專利名稱：一種三維非支撐骨修復(fù)補片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)用材料及其制備領(lǐng)域，特別涉及一種三維非支撐骨修復(fù)補片及其制備方法。
背景技術(shù)：
聚乙醇酸(PGA)和聚己內(nèi)酯(PCL)為代表，具有良好的加工性和可塑性，材料的降解性能和機械性能可在很廣的范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整，目前已成功應(yīng)用于骨再生的支架材料，心臟，血管和神經(jīng)[等組織工程支架用于支持很多再生組織。由PGA編織的組織工程支架已經(jīng)將軟骨細(xì)胞和干細(xì)胞放在材料上生成一種修復(fù)心臟的修補材料，目前已經(jīng)在體內(nèi)和體外都進(jìn)行了測試。但是由于PGA的快速降解，難以維持力學(xué)穩(wěn)定性，使其應(yīng)用收到限制。為了提高其力學(xué)性能以及避免過快的降解速度，選擇和力學(xué)性能好、降解速度慢的物質(zhì)共混改性。例如用PGA/PCL復(fù)合材料通過組織工程技術(shù)成功地制備了心臟修復(fù)材料(BarraletJE, Wallace LL, Strain AJ. Tissue Engineering. 2003,9 (5))。但是納米級的 PGA/PCL 復(fù)合材料制備骨修復(fù)補片還未見報道。目前，由靜電紡絲制備的納米組織工程修復(fù)材料由于具有極大的比表面積、高的空隙率與高的表面能等特點，能夠從納米尺度上模仿天然胞外基質(zhì)，可作為細(xì)胞生長的多孔支架，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和增殖，已廣泛應(yīng)用于制備組織工程修復(fù)材料、創(chuàng)傷敷料、藥物緩釋載體的研究。理想的骨修復(fù)材料，不僅需要較強的力學(xué)性能，而且在結(jié)構(gòu)上要具有高的孔隙率，而且需要大的孔徑，這樣才能輸送營養(yǎng)和氧氣以利細(xì)胞的增殖和分化?？紫堵屎推骄讖绞羌?xì)胞增殖以及形成三維組織的重要參數(shù)。早期，細(xì)胞可以容易地遷移到深度約為100 μ m的電紡纖維修復(fù)材料區(qū)域，但是后期對于更深的區(qū)域，細(xì)胞難以種植與滲透。這就需要較大的孔徑和空隙率為細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)以及代作為謝產(chǎn)物和氣體交換通道。本發(fā)明制備的三維非支撐骨修復(fù)補片克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，在早期細(xì)胞生長時期由于電紡纖維直徑較小，比表面積較大，吸附能力較強，易于細(xì)胞的吸附、分化與增殖。后期隨著PGA的快速降解，留出了更大的孔徑與空隙率，保證了營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，以及代謝產(chǎn)物的排出，使細(xì)胞能夠遷移到更深的地方遷移與滲透。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種三維非支撐骨修復(fù)補片及其制備方法，該補片可根據(jù)需要任意調(diào)節(jié)孔徑以及空隙率；也可用作神經(jīng)導(dǎo)管以及骨、血管、心臟、神經(jīng)等組織工程細(xì)胞支架，適合多種細(xì)胞的生長；制備方法工藝簡單，成本低，具有良好的應(yīng)用前
旦
ο本發(fā)明的一種三維非支撐骨修復(fù)補片，所述補片由具有細(xì)胞外基質(zhì)的納米纖維構(gòu)成；其中，所述納米纖維由重量比為I : 9 9 : I的聚己內(nèi)酯和聚乙醇酸共混構(gòu)成。所述聚己內(nèi)酯和聚乙醇酸的重均分子量均為3萬 150萬。
所述補片長度為1_ IOm,寬度為1_ IOcm,厚度為O. 01mm 5cm。所述納米纖維的平均直徑為IOOnm I μ m，空隙率為50 % 98%。本發(fā)明的一種三維非支撐骨修復(fù)補片的制備方法，包括(I)將聚己內(nèi)酯與聚乙醇酸按重量比I : 9 9 I溶解于有機溶劑中，配成溶液，攪拌制得透明均勻的紡絲溶液；(2)利用靜電紡絲工藝對上述紡絲溶液進(jìn)行紡絲，用平板或卷繞接收裝置進(jìn)行接收獲得纖維支架；
(3)將上述纖維支架浸泡、干燥、裁制、消毒、利用骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，制得三維非支撐骨修復(fù)補片。所述步驟(I)中的有機溶劑為六氟異丙醇、三氟乙醇、乙醇、N, N-二甲基甲酰胺、三氟乙酸中的一種或幾種。所述步驟(I)中的溶液中聚己內(nèi)酯與聚乙醇酸的總質(zhì)量占溶液質(zhì)量的2% 20%。所述步驟(2)中的靜電紡絲工藝具體工藝參數(shù)為推動泵的推動速度為I μ Ι/h 10ml/h,環(huán)境溫度為O 100°C,電壓為5kv 30kv,注射器的針頭噴口孔徑為I μ m 5_。所述步驟(3)中的補片形狀為三角形、四邊形或筒形。本發(fā)明靜電紡結(jié)束后，從接收裝置上取下纖維支架，干燥。將三維形狀的補片，剪成三維或平面形狀，用75 %乙醇浸泡Ih和PBS水洗三次，然后放在LG-DMEM液中浸泡過夜。取出樣品干燥30min后用紫外燈消毒。待骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞消化成5X107cellS/ml時取Iml的細(xì)胞懸浮在預(yù)先鋪有三維補片的培養(yǎng)板中。每隔2天更換一次培養(yǎng)基，以保持細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)。經(jīng)過7到21天后制備成具有組織工程功能的三維非支撐骨修復(fù)補片。該補片的纖維材料不光可用于非支撐骨修復(fù)補片，還可用于心臟、疝缺損、骨移植替代材料、腦瓣、腦血管、以及頸動脈處的修補材料，另外可用于嘴唇修補、鼻梁修整等人體整容。三維補片的降解曲線通過測量補片的吸水率和失重來繪制。吸水率與失重率分別由式⑴和式⑵計算
W -W
吸水率(％)=」^——100%(I)
Wd
W -W
失重(％)=」^X100%(2)
K式中W^Wd和Ww分別為樣品降解前的干重、樣品降解后的干重和濕重。有益效果(I)本發(fā)明采用的聚合物PCL與PGA具有無毒害、無刺激性、化學(xué)穩(wěn)定性好、降解、不引起炎癥、無過敏反應(yīng)、生物相容性好、不致癌、重金屬含量低、PH值小，不引起溶血和凝血等性能。而且具有所需的物理、力學(xué)性能和加工性能、并能經(jīng)受消毒處理。(2)本發(fā)明通過靜電紡絲工藝制備的補片，具有操作方法簡單、經(jīng)濟(jì)成本降低。而且還具有微纖效應(yīng)，電學(xué)性能，以及力學(xué)性能如非常大的比表面積，柔性及超強的力學(xué)行為(如硬度和抗張強度)，這些優(yōu)異的特性使納米纖維更適合醫(yī)藥衛(wèi)生，組織工程等領(lǐng)域。(3)本發(fā)明由于PGA的快速降解為細(xì)胞提供更多的生長空間，也賦予纖維更大的吸附能力。從而使納米纖維骨補片具有更優(yōu)異的生物相容性。(4)本發(fā)明不光在結(jié)構(gòu)上能夠有效模仿細(xì)胞外基質(zhì)，而且其纖維的取向排列利于骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞沿著纖維取向方向生長延伸。(5)本發(fā)明的制備方法工藝簡單，成本低，具有良好的應(yīng)用前景。


圖I是本發(fā)明的三維非支撐骨修復(fù)補片剖視圖；圖2是實施例2制備出的三維非支撐骨修復(fù)補片降解七天后的形貌圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例I(I)纖維支架的制備將PCL與PGA按質(zhì)量比9 I溶解于三氟乙酸中，配成濃度為20%溶液。用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌制得透明均勻的靜電紡絲溶液；將所制備的靜電紡原液進(jìn)行靜電紡，紡絲參數(shù)控制在電壓15kv，噴口孔徑O. 4mm，溶液流速lml/h，環(huán)境溫度20°C，平板接收裝置與噴口間距15cm。(2)非支撐骨補片制備靜電紡結(jié)束后，從平板接收裝置取下纖維支架，浸入到乙醇中48h，再進(jìn)行真空干燥。裁剪成長度5cmX寬度5cmX厚度O. 5mm三維形狀,消毒。實施例2(I)纖維支架的制備將PCL與PGA按質(zhì)量比5 5溶解于三氟乙酸中，配成濃度為10%溶液。用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌制得透明均勻的靜電紡絲溶液；將所制備的靜電紡原液進(jìn)行靜電紡，紡絲參數(shù)控制在電壓20kv，噴口孔徑O. 7mm,溶液流速2ml/h，環(huán)境溫度25°C，卷繞筒(直徑為50cm)與噴口間距5cm。卷繞速度控制在200rpm(2)非支撐骨補片制備靜電紡結(jié)束后，從卷繞筒上取下纖維支架，浸入到有乙醇中48h，再進(jìn)行真空干燥。裁剪成具有一定弧度的(長度5cmX寬度5cmX厚度O. 5mm)三維形狀,消毒。實施例3(I)纖維支架的制備將PCL與PGA按質(zhì)量比5 5溶解于六氟異丙醇中，配成濃度為5%溶液。用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌制得透明均勻的靜電紡絲溶液；
將所制備的靜電紡原液進(jìn)行靜電紡，紡絲參數(shù)控制在電壓5kv，噴口孔徑1mm，溶液流速O. 5ml/h,環(huán)境溫度25°C，卷繞筒(直徑為5cm)與噴口間距5cm。卷繞速度控制在4000rpm(2)非支撐骨補片制備 靜電紡結(jié)束后，從卷繞筒上取下纖維支架，浸入到有機溶劑乙醇中48h，再進(jìn)行真空干燥。裁剪成修復(fù)腦補片的三維形狀消毒，進(jìn)行骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)。實施例4將三維形狀的補片，用75%乙醇浸泡Ih和PBS水洗三次，然后放在LG-DMEM液中浸泡過夜。取出樣品干燥30min后用紫外燈消毒。待骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞消化成5X IO7ceIls/ml時取Iml的細(xì)胞懸浮在預(yù)先鋪有三維補片的培養(yǎng)板中。每隔2天更換一次培養(yǎng)基，以保持細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)。經(jīng)過7到21天后制備成具有組織工程功能的三維非支撐骨修復(fù)補片。實施例5磷酸鹽緩沖液(PBS)配制80gNaCl、2g KCl,14. 4g Na2HPO4,2. 4g KH2PO4 溶于800ml的去離子水中，加入一些HCL調(diào)整溶液pH值為7. 4，最后加去離子水到溶液體積為IL0緩沖溶液PH值為7. 4±0.2。在緩沖液中，添加脂肪酶，緩沖液中脂肪酶的濃度均為O. 2mg/ml。將實施例3制備的二維補片完全地沉入溶液中。將上述樣品放在振湯培養(yǎng)箱中，溫度保持在37±0. 2 C。每隔二天更新一次加脂肪酶的緩沖溶液，以保證脂肪酶的活性。每隔一定時間，從瓶中取出樣品，用蒸餾水沖洗三次，然后用濾紙將樣品表面的水吸干，稱重。將樣品在干燥至恒重后再次稱重。重復(fù)三次實驗，記錄其平均值，見下表
權(quán)利要求
1.一種三維非支撐骨修復(fù)補片，其特征在于所述補片由具有細(xì)胞外基質(zhì)的納米纖維構(gòu)成；其中，所述納米纖維由重量比為I : 9 9 : I的聚己內(nèi)酯和聚乙醇酸共混構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種三維非支撐骨修復(fù)補片，其特征在于所述聚己內(nèi)酯和聚乙醇酸的重均分子量均為3萬 150萬。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種三維非支撐骨修復(fù)補片，其特征在于所述補片長度為Imm IOm,寬度為Imm IOcm,厚度為0. Olmm 5cm。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種三維非支撐骨修復(fù)補片，其特征在于所述納米纖維的平均直徑為IOOnm lym，空隙率為50% 98%。
5.一種三維非支撐骨修復(fù)補片的制備方法，包括 (1)將聚己內(nèi)酯與聚乙醇酸按重量比I: 9 9 I溶解于有機溶劑中，配成溶液，攪拌制得透明均勻的紡絲溶液； (2)利用靜電紡絲工藝對上述紡絲溶液進(jìn)行紡絲，用平板或卷繞接收裝置進(jìn)行接收獲得纖維支架； (3)將上述纖維支架浸泡、干燥、裁制、消毒、利用骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，制得三維非支撐骨修復(fù)補片。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種三維非支撐骨修復(fù)補片的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中的有機溶劑為六氟異丙醇、三氟乙醇、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、三氟乙酸中的一種或幾種。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種三維非支撐骨修復(fù)補片的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中的溶液中聚己內(nèi)酯與聚乙醇酸的總質(zhì)量占溶液質(zhì)量的2% 20%。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種三維非支撐骨修復(fù)補片的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的靜電紡絲工藝具體工藝參數(shù)為推動泵的推動速度為lyl/h 10ml/h，環(huán)境溫度為0 100°C，電壓為5kv 30kv，注射器的針頭噴口孔徑為Iiim 5mm。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種三維非支撐骨修復(fù)補片的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的補片形狀為三角形、四邊形或筒形。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種三維非支撐骨修復(fù)補片及其制備方法，補片由具有細(xì)胞外基質(zhì)的納米纖維構(gòu)成；其中，納米纖維由重量比為1∶9～9∶1的聚己內(nèi)酯和聚乙醇酸共混構(gòu)成。制備方法包括將二種聚合物溶解于有機溶劑中，攪拌制得透明均勻的靜電紡絲溶液；利用靜電紡絲工藝對上述紡絲溶液進(jìn)行紡絲，接收獲得纖維支架；將纖維支架浸泡、干燥、裁制、消毒、利用骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，制得三維骨補片修復(fù)材料。本發(fā)明可根據(jù)需要任意調(diào)節(jié)孔徑以及空隙率；也可用作神經(jīng)導(dǎo)管以及骨、血管、心臟、神經(jīng)等組織工程細(xì)胞支架，適合多種細(xì)胞的生長；制備方法工藝簡單，成本低，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號A61L27/26GK102631703SQ20121011865
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月20日
發(fā)明者馮淑芹, 馮虎, 沈新元 申請人:東華大學(xué)