pallini等人所提出的存活率報(bào)告(Pal I ini, R.,Ricci-Vitiani, L. , Montano, N. , Mollinari, C. , Biffoni, Μ. , Cenci, Τ. , Pierconti, F.,Martini, Μ.，De Maria, R.，and Larocca, L. Μ. 2010. Cancer.)，提出相較于原發(fā)性 GBM 的⑶133陽(yáng)性細(xì)胞百分比，復(fù)發(fā)性GBM的⑶133陽(yáng)性細(xì)胞百分比增加4. 6倍，而增加⑶133的表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)后之較長(zhǎng)的存活率有明顯的相關(guān)性。于本研究中，免疫組織化學(xué)分析顯示，相較于原發(fā)性GBM，復(fù)發(fā)性GBM的CD133陽(yáng)性細(xì)胞的百分比明顯的增加。然而存活率分析顯示，CD133表達(dá)量與GBM的存活率并無(wú)明顯相關(guān)性(圖2)。值得注意的是，于原神經(jīng)型GBM的⑶133cDNA過量表達(dá)或于間充質(zhì)型GBM以siRNA靜默的⑶133，于活體外(in vitro)及活體內(nèi)(in vivo)并不會(huì)影響間充質(zhì)的外表型表達(dá)或致腫瘤能力。值得注意的是，相較于⑶133+GBM細(xì)胞，⑶133—細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)球誘發(fā)效率及細(xì)胞聚落生成性上具有相似的CSC特性，以及部分PTEN缺乏的GBM腫瘤被發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生自我新生的腫瘤誘發(fā)⑶133+及⑶133_細(xì)胞型態(tài)(Chen, R. , Nishimura, M. C. , Bumbaca, S. Μ. , Kharbanda, S. , Forrest, ff. F. , Kasman,I. Μ. , Greve, J. Μ. , Soriano, R. H. , Gilmour, L. L. , Rivers, C. S. , et al. 2010. Cancer Cell17，362-375.)。因此，進(jìn)一步亟需探討以判定⑶133表面抗原或⑶133相關(guān)的路徑是否參與類干細(xì)胞特性的調(diào)控，以及CD133是否可做為預(yù)測(cè)GBM病患存活率的指標(biāo)或神經(jīng)膠質(zhì)瘤CSCs的治療目標(biāo)?？偨Y(jié)，miR142-3p可調(diào)控GBM的腫瘤誘發(fā)特性及間充質(zhì)轉(zhuǎn)化能力。升高的miR142-3p表達(dá)會(huì)降低癌癥類干細(xì)胞特性及干細(xì)胞性；抑制miR142_3p會(huì)增加GBM的致腫瘤特性。因此,miR142-3p可能為治療腦部腫瘤的一種新穎的治療實(shí)施例。
試驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)、自GBM組織中分離初代細(xì)胞以及試劑所有取得組織的程序皆依照赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki),并且經(jīng)臺(tái)北榮民總醫(yī)院科學(xué)研究與倫理審查委員會(huì)評(píng)估后才進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，將GBM組織手術(shù)摘除后，以含有HBSS之葡萄糖沖洗該組織三次，接著將樣本以300mm厚度進(jìn)行切片，并將切好的組織浸泡于含有葡萄糖及HBSS的0. I % (w/w)的膠原蛋白酶中，于37°C作用15分鐘，并用搖晃震蕩機(jī)以125rpm速度進(jìn)行震蕩培養(yǎng)。將GBM初代培養(yǎng)及GBM細(xì)胞株培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的MEM(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中，且向MEM中添加ImM丙酮酸鈉、非必需胺基酸、2mM L-谷胺酸、lOOunits/mL青霉素、及100 μ g/mL鏈霉素，并于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)(37°C、95%潮濕空氣、5% C02)。富集癌癥類干細(xì)胞及分離⑶133陽(yáng)性細(xì)胞所有取得組織之程序皆依照赫爾辛基宣言，且經(jīng)臺(tái)北榮民總醫(yī)院科學(xué)研究與倫理審查委員會(huì)評(píng)估后始進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，將頭頸部之癌組織以手術(shù)摘除，并以含有HBSS之葡萄糖沖洗該組織三次，接著將樣本以300mm之厚度進(jìn)行切片，并將切好的組織浸泡于含有葡萄糖及HBSS之0. I % (w/w)之膠原蛋白酶中，于37°C作用15分鐘，并用搖晃震蕩機(jī)以125rpm速度進(jìn)行震蕩培養(yǎng)。接著將經(jīng)膠原蛋白酶消化后之細(xì)胞，以IOOxg之速度進(jìn)行離心10分鐘，并將該等細(xì)胞重新懸浮于癌癥干細(xì)胞富集培養(yǎng)基中以培養(yǎng)GBM細(xì)胞，其中該富集培養(yǎng)基為添加有無(wú)血清DMEM/F12 (GIBCO)培養(yǎng)基、N2補(bǔ)充物(R&D)、10ng/mL人類重組的bFGF (R&D)及 10ng/ml EGF 之 DMEM/F12 培養(yǎng)基。為了分離CD133陽(yáng)性細(xì)胞，其分離步驟如下所示將自GBM病患的腫瘤樣本所分離的細(xì)胞以ImL⑶133/1的微磁珠/106細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，其是使用⑶133細(xì)胞分離套組(MACS，Miltenyi Biotec)。將CD133+細(xì)胞培養(yǎng)于添加有N2補(bǔ)充物(R&D)、10ng/mL人類重組的bFGF (R&D)及 10ng/ml EGF 的無(wú)血清 DMEM/F12 (GIBCO)培養(yǎng)基。供細(xì)胞存活分析的放射線療法以 Theratronic cobalt unit T-1000 (Theratronic International, Inc.,渥太華，加拿大)傳送伽瑪放射線(游離輻射；IR)，劑量為I. lGy/min(SSD = 57. 5cm)。將對(duì)照組之細(xì)胞及IR組的細(xì)胞暴露在不同劑量下(0、2、4、6、8、及10Gy)。經(jīng)10天培養(yǎng)后，將細(xì)胞聚落(每個(gè)細(xì)胞聚落超過50個(gè)細(xì)胞)固定，并以結(jié)晶紫及甲醇溶液進(jìn)行染色20分鐘。以細(xì)胞聚落形成試驗(yàn)分析細(xì)胞存活率。培養(yǎng)效率(Plating efficiency, PE)及存活部分是以下式計(jì)算=PE =(細(xì)胞聚落數(shù)目/接種細(xì)胞數(shù)目)X100%;SF =計(jì)算而得的細(xì)胞聚落數(shù)目/ (接種細(xì)胞數(shù)目X (PE/100))。腫瘤球形成分析分離腫瘤細(xì)胞，并于2 X IO6活細(xì)胞/75cm2角瓶中，培養(yǎng)于添加有N2補(bǔ)充物(R&D)、10ng/mL表皮生長(zhǎng)因子(EGF, Invitrogen)、10ng/mL堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF,Invitrogen)、及青霉素/鏈霉素的改良的DMEM/F-12,使成為腫瘤球。經(jīng)14天后,計(jì)算腫瘤球數(shù)目。定量RT-PCR根據(jù)制造商的操作手冊(cè)(Invitrogen),自細(xì)胞或組織中以Trizol試劑制備全部的RNA。用于qRT-PCRs的mRNAs以Superscript III第一股合成是統(tǒng)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，以進(jìn)行 RT-PCR(Invitrogen)。將所得之 cDNAs 于 ABI 7900HT (Applied Biosystems)進(jìn)行 qRT-PCR反應(yīng)。所用到之引物序列分列于表I中(SEQ ID N0S. 1-24)。表I用于定量RT-PCR的引物序列
基因引物序列產(chǎn)物大小 Tm
(登錄號(hào))_(5，至 3,)_(bp) (0C)
ADCY9F:GCTTCTTTCTGTTTACCTTCACCAA(SEQ ID NO. I)223 55
(NM_001116) R:ATAGAGCAAAAAGAGCACTTCGATG (SEQ ID NO. 2)
CD133F: CGTGATTTTTTACTACCTGGGCTTA(SEQ ID NO. 3)7755
(NM_006017) R: AGCCTCGGGTGGTCGG (SEQ ID NO. 4)
CHI3L1 (YKL40) F: CTCTGCATACAAACTGGTCTGCTAC (SEQ ID NO. 5)111 55
(NM_001276) R: TAGATGATGTGGGTACAGAGGAAGC (SEQ ID NO. 6)
纖維$占連蛋 0 F: ACCTGAGTCCCGGCCTGGAGTA(SEQ ID NO. 7)151 55
(NM_212482) R CTCAGGCCGATGCTTGAATCGGT (SEQ ID NO. 8)
GFAPF: ATCGCCACCTACAGGAAGCT (SEQ ID NO. 9)160 55
(NM_002055) R: GCATCTCCACGGTCTTCACC. (SEQ ID NO. 10)
KLF-4F: CCGCTCCATTACCAAGAGCT (SEQ ID NO. 11)7660
(NM_004235) R: ATCGTCTTCCCCTCTTTGGC (SEQ ID NO. 12)
MAP2F: GTCAGGGTCCCACAGCGTGC (SEQ ID NO. 13)114 55
(NM—002374) R: GCCTGGGCTTCAGCTGCCTC (SEQ ID NO. 14)
NanogF: ATTCAGGACAGCCCTGATTCTTC (SEQ ID NO. 15)7660
(NM_024865) R TTTTTGCGACACTCTTCTCTGC (SEQ ID NO. 16)
神經(jīng)巢蛋白 F: AGGAGGAGTTGGGTTCTG(SEQIDNO. 17)112 55
(NM_006617) R GG A GT GG A GT CT GG A A GG (SEQ TD NO. 18)
Oct-4F: GTGGAGAGCAACTCCGATG (SEQ ID NO. 19)8660
(NM—002701) R TGCTCCAGCTTCTCCTTCTC (SEQ ID NO. 20)
Sox2F: CGAGTGGAAACTTTTGTC.GGA(SEQ ID NO. 21)7455
(NM_003106) R: TGTGCAGCGCTCGCAG (SEQ ID NO. 22)
波形 蛋白 F: GCAATCTTTCAGACAGGATGTTGAC (SEQ ID NO. 23)118 55
(NM_003380) R GATTTCCTCTTCGTGGAGTTTCTTC (SEQ ID NO. 24)對(duì)于miRNAs，使用TaqMan miRNA試驗(yàn)及特異性引物對(duì)進(jìn)行qRT-PCR。所有試劑及試驗(yàn)方法皆來(lái)自Applied Biosystems，且以7900HT快速實(shí)時(shí)PCR是統(tǒng)進(jìn)行偵測(cè)。所使用的引物對(duì)皆列于表2 (SEQ ID N0S. 1-24)
質(zhì)體構(gòu)建所有的質(zhì)體皆被評(píng)估驗(yàn)證及定序過。S0X2、ADCY9、及CD133 UTRs是以PCR擴(kuò)增，并將之構(gòu)建于pMIR-REPORT載體(AppliedBiosystems)上。并藉由Sox2(SEQ IDNOS. 25-29)、ADCY9 (SEQ ID NOS. 30-35)、及 CD133 3' UTRs 之引物組(SEQ ID NOS. 36-41)生成各種序列缺失的構(gòu)建體(表3)。藉由PCR及具有校正功能的Taq以擴(kuò)增各種不同的S0X2、ADCY9、及CD133 3' UTR區(qū)域。藉由引物對(duì)將額外的限制酶切位(Mlul/Hindlll或Spel/Pmel)引入；再以MluI/HindIII或Spel/Pmel將擴(kuò)增區(qū)域酶切后，將之再構(gòu)建于pMIR-熒光酵素報(bào)信子質(zhì)體上。至于miR142-3p sponge的寡核苷酸，miR142_3p反義及不規(guī)則的(scramble)構(gòu)建已列于表3 (SEQ IDN0S. 42-52)。如同Gangemi et al.，2009所述方式，將寡核苷酸黏合后將之接合至BL0CK-iT Pol II miR RNAi表達(dá)表達(dá)載體上。標(biāo)靶人類S0X2序列之寡核苷酸序列皆已設(shè)計(jì)于Invitrogen網(wǎng)站上。選定其中一個(gè)寡核苷酸,將之如同Gangemi et al.,2009所述的方式構(gòu)建入BL0CK-iT Pol II miRRNAi表達(dá)載體。構(gòu)建用引物對(duì)(SEQ ID N0S. 42-52)皆列于表3。該pcDNA 6. 2-Gff/EmGFP-miR-neg對(duì)照組質(zhì)體含有一插入子，其可形成發(fā)夾結(jié) 構(gòu)，可修飾成成熟的miRNA，但其被設(shè)計(jì)為不會(huì)標(biāo)靶任何已知脊椎動(dòng)物基因。無(wú)5’突出端(overhang)的負(fù)對(duì)照組序列列于表3。所有構(gòu)建方法皆按照制造商的操作手冊(cè)執(zhí)行。流式細(xì)胞儀根據(jù)制造商的操作方式進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記，以含有藻紅蛋白(MiltenyiBiotech.,Auburn, CA, USA)的抗 CD133 抗體將細(xì)胞染色。以 FACSCalibur (Becton Dickinson)及CellQuest軟件測(cè)量受藍(lán)色(488nm)激發(fā)光照射的10，000的細(xì)胞的紅色(> 650nm)熒光發(fā)射光。于細(xì)胞分選試驗(yàn)中，將細(xì)胞標(biāo)記并以FACSAria(BD Biosciences)進(jìn)行分選。miR142-3p Angomir及微脂體媒介的運(yùn)輸方式以如同miR142-3p的序列合成帶有修飾的miR142-3p RNA寡核苷酸。將硫代磷酸酯骨架修飾為磷酸二酯骨架，且將核糖以鎖核酸(lock-nucleic-acid，LNA)核糖取代之。miR142-3p angomir的運(yùn)送是的藉由微脂體為主的核酸運(yùn)輸方法所調(diào)控。簡(jiǎn)言之，將miR142-3p溶解于D5W(5%葡萄糖水)中，并以特定的脂質(zhì)成分包埋入微脂體中。將包好的微脂體(miR142-3p angomir之最終濃度為IOng/ μ L)送入頡內(nèi)異種移植的腫瘤誘發(fā)細(xì)胞的相同位置。miRNA北方墨點(diǎn)法以miVana miRNA 分離套組(Ambion)或 Trizol (Invitrogen)將 microRNAs 萃取出來(lái)。將50ng之分離的小型RNAs，置入每一個(gè)孔中進(jìn)行電泳，其中該電泳是于含有7M尿素之15%聚丙烯酰胺凝膠的O. 5X TBE中進(jìn)行。經(jīng)電泳后，藉由半干式轉(zhuǎn)移機(jī)將小型RNAs轉(zhuǎn)移至Hybond-N+膜上，并藉由UV交聯(lián)機(jī)進(jìn)行交聯(lián)。以miVana探針及標(biāo)記套組合成RNA標(biāo)記(decade marker),并藉由相同套組將對(duì)于miR142_3p特異性的LNA-RNA寡核苷酸(SEQ ID NO. 52)(表3)進(jìn)行標(biāo)記，以引入5’端的放射性標(biāo)記。將膜片先進(jìn)行前雜交(prehybridized)，再以雜交緩沖液進(jìn)行雜交處理24小時(shí)，再以沖洗緩沖液進(jìn)行沖洗三次。雜交訊號(hào)曝露于X光片48小時(shí)。熒光原位雜交(FISH)將細(xì)胞于室溫下固定于含4%三聚甲醛之PBS中15分鐘，接著以含有O. 1%NP-40及O. 1% X-IOOTriton的PBS將細(xì)胞進(jìn)行通透化。經(jīng)以10%驢血清，于室溫封閉(blocking) 2小時(shí)后，將LNA修飾的，及FITC共軛結(jié)合的miR142-3p反義寡核苷酸(SEQ IDNO. 52)置入雜交緩沖液中，于42°C作用整夜，接著以5X SSPE及2X SSPE清洗。染色影像是以 Olympus 影像是統(tǒng)(Silahtaroglu, A. N.，Nolting, D.，Dyrskjot, L，Berezikov, E.，Moller, M.，Tommerup，N.，and Kauppinen，S. 2007. Nat Protoc 2，2520-2528.)拍攝。寡核苷酸序列(SEQ ID NO. 52)列于表2。表2

權(quán)利要求
1.一種利用有效量的miR142-3p制備抑制細(xì)胞中目標(biāo)基因表達(dá)的醫(yī)藥制劑的應(yīng)用，其特征在于，該目標(biāo)基因?yàn)镃D133、S0X2、*AC9。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，該miR142-3p直接與目標(biāo)基因的mRNA的3’端非轉(zhuǎn)譯區(qū)(3，UTR)連結(jié)。
3.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，該細(xì)胞為復(fù)發(fā)性多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞。
4.一種檢測(cè)個(gè)體于治療后是否具有或具有發(fā)展為復(fù)發(fā)性多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的風(fēng)險(xiǎn)的套組，其特征在于，包含miR142-3p反義寡核苷酸及可檢測(cè)樣本中miR142_3p表達(dá)量的試劑。
5.如權(quán)利要求4所述的套組，其特征在于，該可檢測(cè)樣本中miR142-3p表達(dá)量的試劑為聚合酶鏈鎖反應(yīng)(PCR)、突光原位雜交反應(yīng)或薄膜上的南方墨點(diǎn)法所使用的反應(yīng)緩沖液及酵素。
6.如權(quán)利要求4所述的套組，其特征在于，用于檢測(cè)下列樣本的miR142-3p的表達(dá)水平 (a)患有原發(fā)性GBM的個(gè)體的對(duì)照組樣本；以及 (b)經(jīng)治療后,該相同個(gè)體的試驗(yàn)組樣本， 其中(b)試驗(yàn)組樣本中miR142-3p的水平低于(a)對(duì)照組樣本中miR142_3p的水平，代表經(jīng)治療后，該個(gè)體具有或具有發(fā)展為復(fù)發(fā)性多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的風(fēng)險(xiǎn)。
7.如權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的套組，其特征在于，該個(gè)體接受的治療為外科手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射性治療、或其組合。
8.如權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的套組，其特征在于，miR142-3p水平的降低為預(yù)后不佳的指標(biāo)。
9.如權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的套組，其特征在于，該個(gè)體為患有第I、II、III、或IV級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的病患。
10.一種治療患有多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的個(gè)體的醫(yī)藥制劑的應(yīng)用，其特征在于，該醫(yī)藥制劑是利用醫(yī)藥上有效量的miR142-3p制備。
11.如權(quán)利要求10項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，該醫(yī)藥制劑通過立體定位裝置投與至腫瘤所在位置。
12.如權(quán)利要求10項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，該多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤為復(fù)發(fā)性多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。
13.如權(quán)利要求10項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，該miR142-3p由核酸所編碼。
14.如權(quán)利要求13項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，該核酸位于選自由質(zhì)體、黏質(zhì)體、噬菌質(zhì)體、或病毒所組成的群組的載體上。
15.如權(quán)利要求10項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，該miR142-3p為具有經(jīng)LNA-及硫代磷酸酯-修飾骨架修飾的微型核糖核酸(microRNA)。
16.如權(quán)利要求15項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，該修飾的微型核糖核酸被包埋于微脂體中。
17.一種用以生產(chǎn)多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模式動(dòng)物的方法，其特征在于，包含 (a)準(zhǔn)備原發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞；(b)將miR142-3p反義寡核苷酸導(dǎo)入該原發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，以得到miR142_3p缺失的細(xì)胞； (c)將該miR142-3p缺失的細(xì)胞植入動(dòng)物中，以得到患有多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的動(dòng)物。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，該動(dòng)物為老鼠。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，植入動(dòng)物的miR142-3p缺失的細(xì)胞數(shù)目為I 1000個(gè)。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，植入動(dòng)物的miR142-3p缺失的細(xì)胞數(shù)目為50個(gè)。
21.一種用以增加多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)于放射性療法敏感性的醫(yī)藥制劑的應(yīng)用，其特征在于，該醫(yī)藥制劑是利用miR142-3p制備。
22.如權(quán)利要求21所述的應(yīng)用，其特征在于，該醫(yī)藥制劑通過立體定位裝置投放至腫瘤所在位置。
23.如權(quán)利要求21所述的應(yīng)用，其特征在于，該miR142-3p由核酸所編碼。
24.如權(quán)利要求23所述的應(yīng)用，其特征在于，該核酸位于載體上；其中該載體選自由質(zhì)體、黏質(zhì)體、噬菌質(zhì)體及病毒所組成的群組。
25.如權(quán)利要求21所述的應(yīng)用，其特征在于，該miR142-3p為具有經(jīng)LNA-及硫代磷酸酯-修飾骨架修飾的微型核糖核酸(microRNA)。
26.如權(quán)利要求25所述的應(yīng)用，其特征在于，該修飾的微型核糖核酸被包埋于微脂體中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微型核糖核酸作為癌癥進(jìn)展的預(yù)測(cè)因子及其治療癌癥的應(yīng)用。本發(fā)明基于所發(fā)現(xiàn)的miR142-3p的新穎功能，其新穎功能在于miR142-3p可調(diào)控Sox2、腺苷酸環(huán)化酶9(adenylyl cyclase 9，AC9)、及CD133的表達(dá)，以及進(jìn)而調(diào)控復(fù)發(fā)性的GBM細(xì)胞及CSCs細(xì)胞的整體干細(xì)胞性(stemness)，并且在復(fù)發(fā)性GBM細(xì)胞中，該miR142-3p可調(diào)節(jié)其腫瘤誘發(fā)特性。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種以微型核糖核酸(miRNA)為主的新穎療法，可用以治療腦瘤。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102813940SQ20121008820
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月29日
發(fā)明者邱士華, 邱光裕 申請(qǐng)人:臺(tái)北榮民總醫(yī)院