專利名稱：提高疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性t細(xì)胞反應(yīng)的治療性疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于慢性病毒感染、癌癥的預(yù)防和治療的疫苗，尤其是一種提高疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的治療性疫苗。
背景技術(shù)：
慢性感染某些病毒可以引起癌癥。感染人乳頭瘤病毒可以引起宮頸癌，而乙型肝炎感染與肝癌的發(fā)生有關(guān)。雖然預(yù)防慢性病毒感染的疫苗，如乙型肝炎病毒(KW)疫苗,人乳頭瘤病毒疫苗(HPV)已經(jīng)在臨床應(yīng)用，但是針對(duì)已經(jīng)感染慢性病毒病人的治療性疫苗研究，仍然處于起步階段，疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞不足以殺死病毒感染細(xì)胞或癌細(xì)胞。慢性病毒感染可以抑制固有和特異性免疫反應(yīng)，而影響治療性疫苗的效率。例如病毒特異性調(diào)節(jié)T細(xì)胞可影響疫苗特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的產(chǎn)生和治療效果。HPV核殼蛋白LI誘導(dǎo)產(chǎn)生分泌白介素10的LI特異性調(diào)節(jié)T細(xì)胞。HPV早期蛋白E7，E6特異性調(diào)節(jié)T細(xì)胞存在于病人體內(nèi)。病毒蛋白如HPV 16 E5蛋白可以減少M(fèi)HC I分子在感染細(xì)胞膜上的表達(dá)；HPV16 E7蛋白影響干擾素的激活，HPV16感染部位白介素10 (IL10)，轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子P (TGF P )水平升高，這些因素均可降低CTL對(duì)病毒感染細(xì)胞的殺傷作用。因此，有效的HPV治療性疫苗依賴于以下3個(gè)因素I、在HPV感染者體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生高質(zhì)，足夠的CTL細(xì)胞和其它效應(yīng)T細(xì)胞；2、吸引CTL細(xì)胞到病毒感染部位；3、CTL細(xì)胞克服病毒感染部位的免疫抑制因素，殺傷病毒感染細(xì)胞。病毒抗原暴露的小鼠抑制治療性疫苗CTL反應(yīng)患者感染病毒后,常常產(chǎn)生對(duì)病毒抗原的無效的體液或/和細(xì)胞免疫反應(yīng)。慢性乳頭瘤病毒感染病人產(chǎn)生針對(duì)早期蛋白E6，E7和晚期蛋白LI的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。而乳頭瘤病毒治療性疫苗常常使用E7，E6和LI基因或基因產(chǎn)物治療慢性乳頭瘤病毒感染者。因此，非常有必要研究慢性病毒感染個(gè)體中對(duì)病毒抗原已有的免疫性對(duì)治療性疫苗的影響。PV LI核殼蛋白(LlVLPs)致敏(primed)的小鼠，在接種攜帶HPV16E7 CTL，人免疫缺陷病毒(HIV) CTL決定簇的PV嵌和型LI的蛋白(L1E7，L1P18)治療性疫苗后，與未致敏小鼠相比，其E7，HIV P18特異性的CTL細(xì)胞分泌IFNy受到抑制(參見圖1，圖中表明，HPV病毒蛋白致敏的個(gè)體對(duì)治療性疫苗的反應(yīng)與幼稚(naive)個(gè)體不同)。阻斷ILlO可以增強(qiáng)治療性疫苗的CTL反應(yīng)。如果PV LI蛋白致敏(primed)的小鼠是ILlO缺陷鼠，在接種攜帶HPV16E7 CTL決定簇的PV嵌和型LI的蛋白治療性疫苗后，與未致敏小鼠相比，其E7特異性的CTL細(xì)胞產(chǎn)生IFNy則不受到抑制。如果在免疫致敏小鼠時(shí)同時(shí)阻斷IL10，E7特異性CTL也不受到抑制(參見圖2A)。使用另外一抗原系統(tǒng)卵蛋白/脂多糖(0VA/LPS)，重復(fù)了上述結(jié)果(參見圖2B)。ILlO 與 LCMV (lymphocytic choriomeningitis),西尼羅河病毒(West Nile Virus)病毒感染的清除密切相關(guān)。DNA疫苗免疫時(shí)阻斷IL10，可以提高疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)，清除小鼠LCMV病毒感染。
綜上所述，ILlO與慢性病毒感染密切相關(guān)，治療性疫苗如果在免疫時(shí)阻斷IL10，可以提高疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)，清除慢性病毒感染，阻斷宮頸癌的發(fā)生?？乖禺愋缘?，分泌ILlO、IFN Y的⑶4+ T細(xì)胞可能抑制致敏小鼠對(duì)治療性疫苗的CTL反應(yīng)。如果用特異性抗體將PV核殼蛋白致敏的小鼠體內(nèi)的CD4+T細(xì)胞刪除，讓新生CD4+T細(xì)胞在體內(nèi)重新出現(xiàn)后免疫小鼠，治療性疫苗誘導(dǎo)的CTL分泌IFNy反應(yīng)則不受抑制；體外實(shí)驗(yàn)顯示，PV核殼蛋白致敏的CD4+T細(xì)胞在受到抗原刺激后，分泌大量IL10，這些細(xì)胞表達(dá)膜 GITR (Glucocorticoid induced TNF receptor related protein)(參見圖3A)。0VA/LPS致敏的小鼠CD4也分泌IL10，表達(dá)GITR (參見圖3B)。上述結(jié)果表明，致敏小鼠對(duì)治療性疫苗的CTL反應(yīng)的ILlO由抗原特異性的⑶4+GITR+T細(xì)胞分泌。這些細(xì)胞同時(shí)還分泌IFNy。致敏小鼠如果是IFN Y受體缺陷小鼠，對(duì)治療性疫苗的CTL反應(yīng)也不受抑制。體外實(shí)驗(yàn)顯示，IFNy促進(jìn)抗原特異性⑶4+GITR+T細(xì)胞分泌ILlO。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明g在解決慢性病毒感染者對(duì)現(xiàn)有預(yù)防慢性病毒感染疫苗存在抑制固有和特異性免疫反應(yīng)，影響治療性疫苗效率的問題，而提供ー種可以提高細(xì)胞毒性T細(xì)胞數(shù)量，最終提高疫苗治療效率的提高疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的治療性疫苗。本發(fā)明解決所述問題采用的技術(shù)方案是
ー種提高疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的治療性疫苗，其化學(xué)組分中含有白介素10(IL10)抑制劑和干擾素Y (IFNy )0更進(jìn)一歩
所述ILlO抑制劑含量可以是lpg-10g。所述IFN Y含量是可以lpg-10g。所述ILlO抑制劑是可以抑制ILlO功能的抗體、siRNA或特異性多肽、RNA或DNA。所述IFNy可以是蛋白、RNA或DNA。所述治療性疫苗的化學(xué)組分中可以含有抗原或/和佐劑。所述抗原可以是蛋白質(zhì)、病毒樣顆粒、多肽、DNA或RNA。所述佐劑是任何可以提高特異或非特異免疫反應(yīng)的試劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述治療性疫苗在免疫吋，由于聯(lián)合使用了 ILlO抑制劑和IFN Y，顯著提高細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，進(jìn)而可以提高疫苗治療效率。本發(fā)明可免疫正常人群，用于預(yù)防慢性病毒感染和癌癥。其優(yōu)點(diǎn)是在產(chǎn)生保護(hù)性抗體的同時(shí)，可以比常規(guī)疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，可以更好預(yù)防病毒感染或癌癥發(fā)生。本發(fā)明免疫已經(jīng)慢性感染病毒或癌癥病人，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生比常規(guī)疫苗更多的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)清除面型病毒感染細(xì)胞和癌細(xì)胞起重要作用，因此可以提高治療型疫苗效率。


圖I是LlVLPs敏的小鼠抑制嵌合型LlVLPs的CTL應(yīng)答示意圖。圖中A L1P18 VLPs ；B :LlE7VLPs。
圖2是治療性疫苗和并中和ILlO免疫抗原致敏小鼠，提高疫苗誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答示意圖。圖中A :乳頭瘤病毒核殼蛋白抗原系統(tǒng)；B 0VA/LPS抗原系統(tǒng)。圖3是抗原特異性CD4+GITR+T細(xì)胞分泌ILlO示意圖。圖中A :乳頭瘤病毒核殼蛋白抗原系統(tǒng)；B ；0VA/LPS抗原系統(tǒng)。圖4是本發(fā)明提聞CTL反應(yīng)不意圖。圖5是本發(fā)明GO吸附的抗ILlO 受體抗體，IFN Y提高0VA/LPS刺激的免疫反應(yīng)示意圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)ー步闡述本發(fā)明，目的僅在于更好地理解本發(fā)明內(nèi)容。因此，所舉之例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I.抗ILlO受體抗體(IL10抑制劑)2 μ g，與不同劑量的IFN Y (O. OOlng,0.01,0. I, Ing)溶于PBS緩沖液中，聯(lián)和使用，可以比單獨(dú)使用抗ILlO受體抗體，IFNy加20ng脂多糖(LPS)(佐劑)誘導(dǎo)的2xl05小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的IL12的分泌顯著增加(參圖4A)，表明這ー方法有利于提高細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，提示對(duì)腫瘤，慢性病毒感染者有較好的治療作用。實(shí)施例2.使用50 μ g 0VA/15 μ g LPS腹腔致敏小鼠，7天后使用溶于PBS緩沖液中 50yg 0VA/15 μ g LPS/500 μ g 抗 ILlO 受體抗體/5 μ g IFNy/ (抗原/佐劑/ILlO 抑制劑/IFN Y )腹腔免疫小鼠，6天后使用ELISP0T方法檢測(cè)OVA特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，結(jié)果顯示，免疫時(shí)聯(lián)合使用抗ILlO受體抗體和IFN Y，比単獨(dú)免疫時(shí)使用500 μ g抗ILlO受體抗體(IL10抑制劑)，顯著提高細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)(參見圖4B)，對(duì)腫瘤，慢性病毒感染者有較好治療作用。實(shí)施例3.使用納米材料Graphene Oxide吸附抗ILlO受體抗體和IFN Y。PBS溶液中 G0/anti-IL10 受體抗體 /IFN y (G030 μ g, anti-ILlO 受體抗體 15 μ g, IFN y IOng)明顯促進(jìn)20ng LPS誘導(dǎo)的脾樹突狀細(xì)胞表面CD86表達(dá)，樹突狀細(xì)胞CD86表達(dá)增高，有助于其誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的產(chǎn)生。提示對(duì)腫瘤，慢性病毒感染者有較好的治療作用。實(shí)施例4.使用納米材料Graphene Oxide吸附抗ILlO受體抗體和IFN Y。PBS溶液中的 G0/anti-IL10 受體抗體/IFNy(G030y g，anti-IL10 受體抗體 15 μ g，IFN Y 10ng)明顯促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的脾細(xì)胞分泌IL12 (參見圖5A)。用溶于PBS中的50ug 0VA/15ug LPS聯(lián)合G0/anti-IL10受體抗體/IFN Y (抗原/佐劑/ILlO抑制劑/IFN Y )皮下免疫0VA/LPS致敏的小鼠，7天后取引流淋巴結(jié)，制成單個(gè)細(xì)胞后用100ug/ml OVA刺激，18小時(shí)取上清做IFNyELISA0結(jié)果顯示，GO吸附抗ILlO受體抗體、IFN Y后，OVA特異性IFNy分泌明顯提高。提示對(duì)腫瘤，慢性病毒感染者有較好的治療作用。實(shí)施例5.抗ILlO受體抗體500 μ g, 5 μ g IFN Y , 50 μ g病毒抗原乳頭瘤病毒樣顆粒溶于PBS緩沖液聯(lián)和使用(ILlO抑制劑/ IFNy/病毒樣顆粒)，可以比50 μ g病毒抗原乳頭瘤病毒樣顆粒単獨(dú)使用誘導(dǎo)更多細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。對(duì)慢性乳頭瘤病毒感染，宮頸癌有較好的治療作用。實(shí)施例6.抗ILlO受體抗體500 μ g，5 μ g IFNy ,10 μ g含腫瘤抗原HPV16 E7質(zhì)粒DNA溶于PBS緩沖液聯(lián)和使用(ILlO抑制劑/ IFNy/質(zhì)粒)，可以比10 y g含腫瘤抗原HPV16 E7質(zhì)粒DNA單獨(dú)使用， 誘導(dǎo)更強(qiáng)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，對(duì)慢性乳頭瘤病毒感染，宮頸癌有較好的治療作用。
權(quán)利要求
1.一種提高疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的治療性疫苗，其特征在于，所述治療性疫苗的化學(xué)組分中含有白介素10 (ILlO)抑制劑和干擾素Y (IFNy )0
2.如權(quán)利要求I所述的提高疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的治療性疫苗，其特征在于，所述ILlO抑制劑含量可以是lpg-10g。
3.如權(quán)利要求I所述的提高疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的治療性疫苗，其特征在于，所述IFNy含量可以是lpg-10g。
4.如權(quán)利要求I或2所述的提高疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的治療性疫苗，其特征在于，所述ILlO抑制劑是可以抑制ILlO功能的抗體、siRNA或特異性多肽、RNA或DNA。
5.如權(quán)利要求I或3所述的提高疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的治療性疫苗，其特征在于，所述IFNy可以是蛋白、RNA或DNA。
6.如權(quán)利要求I所述的提高疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的治療性疫苗，其特征在于，所述治療性疫苗的化學(xué)組分中可以含有抗原或/和佐劑。
7.如權(quán)利要求I或6所述的提高疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的治療性疫苗，其特征在于，所述抗原可以是蛋白質(zhì)、病毒樣顆粒、多肽、DNA或RNA。
8.如權(quán)利要求I或6所述的提高疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的治療性疫苗，其特征在于，所述佐劑是任何可以提高特異或非特異免疫反應(yīng)的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于慢性病毒感染、癌癥的預(yù)防和治療的疫苗，尤其是一種提高疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的治療性疫苗。所述治療性疫苗的化學(xué)組分中含有白介素10(IL10)抑制劑和干擾素γ(IFNγ)。本發(fā)明由于聯(lián)合使用了IL10抑制劑和IFNγ，顯著提高細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，進(jìn)而可以提高疫苗治療效率。本發(fā)明可免疫正常人群，其優(yōu)點(diǎn)是在產(chǎn)生保護(hù)性抗體的同時(shí)，可以比常規(guī)疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，可以更好預(yù)防病毒感染或癌癥發(fā)生；本發(fā)明免疫已經(jīng)慢性感染病毒或癌癥病人，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生比常規(guī)疫苗更多的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)清除面型病毒感染細(xì)胞和癌細(xì)胞起重要作用，因此可以提高治療型疫苗效率。
文檔編號(hào)A61K39/29GK102631671SQ201210096650
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月5日
發(fā)明者倪國(guó)穎, 劉曉松 申請(qǐng)人:倪國(guó)穎, 劉曉松