專利名稱：防治急性冠脈綜合征的藥物組合物的制備方法及其活性部位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)防和治療急性冠脈綜合征的藥物組合物，尤其是涉及這種組合物的現(xiàn)代劑型的制備方法和制備過程中得到的一組活性部位。
背景技術(shù)：
急性冠脈綜合征(ACS)是一組由急性心肌缺血引起的臨床綜合征，包括急性心肌梗死(AMI)及不穩(wěn)定型心絞痛(UA)，是嚴重危害人類健康的重大、常見疾病。凝血功能激活和易損斑塊炎癥反應(yīng)在ACS的發(fā)生中起著重要作用，是兩個核心病理環(huán)節(jié)。目前抗凝和抗
血小板治療研究較為深入，臨床應(yīng)用廣泛；而在控制炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定易損斑塊的治療上缺乏有效手段。中醫(yī)藥在急性冠脈綜合征的治療上，特別是抑制動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定斑塊、減少嚴重心腦血管事件方面，顯示了巨大潛力。四妙勇安湯由金銀花、玄參、當歸、生甘草組成，具有顯著解毒活血定痛的作用，傳統(tǒng)用于下肢動脈閉塞癥和脈管炎的治療。目前，關(guān)于該方在冠心病治療方面的臨床療效及其抑制炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定動脈粥樣硬化易損斑塊的藥理作用方面的報道已有一些。但因為原方用藥量過大，煎煮麻煩，給臨床用藥和新藥開發(fā)帶來難度。因此，需要發(fā)現(xiàn)“四妙勇安湯”新劑型的制備方法和藥效學物質(zhì)基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)該經(jīng)典名方的活性靶點所在，研制出藥效物質(zhì)清楚、作用環(huán)節(jié)明確、安全高效、質(zhì)量可控的治療急性冠脈綜合征的現(xiàn)代中藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種藥效物質(zhì)清楚、作用環(huán)節(jié)明確、安全高效、質(zhì)量可控的對急性冠脈綜合征具有預(yù)防或治療作用的藥物組合物的制備方法。進一步地，本發(fā)明還提供了在該制備過程中所得到的、具有顯著抑制動脈粥樣斑塊炎癥反應(yīng)作用的一組有效部位。為了實現(xiàn)上述至少一個發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供了一種對急性冠脈綜合征具有預(yù)防或治療作用的藥物組合物的制備方法，包括如下步驟a)將原料藥金銀花、玄參、當歸、甘草按照重量比2. 5 4 2. 5 4 I. 5 2.5 0. 5 I. 5的比例混勻；b)將所述原料藥中加入40 60%的乙醇作為提取溶劑，所述原料藥與所述提取溶劑的固液比為I : 5 10，提取2次以上，每次I. 5 4. 5小時，過濾后合并濾液，得到提取液和殘渣；c)將所述提取液濃縮至干，后加水混懸，上大孔樹脂，分別采用水、30%乙醇、60%乙醇和95%乙醇作為洗脫液進行連續(xù)淋洗，分別得到第I提取物、第2提取物、第3提取物和第4提取物；d)將所述殘渣用水提取2 3次，每次I 2小時，得到第5提取物；以及，e)將所述第5提取物濃縮至干，后加水混懸，上大孔樹脂，采用水、55%乙醇和95%乙醇作為洗脫液進行連續(xù)淋洗，分別得到第6提取物、第7提取物和第8提取物。根據(jù)本發(fā)明的實施方式之一，原料藥中金銀花、玄參、當歸、甘草的優(yōu)選重量比為3 : 3 : 2 : I。這既是臨床經(jīng)驗的總結(jié)，同時又是經(jīng)過實驗驗證的有效配比。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，提取的步驟b)中乙醇的濃度為55%。根據(jù)本發(fā)明的實施方式之一，步驟b)中固液比為優(yōu)選為I : 6 8。根據(jù)本發(fā)明的實施方式之一，步驟b)中的提取次數(shù)為4次。根據(jù)本發(fā)明的實施方式之一，步驟b)中的提取時間為2 4小時。根據(jù)本發(fā)明的實施方式之一，本制備方法中所采用的大孔樹脂為苯乙烯型弱極性共聚物，優(yōu)選為AB-8大孔樹脂。 優(yōu)選地，本發(fā)明所提供的一種對急性冠脈綜合征具有預(yù)防或治療作用的藥物組合物的制備方法，包括如下步驟a)將原料藥金銀花、玄參、當歸、甘草按照重量比3:3:2: I的比例混勻；b)將所述原料藥中加入55%的乙醇作為提取溶劑，所述原料藥與所述提取溶劑的固液比為I : 8，提取4次，每次2小時，過濾后合并濾液，得到提取液和殘渣；c)將所述提取液濃縮至干，后加水混懸，上AB-8大孔樹脂，分別采用水、30%乙醇、60%乙醇和95%乙醇作為洗脫液進行連續(xù)淋洗，分別得到第I提取物、第2提取物、第3提 取物和第4提取物；d)將所述殘渣用水提取2次，每次I. 5小時，得到第5提取物；以及，e)將所述第5提取物濃縮至干，后加水混懸，上AB-8大孔樹脂，分別采用水、55%乙醇和95%乙醇作為洗脫液進行連續(xù)淋洗，分別得到第6提取物、第7提取物和第8提取物。以上所述本發(fā)明所提供的制備方法及其優(yōu)選方案，是發(fā)明人在多年醫(yī)療實踐的基礎(chǔ)上摸索而成，并經(jīng)過實驗驗證的、針對傳統(tǒng)名方四妙勇安湯的新劑型的提取加工工藝。采用本發(fā)明所提供的制備方法得到的提取物I 8，經(jīng)分子水平實驗驗證對急性冠脈綜合征的病理靶點均具有預(yù)防或治療作用。經(jīng)發(fā)明人在實驗中，采用NF-k B反應(yīng)原件 結(jié)合抑制劑篩選模型和過氧化物酶增殖劑受體(PPARy)激動劑篩選模型，對這些提取物的抑制炎癥反應(yīng)的作用進行驗證，證實它們均有不同程度的抑制動脈粥樣斑塊炎癥反應(yīng)的作用。NF-k B過度活化可引起多種病理反應(yīng)，特別是和多種炎癥反應(yīng)相關(guān)，其中激活動脈粥樣斑塊炎癥反應(yīng)也是其中之一。NF- K B多以p50或p52結(jié)合p65亞基的形式存在，活化后P65亞基與I K B解離，由胞漿轉(zhuǎn)位進入胞核，與靶基因上的反應(yīng)原件(RE)結(jié)合，調(diào)節(jié)目的基因的表達。因此，NF-K B轉(zhuǎn)位后早期基因表達的阻斷策略為抑制其病理信號通路的關(guān)鍵靶點。發(fā)明人利用分子克隆技術(shù)，以人臍靜脈內(nèi)皮細胞cDNA為模板，擴增NF-K B-RE基因，克隆至pGL4. 32真核表達載體中，經(jīng)轉(zhuǎn)染，導入293A細胞內(nèi)，經(jīng)Hygromycin篩選、傳代，建立了穩(wěn)定表達NF- K B-RE的細胞系(pGL4. 32 [luc2P/NF_kappaB-RE] 293A)。該模型可直接通過熒光素酶檢測試劑檢測熒光素酶光化學值的變化，用于進行NF-k B抑制劑的高通量篩選。經(jīng)驗證，確定第1、2、3、5、6、7提取物對即-1^8通路具有阻斷作用，能夠通過抑制早期基因表達而抑制該病理信號通路。過氧化物酶增殖劑受體(PPAR)是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子核受體超家族成員之一。目前已知其三個亞型PPARa，-￠/6和-Y。過氧化物酶增殖劑受體Y (PPAR y )能影響NF-K B、信號轉(zhuǎn)錄子、激活蛋白-I介導的信號通路，通過抑制這些途徑的激活達到抑制靶基因啟動子激活和轉(zhuǎn)錄的目的。PPARy的N端功能區(qū)含有一個能被有絲分裂原激活的蛋白激酶磷酸化位點，若該區(qū)域突變或在磷蛋白磷酸酶共同作用下則不能產(chǎn)生磷酸化而使其活化。配體與PPAR Y結(jié)合并使之激活后，與視黃醒X受體a (retinoid X receptor a，RXR a )形成異ニ聚體，再結(jié)合于特異性DNA序列而使靶基因活化，此序列稱為PPAR特異性反應(yīng)兀件(peroxisome proliferator responsive element, PPRE)。含有 PPRE 結(jié)構(gòu)的基因包括已酰輔酶A合成酶、脂蛋白脂肪酶(LPL)、胰島素受體底物-2 (IRS-2)、瘦素以及腫瘤壞死因子-a (TNF-a)等。PPARy通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，在脂肪形成、糖脂代謝，以及在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，并與多種疾病如糖尿病、肥胖、高血壓、癌癥等的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。尤其是PPARy是脂肪細胞分化過程中的關(guān)鍵因子，近年來備受關(guān)注。PPARy成為了肥胖，高血壓，動脈粥樣硬化的治療靶點。發(fā)明人以PPARy為靶位篩選其激動劑，發(fā)現(xiàn)第3、4、7、8提取物均有明顯的PPARy激動劑效果，其中第3提取物和第7提取物在0. lmg/ml時的有效率分別為100%與32%，第4提取物和第8提取物在0. 0lmg/ml時的有效率分別為90%與38% ;而第1、2、6提取物的有效率均低于60% ;第5提取物未發(fā)現(xiàn)PPAR Y激動活性。根據(jù)實驗結(jié)果，可見利用本發(fā)明所提供的制備方法得到的第I 8提取物，均有不同程度的促進活化的過氧化物酶體増殖物激活受體Y (PPAR-Y)表達和/或抑制核轉(zhuǎn)錄因子kB(NF-kB)表達。其中，以促進PPAR-Y表達的作用最為顯著，例如第4提取物，小劑量即可引起高達90%的有效率。因而，根據(jù)臨床實際的用藥需要，將這些提取物進行有選擇地、任意比例的組合，即可以得到安全高效、質(zhì)量可控的對急性冠脈綜合征具有預(yù)防或治療作用的藥物組合物。例如分別選擇第2、3、4提取物69g、13. 5g和25. 8g進行混合；或者分別選擇第1、2、3、4提取物10g、10g、12. Sg和6g進行混合；還可以選擇第4、5、6、7提取物8g、18g、22g、45g 進行混合。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了在上述制備過程中得到的ー組對急性冠脈綜合征具有預(yù)防或治療作用的中藥組合物活性成分，即有效(活性)部位。本發(fā)明提供的有效部位之一，其制備方法為a’ )將原料藥金銀花、玄參、當歸、甘草按照3 3 2 I的比例混勻；b’)將原料藥中加入55%的こ醇作為提取溶劑，所述原料藥與所述提取溶劑的固液比為I : 8，提取4次，毎次2小時，過濾后合并濾液，得到提取液；以及c’)將所述提取液濃縮至干，后加水混懸，上AB-8大孔樹脂，采用30%こ醇作為洗脫液，得到30%こ醇淋洗物，即為所述有效部位。經(jīng)過實驗驗證，該提取物對NF-K B信號通路具有阻斷作用，IC50為31. 61 u g/ml。本發(fā)明提供的另一有效部位，其制備方法為a”)將原料藥金銀花、玄參、當歸、甘草按照3 3 2 I的比例混勻；b”)將原料藥中加入55%的こ醇作為提取溶劑，所述原料藥與所述提取溶劑的固液比為I : 8，毎次2小時，提取4次，過濾后合并濾液，得到提取液；以及c”)將所述提取液濃縮至干，后加水混懸，上AB-8大孔樹脂，采用60%こ醇作為洗脫液，得到60%こ醇淋洗物，即為所述有效部位。經(jīng)過實驗驗證，該提取物對NF- K B信號通路具有阻斷作用，IC5tl為32. 49 u g/ml ;并有明顯的PPAR Y激動劑效果，0. lmg/ml時的有效率為100%。本發(fā)明提供的再一有效部位，其制備方法為a”’ )將原料藥金銀花、玄參、當歸、甘草按照3 3 2 I的比例混勻；b”’)將原料藥中加入55%的こ醇作為提取溶劑，所述原料藥與所述提取溶劑的固液比為I : 8，提取4次，毎次2小時，過濾后合并濾液，得到、提取液；以及C”’ )將所述提取液濃縮至干，后加水混懸，上AB-8大孔樹脂，采用95%こ醇作為洗脫液，得到95%こ醇淋洗物，即為所述有效部位。經(jīng)過實驗驗證，該提取物有非常明顯的PPARy激動劑效果，0. 0 lmg/ml時的有效率為90%。以上三組有效部位，均是在本發(fā)明所提供的制備エ藝的過程中所得到的、對動脈粥樣斑塊炎癥反應(yīng)具有顯著抑制作用的物質(zhì)。發(fā)明人經(jīng)藥理實驗證實，它們作用的機理均為不同程度地促進活化的過氧化物酶體増殖物激活受體Y (PPAR-Y)表達和/或抑制核轉(zhuǎn)錄因子K B (NF-k B)表達。
本發(fā)明附加的方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從下面結(jié)合附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖I為根據(jù)本發(fā)明實施方式之一所提供的制備方法エ藝流程圖；圖2-10為本發(fā)明所提供的不同提取條件下、所得藥物組合物的HPLC圖譜，圖2-10分別對應(yīng)實驗例一中的“試驗號” 1-9 ；圖11-13為本發(fā)明所提供的藥物組合物用于PPARy激動模型的初篩結(jié)果；圖14-15為本發(fā)明所提供的藥物組合物用于PPARy激動模型的復(fù)篩結(jié)果。
具體實施例方式下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能解釋為對本發(fā)明的限制。實驗例一提取エ藝優(yōu)化研究I、試驗方法(I)提取方法稱取原料藥四味共10. Sg左右，其重量比例為金銀花玄參當歸甘草=3 3 2 1，按照正交試驗表選定的因素和水平進行提取。(2)提取條件的選擇根據(jù)中藥中化合物的存在特點，選擇水和こ醇為提取溶剤，對こ醇濃度、用量、提取時間、提取次數(shù)四個因素進行考察，每個因素限定三個水平，具體內(nèi)容見表I。表I因素水平表
權(quán)利要求
1.一種從中藥組合物中提取活性部位的方法，包括如下步驟 a)將原料藥金銀花、玄參、當歸、甘草按照重量比2.5 4 2. 5 4 I. 5 2.5 0. 5 I. 5的比例混勻； b)將所述原料藥中加入40 60%的こ醇作為提取溶劑，所述原料藥與所述提取溶劑的固液比為I : 5 10，提取2次以上，毎次I. 5 4. 5小時，過濾后合并濾液，得到提取液和殘渣； c)將所述提取液濃縮至干，后加水混懸，上大孔樹脂，采用水、30%こ醇、60 %こ醇和95%こ醇作為洗脫液進行連續(xù)淋洗，分別得到第I提取物、第2提取物、第3提取物和第4提取物； d)將所述殘渣用水提取2 3次，毎次I 2小時，得到第5提取物； e)將所述第5提取物濃縮至干，后加水混懸，上大孔樹脂，分別采用水、55%こ醇和95%こ醇作為洗脫液進行連續(xù)淋洗，分別得到第6提取物、第7提取物和第8提取物。
2.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其中所述原料藥中金銀花、玄參、當歸、甘草的重量比為 3 : 3 : 2 : I。
3.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其中所述步驟b)中こ醇的濃度為55%。
4.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其中所述步驟b)中固液比為I: 6 8。
5.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其中所述步驟b)中的提取次數(shù)為4次，提取時間為2 4小時。
6.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其中所述大孔樹脂為苯こ烯型弱極性共聚物，優(yōu)選為AB-8大孔樹脂。
7.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其中所述第I 8提取物對急性冠脈綜合征均具有預(yù)防或治療作用。
8.ー種對急性冠脈綜合征具有預(yù)防或治療作用的中藥組合物有效部位，其制備方法為 a’)將原料藥金銀花、玄參、當歸、甘草按照3 3 2 I的比例混勻；b’ )將原料藥中加入55%的こ醇作為提取溶劑，所述原料藥與所述提取溶劑的固液比為I : 8，提取4次，毎次2小時，過濾后合并濾液，得到提取液；以及 c’ )將所述提取液濃縮至干，后加水混懸，上AB-8大孔樹脂，采用30%こ醇作為洗脫液，得到30%こ醇淋洗物，即為所述有效部位。
9.ー種對急性冠脈綜合征具有預(yù)防或治療作用的中藥組合物有效部位，其制備方法為 a”)將原料藥金銀花、玄參、當歸、甘草按照3 3 2 I的比例混勻；b”)將原料藥中加入55%的こ醇作為提取溶劑，所述原料藥與所述提取溶劑的固液比為I : 8，毎次2小時，提取4次，過濾后合并濾液，得到提取液；以及 c”)將所述提取液濃縮至干，后加水混懸，上AB-8大孔樹脂，采用60%こ醇作為洗脫液，得到60%こ醇淋洗物，即為所述有效部位。
10.ー種對急性冠脈綜合征具有預(yù)防或治療作用的中藥組合物有效部位，其制備方法為 a”’)將原料藥金銀花、玄參、當歸、甘草按照3 3 2 I的比例混勻；b”’ )將原料藥中加入55%的乙醇作為提取溶劑，所述原料藥與所述提取溶劑的固液比為I : 8，提取4次，每次2小時，過濾后合并濾液，得到提取液；以及 c”’ )將所述提取液濃縮至干，后加水混懸，上AB-8大孔樹脂，采用95%乙醇作為洗脫液，得到95%乙醇淋洗物，即為所述有效部位。
11.一種從中藥組合物中提取活性部位的方法，包括如下步驟 a)將原料藥金銀花、玄參、當歸、甘草按照重量比3 3 2 I的比例混勻； b)將所述原料藥中加入55%的乙醇作為提取溶劑，所述原料藥與所述提取溶劑的固液比為I : 8，提取4次，每次2小時，過濾后合并濾液，得到提取液和殘渣； c)將所述提取液濃縮至干，后加水混懸，上AB-8大孔樹脂，分別采用水、30%乙醇、60%乙醇和95%乙醇作為洗脫液進行連續(xù)淋洗，分別得到第I提取物、第2提取物、第3提取物和第4提取物；、 d)將所述殘渣用水提取2次，每次I.5小時，得到第5提取物；以及 e)將所述第5提取物濃縮至干，后加水混懸，上AB-8大孔樹脂，分別采用水、55%乙醇和95%乙醇作為洗脫液進行連續(xù)淋洗，分別得到第6提取物、第7提取物和第8提取物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從中藥組合物中提取活性部位的方法，包括將原料藥金銀花、玄參、當歸、甘草按照重量比2.5～4∶2.5～4∶1.5～2.5∶0.5～1.5的比例混勻后乙醇提取，得到提取液和殘渣；所得提取液濃縮后上大孔樹脂，分別采用水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇作為洗脫液進行連續(xù)淋洗，分別得到第1～4提取物；殘渣用水提取后得到第5提取物；第5提取物上大孔樹脂，采用水、55％乙醇和95％乙醇作為洗脫液進行連續(xù)淋洗，分別得到第6提取物、第7提取物和第8提取物。本發(fā)明所提供的制備方法得到的提取物1～8，經(jīng)實驗驗證對急性冠脈綜合征均具有預(yù)防或治療作用。此外，還提供了在上述制備過程中得到的一組有效部位。
文檔編號A61K36/808GK102727653SQ20121009648
公開日2012年10月17日 申請日期2012年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月1日
發(fā)明者吳圣賢, 聶波, 陳立新 申請人:北京中醫(yī)藥大學