專(zhuān)利名稱(chēng)：草麻黃、草麻黃水提物作為制備治療創(chuàng)傷性腦打擊的藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及草麻黃的用途，尤其涉及草麻黃在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
重型顱腦損傷的死亡率仍高達(dá)30 50%，致殘和后遺癥也較嚴(yán)重；推其原因，除一部分特重型腦損傷和特急性顱內(nèi)血腫難以救活外，傷后急性期腦的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)也是重要原因之一。研究證明補(bǔ)體激活成份C3a，C5a，MAC等是一組重要的炎性介質(zhì)，在感染、創(chuàng)傷、缺血再灌注損傷、自身免疫疾病等多種原因引起的急、慢性炎癥反應(yīng)中，參與介導(dǎo)了對(duì)自身組織的損傷。腦內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)三種途徑激活，最終可形成C5b-9攻膜復(fù)合體(membraneattack complex, MAC)及一系列具有重要生物學(xué)效應(yīng)的補(bǔ)體蛋白片段,①頡腦損傷BBB遭到破壞后，血漿與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抗原物質(zhì)(如髓鞘等)接觸，細(xì)胞缺血壞死后釋放亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(如線(xiàn)粒體等)，使補(bǔ)體沿著不依賴(lài)抗體的經(jīng)典途徑激活。②抗磷脂抗體與腦磷脂、鞘磷脂等形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)依賴(lài)抗體的替代途徑激活補(bǔ)體。③腦缺血毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞，可經(jīng)甘露醇結(jié)合凝集素途徑激活補(bǔ)體。腦內(nèi)補(bǔ)體激活導(dǎo)致腦損傷，可造成以下傷害直接破壞BBB，引起腦水腫；通過(guò)膜攻擊作用使紅細(xì)胞溶解，神經(jīng)元死亡；引起炎性細(xì)胞因子釋放，加重腦損傷。因此，通過(guò)調(diào)控補(bǔ)體活化保護(hù)腦組織的方法將會(huì)是人們?cè)谀X損傷的后續(xù)治療中的一條有效途徑。因此，用補(bǔ)體抑制劑阻斷補(bǔ)體活化可能成為治療炎癥的一種有效手段。目前，多種補(bǔ)體抑制劑正在研發(fā)之中，國(guó)外已成功獲得基因重組的可溶性補(bǔ)體一型受體((sCRl)，并用于治療大鼠心肌缺血再灌注損傷，療效顯著，目前已臨床試用治療急性成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)。但目前文獻(xiàn)報(bào)道的系統(tǒng)性補(bǔ)體抑制劑雖然改善了炎癥反應(yīng)，由于補(bǔ)體系統(tǒng)在機(jī)體內(nèi)的重要防御作用，同時(shí)產(chǎn)生的全身性補(bǔ)體抑制，也造成感染等潛在的副作用，此外，上述抑制劑的產(chǎn)量有限，價(jià)格昂貴，難以推廣。因此研發(fā)靶向性高具有雙向調(diào)節(jié)作用的補(bǔ)體抑制劑，提高作用特異性，從而減少可能導(dǎo)致嚴(yán)重系統(tǒng)性補(bǔ)體抑制的副作用，是目前國(guó)際研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。中醫(yī)藥學(xué)是我國(guó)的特色醫(yī)學(xué)，為數(shù)眾多的方劑和單藥的防病治病作用已被幾千年的醫(yī)學(xué)實(shí)踐所證實(shí)，它們也是尋找和開(kāi)發(fā)抗重型顱腦損傷中抗炎效應(yīng)藥物的優(yōu)質(zhì)資源。麻黃屬植物的枝莖常含有多種生物堿，其中以麻黃堿為主要有效成分，次為偽麻黃堿，此外，還含有微量的甲基麻黃堿、甲基偽麻黃堿、去甲基麻黃堿和去甲基偽麻黃堿等，麻黃作為藥用植物。麻黃屬在中國(guó)的應(yīng)用已有上千年的歷史，有解表、散寒、平喘、止咳、利水等功能和松弛平滑肌、收縮血管及中樞興奮等作用，可治風(fēng)寒感冒、風(fēng)寒咳嗽、氣喘、水腫及支氣管哮喘等病。化學(xué)研究麻黃主要成分為生物堿(1%-2%)，總生物堿的80%-85%為麻黃堿(左旋麻黃堿，L-ephedrine);其次為偽麻黃堿(D-pseudo-ephedrine,以及微量的 L-N-甲基麻黃喊(L-N-methyl-ephedrine)、D-N-甲基偽麻黃喊(D-N-methyl-pseudo-ephedrine)、去甲基麻黃喊(L-nor-ephedrine)、去甲基、偽麻黃堿(D-nor-pseudo-ephedrine)和麻黃次堿(ephedine,麻黃定)等；麻黃含有少量揮發(fā)油，油中含I-a-松油醇(I-a-terpineol，萜品烯醇)、2，3，5，6_四甲基毗嗪(2，3，5，
6-tetramethylpyrazine),尚含鞋質(zhì)等。麻黃屬藥效擴(kuò)張腎血管一增加腎血流量，阻礙腎小管對(duì)鈉離子的重吸收，抗炎、抗過(guò)敏；其有效成分偽麻黃堿、甲基麻黃堿、麻黃堿，有抑制過(guò)敏遞質(zhì)釋放，溶血素減少，呈抗補(bǔ)體，鎮(zhèn)咳、祛痰作用；有效成分萜品烯醇、麻黃揮發(fā)油，有解熱、抗菌、抗病毒作用；有效成分揮發(fā)油，有抗菌作用抗金黃色葡萄球菌，甲、乙型溶血鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎雙球菌、炭疽桿菌、白喉?xiàng)U菌、大腸桿菌、奈瑟雙球菌；抗流感病毒作用等。在中國(guó)大部地區(qū)習(xí)用的麻黃為草麻黃(產(chǎn)東北、華北及河南、陜西)、木賊麻黃(產(chǎn)華北及西北)和中麻黃(產(chǎn)華北、西北及遼寧、山東、西藏)三種植物的枝條。其中草麻黃和中麻黃產(chǎn)量較大，木賊麻黃含麻黃堿量較高(占生物堿含量的85 90%)。在四川、云南、貴州亦用麗江麻黃，西藏用山嶺麻黃入藥。膜果麻黃在某些產(chǎn)地也作麻黃入藥，但所含麻黃堿 量較低。此外，麻黃有固沙保土的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供草麻黃的新用途，即在制藥領(lǐng)域中的新應(yīng)用。實(shí)際上，本發(fā)明涉及草麻黃作為制備治療創(chuàng)傷性腦打擊的藥中的應(yīng)用。為了進(jìn)一步提高對(duì)創(chuàng)傷性腦打擊的治療效果，上述優(yōu)選采用中藥草麻黃的水提物作為制備治療創(chuàng)傷性腦打擊的藥中的應(yīng)用。草麻黃的有機(jī)相提取物再經(jīng)過(guò)相應(yīng)的化學(xué)修飾可作為冰毒的有效成分，草麻黃本身是作為一種常規(guī)中藥、應(yīng)用廣泛，且本發(fā)明作為治療創(chuàng)傷性腦打擊的藥中應(yīng)用的草麻黃有效成分是其水相提取物。具體地說(shuō)，草麻黃水提物的提取工藝優(yōu)選按如下步驟草麻黃生藥(產(chǎn)地甘肅)400g，加PH4.0蒸餾水2000ml，6(TC過(guò)夜，煮沸I小時(shí)，過(guò)濾除渣；在水相中加入2M (即2mol/L，下同)NaOH調(diào)pH值至9. 0，出現(xiàn)大量沉淀，1500g離心力離心10分鐘，棄上清液；加入無(wú)水乙醇洗沉淀三次，60°C烘干后得深褐色粗品；所得粗品粉末溶于蒸餾水中，2M HCl調(diào)pH值至4. 0，室溫下磁力攪拌I小時(shí)，離心棄沉淀，再用2MNaOH調(diào)上清液pH值至9. O,離心棄上清液，上述酸溶堿沉淀過(guò)程重復(fù)三次，最后所得堿沉淀物溶于40ml蒸餾水中，調(diào)pH值至4. 0，4°C保存；最后采用硅膠柱(GF254，青島海洋化工生產(chǎn)，粒度20(Γ260)層析，移動(dòng)相為以體積比計(jì)的丙酮正丁醇水=5 4 1，然后采用pH為4的蒸餾水洗脫，將洗脫液pH值調(diào)至9，離心出現(xiàn)沉淀，去上清留沉淀，沉淀物反復(fù)按上述酸溶堿沉淀5次，得到的沉淀物即為草麻黃水提物。補(bǔ)體激活已經(jīng)涉及人類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)諸多疾病，尤其在腦部疾病造成的腦損傷中起到重要作用，草麻黃水提物具有具有良好的補(bǔ)體抑制活性，本發(fā)明將草麻黃水提物作為醫(yī)治顱腦打擊傷后續(xù)治療的藥，開(kāi)辟了草麻黃這一中草藥的一種新用途。本發(fā)明在抑制補(bǔ)體激活方面為成功地減輕繼發(fā)性腦損害提供了廣闊的治療前景，有益于降低腦損傷患者的傷殘率和病死率；且草麻黃在我國(guó)分布廣泛、價(jià)廉易得，是中藥方劑中的常用藥材。


圖1:HE染色圖；圖I (a):生理鹽水6小時(shí)XlOO倍；(b):草麻黃組6小時(shí)XlOO ;(C):生理鹽水6小時(shí)X400 ;(d):草麻黃組6小時(shí)X400 ;(e):生理鹽水I天XlOO ; (f):草麻黃組I天X400 ； (g):生理鹽水I天X400 ； (h):草麻黃I天X400 ； (i):生理鹽水3天XlOO ；(j):草麻黃3天XlOO ;(k):生理鹽水3天X400 ;(1):草麻黃3天X400 ; (m):生理鹽水7天XlOO ； (η):草麻黃7天XlOO ； (ο):生理鹽水7天Χ400 ； (ρ):草麻黃7天Χ400。圖2 C3補(bǔ)體免疫組化檢測(cè)圖；圖3:大鼠生存曲線(xiàn)圖；圖4 :經(jīng)典途徑補(bǔ)體抑制活性圖；圖5 :替代途徑補(bǔ)體抑制活性圖； 圖6 :補(bǔ)體后段活性的抑制作用圖。為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的治療效果，發(fā)明人提供以下實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)草麻黃補(bǔ)體抑制活性成份(即草麻黃水提物)防治大鼠腦打擊傷療效的研究I、材料I. I動(dòng)物及主要試劑清潔級(jí)健康成年雌雄各半SD大鼠，200 250g由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪三院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。草麻黃中補(bǔ)體抑制活性成份(草麻黃水提物)由重慶金麥生物科技有限公司提供，小鼠抗大鼠C3抗體(sant公司)，大鼠白介素_1 β (1L-1 β )、腫瘤壞死因子一a (TNF-a) ELISA試劑盒由上海西唐生物科技有限公司。I. 2動(dòng)物分組和處理根據(jù)數(shù)字隨機(jī)原則分為正常組、假手術(shù)組、生理鹽水組、草麻黃組，每組再分為6h、ld、3d、7d四個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)大鼠6只。根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，草麻黃組給藥劑量定為12mg/kg，3天通過(guò)灌胃給藥3天，生理鹽水組只灌注等量的生理鹽水，每日劑量每天上午8:30給藥，正常組、假手術(shù)組未做任何處理。2、實(shí)驗(yàn)方法2. I動(dòng)物模型的制備顱腦致傷參照Feeney法[1]，建立大鼠實(shí)驗(yàn)重型顱腦損傷模型。用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，顱頂部脫毛、消毒；將大鼠固定于立體定向儀上，正中切開(kāi)顱，以牙科鉆在冠狀縫后3mm與矢狀縫右側(cè)3mm交會(huì)處鉆孔，擴(kuò)大骨窗至6mmX6mm(前至冠狀縫，左界為矢狀縫右旁2_)，保持硬膜完整；將重30g的圓柱狀打擊桿(打擊端直徑45mm)沿垂直固定于立體定向儀上的套管內(nèi)自20cm高度釋放，打擊中心即為鉆孔點(diǎn)；以明膠海綿局部止血，至無(wú)活動(dòng)性出血后間斷縫合頭皮。假手術(shù)組只開(kāi)骨窗，不進(jìn)行打擊。2. 2神經(jīng)功能評(píng)分將動(dòng)物模型隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、生理鹽水組、草麻黃組，觀(guān)察生理鹽水組、草麻黃組打擊后生存時(shí)間，分別于術(shù)后6h、ld、3d、7d觀(guān)察動(dòng)物神經(jīng)功能缺損評(píng)分并取材，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用Bederson[2]6級(jí)5分法正常為5級(jí)(O分);對(duì)側(cè)上肢不能完全伸展為4級(jí)(I分)；向?qū)?cè)推時(shí)抵抗力下降(置于光滑塑料板上)為3級(jí)(2分);提尾時(shí)向向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2級(jí)(3分)；自動(dòng)轉(zhuǎn)圈為I級(jí)(4分)；無(wú)自發(fā)性活動(dòng)、意識(shí)障礙為O級(jí)(5分)。假手術(shù)組不予評(píng)分。2. 3ELISA檢測(cè)致傷后上述時(shí)相點(diǎn)血清1L-1 β、TNF-a濃度2. 3. I標(biāo)本收集及處理各組大鼠在上述時(shí)相點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分后，用3%戊巴比妥鈉腹腔將大鼠麻醉后，開(kāi)胸行心臟穿刺抽血，等血清靜置30分鐘后，以3000r/min離心10分鐘，取上清液保存于-70 V冰箱待檢測(cè)。2. 3. 2IL-I β、TNF-a濃度檢測(cè)按IL-I β、TNF-a檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，酶標(biāo)儀上在450nm處測(cè)吸光值，以標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度與之相對(duì)應(yīng)的OD值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)OD計(jì)算血清中IL-I β、TNF-a濃度。2. 4免疫組織化學(xué)檢測(cè)補(bǔ)體C32. 4. I取材將大鼠斷頭處死后，取出大鼠傷側(cè)大腦組織用10%中性甲醛固定。2. 4. 2免疫組織化學(xué)按照蠟塊切片常規(guī)步驟，O. 2%的H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。小鼠抗大鼠的抗C3結(jié)合孵育后，洗滌后羊抗小鼠酶標(biāo)二抗結(jié)合，聯(lián)苯二胺(DAB )顯色以后用鹽酸乙醇分化、脫水，最后中性樹(shù)膠封片。2. 5大鼠腦組織的含水量
取大鼠大腦組織致傷處約O. 250g左右稱(chēng)濕重后，將腦組織置于100°C烤箱內(nèi)烘干24小時(shí)至完全脫水，稱(chēng)其干重，腦含水量(%) =(濕重-干重)/濕重X100%，以估計(jì)傷處腦組織水腫程度。2. 6生存率分析應(yīng)用Kaplan-Meier曲線(xiàn)分析大鼠傷后各時(shí)間點(diǎn)生存率。(二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果I、HE (蘇木精-伊紅染色法)觀(guān)察結(jié)果結(jié)果見(jiàn)圖1，6小時(shí)至7天腦組織變性壞死；血管充血、出血、水腫，小膠質(zhì)細(xì)胞增生，生理鹽水組比草麻黃組重，說(shuō)明草麻黃水提物有保護(hù)腦組織的作用。2、神經(jīng)功能評(píng)分除假手術(shù)組外，生理鹽水組與草麻黃組大鼠在麻醉清醒后均出現(xiàn)一定程度的神經(jīng)功能障礙癥狀，見(jiàn)表I。另外評(píng)分是確定造模成功的標(biāo)準(zhǔn)，5級(jí)與O級(jí)造模大鼠測(cè)定IL-I β、TNF-a濃度時(shí)需排除。表I
__6 小時(shí)____3_^__7_^_
草麻黃組 _3· 1667±0· 7527 3. 6667±0· 8165~ 4. 1667±0· 7528 2. 8333±0· 7528生理鹽水組 2. 6667±0· 5164 2. 5000±O. 5477▲ | 3· 1667±0· 4082▲ | 2· 3333±0· 5164生理鹽水組與草麻黃組比較*Ρ〈0. 05結(jié)果神經(jīng)功能評(píng)分草麻黃組高于生理鹽水組，第一天、第三天有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義，第ld、3d有顯著差異(ρ〈0.05)。麻黃水提物有保護(hù)腦組織的作用。3、炎癥因子IL-I β、TNF-α檢測(cè)結(jié)果表2炎癥因子IL-I β檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.草麻黃作為制備治療創(chuàng)傷性腦打擊的藥中的應(yīng)用。
2.草麻黃水提物作為制備治療創(chuàng)傷性腦打擊的藥中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述草麻黃水提物是按如下步驟提取的 草麻黃生藥400g，加pH4. O蒸餾水2000ml，60°C過(guò)夜，煮沸I小時(shí)，過(guò)濾除渣；在水相中加入2M NaOH調(diào)pH值至9. 0，出現(xiàn)大量沉淀，1500g離心力離心10分鐘，棄上清液；加入無(wú)水乙醇洗沉淀三次，60°C烘干后得深褐色粗品；所得粗品粉末溶于蒸餾水中，2M HCl調(diào)pH值至4. 0，室溫下磁力攪拌I小時(shí)，離心棄沉淀，再用2M NaOH調(diào)上清液pH值至9. 0，離心棄上清液，上述酸溶堿沉淀過(guò)程重復(fù)三次，最后所得堿沉淀物溶于40ml蒸餾水中，調(diào)pH值至4. 0，4°C保存；最后采用硅膠柱(GF254，青島海洋化工生產(chǎn)，粒度200 260)層析，移動(dòng)相為以體積比計(jì)的丙酮正丁醇水=5:4:1，然后采用pH為4的蒸餾水洗脫，將洗脫液pH值調(diào)至9，離心出現(xiàn)沉淀，去上清留沉淀，沉淀物反復(fù)按上述酸溶堿沉淀5次，得到的沉淀物即為草麻黃水提物。
4.如權(quán)利要求2或3所述作為制備治療創(chuàng)傷性腦打擊的藥中應(yīng)用的草麻黃水提物，其特征在于，其是按如下步驟提取的 草麻黃生藥400g，加pH4. O蒸餾水2000ml，60°C過(guò)夜，煮沸I小時(shí)，過(guò)濾除渣；在水相中加入2M NaOH調(diào)pH值至9. 0，出現(xiàn)大量沉淀，1500g離心力離心10分鐘，棄上清液；加入無(wú)水乙醇洗沉淀三次，60°C烘干后得深褐色粗品；所得粗品粉末溶于蒸餾水中，2M HCl調(diào)pH值至4. 0，室溫下磁力攪拌I小時(shí)，離心棄沉淀，再用2M NaOH調(diào)上清液pH值至9. 0，離心棄上清液，上述酸溶堿沉淀過(guò)程重復(fù)三次，最后所得堿沉淀物溶于40ml蒸餾水中，調(diào)pH值至4. 0，4°C保存；最后采用硅膠柱(GF254，青島海洋化工生產(chǎn)，粒度200 260)層析，移動(dòng)相為以體積比計(jì)的丙酮正丁醇水=5:4:1，然后采用pH為4的蒸餾水洗脫，將洗脫液pH值調(diào)至9，離心出現(xiàn)沉淀，去上清留沉淀，沉淀物反復(fù)按上述酸溶堿沉淀5次，得到的沉淀物即為草麻黃水提物。
全文摘要
草麻黃水提物作為制備治療創(chuàng)傷性腦打擊的藥中的應(yīng)用，開(kāi)辟了草麻黃這一中草藥的一種新用途。草麻黃在我國(guó)分布廣泛、價(jià)廉易得，是中藥方劑中的常用藥材，本發(fā)明在抑制補(bǔ)體激活方面為成功地減輕繼發(fā)性腦損害提供了廣闊的治療前景，有益于降低腦損傷患者的傷殘率和病死率。
文檔編號(hào)A61P25/00GK102657685SQ20121010163
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月10日
發(fā)明者馮華, 劉羞菲, 葉雷, 朱剛, 李飛, 楊康, 陳冬藝, 魏林節(jié) 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 重慶潤(rùn)澤醫(yī)療器械有限公司