專利名稱：對炎癥因子表達(dá)具有抑制作用的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是中藥有效部位及其應(yīng)用領(lǐng)域，尤其是涉及一種對炎癥因子表達(dá)具有抑制作用的中藥有效部位的組合物。
背景技術(shù)：
炎癥損傷是臟器，如心臟、腦等在發(fā)生損傷時，由免疫系統(tǒng)廣泛參與的復(fù)雜反應(yīng)，炎癥過程中會釋放出大量炎癥因子，包括細(xì)胞因子、粘附分子等，促使損傷的進(jìn)一步發(fā)生。炎癥反應(yīng)的發(fā)生會導(dǎo)致臟器局部二次損傷的發(fā)生，例如腦 缺血、心肌缺血，均是與炎癥反應(yīng)具有密切聯(lián)系的臨床常見病。例如，急性冠脈綜合征(ACS)是一組由急性心肌缺血引起的臨床綜合征，凝血功能激活和易損斑塊炎癥反應(yīng)在ACS的發(fā)生中起著重要作用，是兩個核心病理環(huán)節(jié)。又如在中風(fēng)過程中，腦缺血和再灌注之后，腦組織中均出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，造成腦缺血后的二次損傷。中醫(yī)藥治療心腦缺血性病變上，顯示了巨大潛力，但是，理想的藥物還沒有開發(fā)出來?！八拿钣掳矞庇伞敖疸y花、玄參、當(dāng)歸、生甘草”組成，具有顯著解毒活血定痛的作用，傳統(tǒng)用于下肢動脈閉塞癥和脈管炎的治療。近年來，醫(yī)家基于對臟器，例如心、腦，缺血性炎癥反應(yīng)病理機制的認(rèn)識，將該方開始用于冠心病、腦缺血等治療，取得了滿意臨床療效。“四妙勇安湯”配伍精當(dāng)，藥專力宏，是最具中醫(yī)配伍和用量特色的傳統(tǒng)名方之一，具有很好的成藥開發(fā)前景，其配伍規(guī)律和量效關(guān)系也值得深入研究，但因為原方用藥量過大，給新藥開發(fā)帶來難度。因此，需要發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)名方的藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)其活性部位所在，研制出藥效物質(zhì)清楚、作用環(huán)節(jié)明確、安全高效、質(zhì)量可控、配伍精當(dāng)?shù)膶ρ装Y因子具有抑制作用的現(xiàn)代藥物組合物。

發(fā)明內(nèi)容
為了達(dá)到上述至少一個發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種對炎癥因子表達(dá)具有抑制作用的藥物組合物，該組合物的組成部分均為中醫(yī)傳統(tǒng)名方“四妙勇安湯”的有效部位。本發(fā)明所提供的對炎癥因子表達(dá)具有抑制作用的藥物組合物，由第I提取物、第2提取物和第3提取物組成，所述提取物的制備方法如下a)將原料藥金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草按照重量比2. 5 4 2. 5 4 I. 5 2. 5 O. 5 I. 5的比例混勻；b)將所述原料藥中加入水或40 60%的乙醇作為提取溶劑，所述原料藥與所述提取溶劑的固液比為
I 5 10，提取2次以上，每次I. 5 4. 5小時，過濾后合并濾液，得到提取液和殘渣；c)將所述提取液濃縮至干，后加水混懸，上大孔樹脂，采用水、30%乙醇、60%乙醇和95%乙醇作為洗脫液進(jìn)行連續(xù)淋洗，分別得到30%乙醇淋洗物即為所述第I提取物，60%乙醇淋洗物即為所述第2提取物、95%乙醇淋洗物即為所述第3提取物；d)將所述第1、2、3提取物混合，得到所述藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的實施方式之一，原料藥中金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草的優(yōu)選重量比為3 : 3 : 2 : I。這既是臨床經(jīng)驗的總結(jié)，同時又是經(jīng)過實驗驗證的有效配比。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，提取的步驟b)中乙醇的濃度為55%。根據(jù)本發(fā)明的實施方式之一，步驟b)中固液比為優(yōu)選為I : 6 8。根據(jù)本發(fā)明的實施方式之一，步驟b)中的提取次數(shù)為4次，每次提取時間為2 4小時。根據(jù)本發(fā)明的實施方式之一，本制備方法中所采用的大孔樹脂為AB-8大孔樹脂。優(yōu)選地，本發(fā)明所提供的一種對炎癥因子表達(dá)具有抑制作用的藥物組合物，由第I提取物、第2提取物和第3提取物組成，所述提取物的制備方法如下a)將原料藥金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草按照重量比3 3 2 I的比例混勻；b)將所述原料藥中加入55%的乙 醇作為提取溶劑，所述原料藥與所述提取溶劑的固液比為I : 8，提取4次，每次2小時，過濾后合并濾液，得到提取液和殘渣；c)將所述提取液濃縮至干，后加水混懸，上AB-8大孔樹脂，采用水、30%乙醇、60%乙醇和95%乙醇作為洗脫液進(jìn)行連續(xù)淋洗，得到30%乙醇淋洗物即為所述第I提取物，60%乙醇淋洗物即為所述第2提取物、95%乙醇淋洗物即為所述第3提取物；d)將所述第I 3提取物混合，得到所述藥物組合物。以上所述本發(fā)明所提供的藥物組合物及其優(yōu)選方案，是發(fā)明人在多年醫(yī)療實踐的基礎(chǔ)上摸索而成，并經(jīng)過實驗驗證的、針對傳統(tǒng)名方四妙勇安湯的改進(jìn)劑型。本發(fā)明所提供的提取物I 3，經(jīng)實驗驗證對炎癥因子表達(dá)均具有抑制作用。經(jīng)發(fā)明人在實驗中，采用NF-κ B反應(yīng)原件結(jié)合抑制劑篩選模型和過氧化物酶增殖劑受體(PPAR Y )激動劑篩選模型，對這些提取物的抑制炎癥反應(yīng)的作用進(jìn)行驗證，證實它們均有不同程度的抑制動脈粥樣斑塊炎癥反應(yīng)的作用。NF-κ B過度活化可引起多種病理反應(yīng)，特別是和多種炎癥反應(yīng)相關(guān)，其中激活動脈粥樣斑塊炎癥反應(yīng)也是其中之一。NF- K B多以p50或p52結(jié)合p65亞基的形式存在，活化后P65亞基與I K B解離，由胞漿轉(zhuǎn)位進(jìn)入胞核，與靶基因上的反應(yīng)原件(RE)結(jié)合，調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)。因此，NF-K B轉(zhuǎn)位后早期基因表達(dá)的阻斷策略為抑制其病理信號通路的關(guān)鍵靶點。發(fā)明人利用分子克隆技術(shù)，以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cDNA為模板，擴增NF-K B-RE基因，克隆至pGL4. 32真核表達(dá)載體中，經(jīng)轉(zhuǎn)染，導(dǎo)入293A細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)Hygromycin篩選、傳代，建立了穩(wěn)定表達(dá)NF- K B-RE的細(xì)胞系(pGL4. 32 [luc2P/NF_kappaB-RE] 293A)。該模型可直接通過熒光素酶檢測試劑檢測熒光素酶光化學(xué)值的變化，用于進(jìn)行NF-κ B抑制劑的高通量篩選。經(jīng)驗證，確定第1、2提取物對NF-kB通路具有阻斷作用，能夠通過抑制早期基因表達(dá)而抑制該病理信號通路，IC50分別為31. 61 μ g/ml和32. 49 μ g/ml。過氧化物酶增殖劑受體(PPAR)是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子核受體超家族成員之一。目前已知其三個亞型PPAR α，-β/δ和-γ。過氧化物酶增殖劑受體Y (PPAR Y )能影響NF-κ B、信號轉(zhuǎn)錄子、激活蛋白-I介導(dǎo)的信號通路，通過抑制這些途徑的激活達(dá)到抑制靶基因啟動子激活和轉(zhuǎn)錄的目的。PPARy的N端功能區(qū)含有一個能被有絲分裂原激活的蛋白激酶磷酸化位點，若該區(qū)域突變或在磷蛋白磷酸酶共同作用下則不能產(chǎn)生磷酸化而使其活化。配體與PPAR Y結(jié)合并使之激活后，與視黃醒X受體a (retinoid Xreceptor α，RXR α )形成異二聚體，再結(jié)合于特異性DNA序列而使靶基因活化，此序列稱為PPAR特異性反應(yīng)兀件(peroxisome proliferator responsiveelement,PPRE)。含有PPRE結(jié)構(gòu)的基因包括已酰輔酶A合成酶、脂蛋白脂肪酶(LPL)、胰島素受體底物-2 (IRS-2)、瘦素以及腫瘤壞死因子-α (TNF-α)等。PPARy通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，在脂肪形成、糖脂代謝，以及在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，并與多種疾病如糖尿病、肥胖、高血壓、癌癥等的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。尤其是PPARy是脂肪細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵因子，近年來備受關(guān)注。PPARy成為了肥胖，高血壓，動脈粥樣硬化的治療靶點。發(fā)明人以PPAR Y為靶位篩選其激動劑，發(fā)現(xiàn)第1-3提取物均有不同程度的PPARy激動劑效果。以第3提取物作用最明顯的，其在O. Olmg/ml時的有效率為 90%，EC5tlO. 004mg/ml ;第 2 提取物在 O. lmg/ml 時的有效率為 100%，EC5tlO. Olmg/ml ;第I提取物的有效率不足60%。根據(jù)實驗結(jié)果，可見本發(fā)明所提供藥物組合物中所含有的第I 3提取物，均有不同程度的促進(jìn)活化的過氧化物酶體增殖物激活受體Y (PPAR-γ)表達(dá)和/或抑制核轉(zhuǎn)錄因子kB(NF-kB)表達(dá)。其中，以促進(jìn)PPAR-Y表達(dá)的作用最為顯著。因而，根據(jù)臨床實際的用藥需要，將這些提取物進(jìn)行有選擇地、任意比例的組合，即可以得到藥效物質(zhì)清楚、作用 環(huán)節(jié)明確、安全高效、質(zhì)量可控、配伍精當(dāng)?shù)膶ρ装Y因子具有抑制作用的現(xiàn)代藥物組合物。為了進(jìn)一步提高本藥物組合物的抑制炎癥因子的作用，發(fā)明人對三種有效部位的配伍規(guī)律進(jìn)行了進(jìn)一步地研究，發(fā)現(xiàn)了一些更佳的配伍比例。根據(jù)本發(fā)明的實施方式之一，上述藥物組合物中，所述第I提取物、第2提取物、第3提取物按照重量比O. 3 5. 4 O. 2 4. 2 I的比例進(jìn)行混合。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，上述藥物組合物中，所述第I提取物、第2提取物、第3提取物按照重量比O. 6 3 O. 5 2. I I的比例進(jìn)行混合。根據(jù)本發(fā)明的再一實施方式，上述藥物組合物中，所述第I提取物、第2提取物、第3提取物按照重量比1.34 1.05 I的比例進(jìn)行混合。發(fā)明人經(jīng)過3種提取物不同用藥濃度的正交試驗驗證，按照上述比例范圍配合而成的藥物組合物，在抑制炎癥因子方面表現(xiàn)穩(wěn)定，效果更加突出。本發(fā)明附加的方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
具體實施例方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能解釋為對本發(fā)明的限制。實驗例一單一提取物對NF- K B反應(yīng)原件的結(jié)合抑制作用I、實驗步驟(I)實驗材料NF-k B-RE 細(xì)胞(pGL4. 32[luc2P/NF_kappaB-RE]293A，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，MEM-α培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，96孔培養(yǎng)板(Costar,3599), Bright-Glo Luciferase突光素酶檢測試劑(Promaga),水套式CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Sanyo,日本)，Safire2高速多通道連續(xù)波長酶標(biāo)儀(TECAN，奧地利)。(2)檢測樣品采用實施例I所述方法所得提取物I 3，由北京中醫(yī)藥大學(xué)提供。(3)實驗步驟將培養(yǎng)瓶內(nèi)對數(shù)生長的NF- K B-RE細(xì)胞消化并計數(shù)，以100 μ I體系、5Χ 103/well的密度接種于96孔白色培養(yǎng)板中，孵育18-24h。對照組換以無血清MEM-α培養(yǎng)基；待篩樣品于 18h后以 100 μ g/ml>50 μ g/ml、25 μ g/ml、10 μ g/ml、5 μ g/ml 的濃度同時加入,然后與細(xì)胞共同孵育12h。樣品作用結(jié)束后，于室溫放置30min,吸棄原培養(yǎng)基,每孔加入50 μ IBright-GloLuciferase突光素酶檢測試劑,室溫避光震蕩5min,置于光化學(xué)檢測儀中，選擇ONE-Glo程序進(jìn)行檢測。該模型以熒光素酶光化學(xué)值的變化直接指示樣品對NF-K B-RE是否有阻斷作用。因此，通過計算抑制率，可確定樣品在NF-K B信號通路中對早期基因表達(dá)阻斷作用的強弱。
權(quán)利要求
1.ー種對炎癥因子表達(dá)具有抑制作用的藥物組合物，由第I提取物、第2提取物和第3提取物組成，所述提取物的制備方法如下 a)將原料藥金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草按照重量比2.5 4 2. 5 4 I. 5 2.5 0. 5 I. 5的比例混勻； b)將所述原料藥中加入水或40 60%的こ醇作為提取溶劑，所述原料藥與所述提取溶劑的固液比為I : 5 10，提取2次以上，毎次I. 5 4. 5小時，過濾后合并濾液，得到提取液和殘渣； c)將所述提取液濃縮至干，后加水混懸，上大孔樹脂，采用水、30%こ醇、60 %こ醇和95%こ醇作為洗脫液進(jìn)行連續(xù)淋洗，分別得到30%こ醇淋洗物即為所述第I提取物，60%こ醇淋洗物即為所述第2提取物、95%こ醇淋洗物即為所述第3提取物； d)將所述第1、2、3提取物混合，得到所述藥物組合物。
2.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其中所述原料藥中金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草的重量比為 3 : 3 : 2 : I。
3.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其中所述步驟b)中こ醇的濃度為55%。
4.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其中所述步驟b)中固液比為I: 6 8。
5.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其中所述步驟b)中的提取次數(shù)為4次，毎次提取時間為2 4小時。
6.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其中所述大孔樹脂為AB-8大孔樹脂。
7.如權(quán)利要求I所述的藥物組合物，其中所述第I提取物、第2提取物、第3提取物按照重量比0. 3 5. 4 0. 2 4. 2 I的比例進(jìn)行混合。
8.如權(quán)利要求I所述的藥物組合物，其中所述第I提取物、第2提取物、第3提取物按照重量比0. 6 3 0. 5 2. I I的比例進(jìn)行混合。
9.如權(quán)利要求I所述的藥物組合物，其中所述第I提取物、第2提取物、第3提取物按照重量比I. 34 1.05 I的比例進(jìn)行混合。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種對炎癥因子表達(dá)具有抑制作用的藥物組合物，由第1提取物、第2提取物和第3提取物組成，所述提取物的制備方法如下將原料藥金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草按照重量比2.5～4∶2.5～4∶1.5～2.5∶0.5～1.5的比例混勻后乙醇提取，得到提取液；所得提取液濃縮后上大孔樹脂，分別30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇洗脫，分別得到第1～3提取物；混合后得到藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物能夠有效地抑制炎癥因子表達(dá)。
文檔編號A61P29/00GK102727654SQ20121009653
公開日2012年10月17日 申請日期2012年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月1日
發(fā)明者吳圣賢, 聶波, 陳立新 申請人:北京中醫(yī)藥大學(xué)