專利名稱：一種蟑螂多肽類物質(zhì)的制備方法及其抗皰疹病毒醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種具有防治單純皰疹病毒感染疾病功能的蟑螂提取物有效部位及其制備方法和醫(yī)藥用途。該有效部位為分子量小于5000道爾頓的多肽類活性物質(zhì)，其可制備成水凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑、栓劑、膜齊U、外用搽劑、軟膏劑等形式，用于制備防治抗病毒的藥物、日化用品和/或醫(yī)療器械。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒直徑約為120-150微米，含有DNA的核位于中間，向外依次由包膜、體被、衣殼三種同心結(jié)構(gòu)組成，衣殼表面為162個殼微粒組成的3 3 2軸對稱的20面體，在低溫下可生存數(shù)月，濕熱50°C或干燥90°C條件下30分鐘滅活。單純皰疹病毒可分 為I型和II型二種，I型單純皰疹病毒(HSV-I)主要感染腰以上部位的皮膚粘膜和器官。HSV-I主要通過呼吸道、皮膚和粘膜密切接觸傳播，99%的口唇粘膜、鼻前庭、眼結(jié)膜、咽喉部的炎癥及皰疹，以及口和口周圍發(fā)生的皰疹都是由HSV-I感染引起的。II型單純皰疹病毒(HSV-2)主要存在于女性宮頸、陰道、外陰皮膚及男性的陰莖、尿道等處，是引起泌尿生殖器發(fā)炎和皰疹的罪魁禍?zhǔn)住SV-2感染引起的生殖器皰疹臨床表現(xiàn)中可分為原發(fā)和復(fù)發(fā)兩種，患病部位先有燒灼感，很快在紅斑基礎(chǔ)上發(fā)生3-10個成群的紅色丘疹，伴有瘙癢，丘疹很快變成小水皰，3-5天后變?yōu)槟摪?，破潰后形成大片的糜爛和潰瘍，自覺疼痛，最后結(jié)痂愈合。整個病程可持續(xù)20天左右。男性好發(fā)于龜頭、冠狀溝、尿道口、陰莖、陰囊、大腿和臂部等處。女性好發(fā)于陰唇、陰阜、陰蒂、肛周或陰道，約90%的病人，病毒可同時侵犯子宮頸，出現(xiàn)陰道分泌物增多或下腹痛，并可并發(fā)宮頸炎和子宮炎。大多數(shù)男女病人雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)腫大。后期炎癥波及尿道、膀胱時，可出現(xiàn)排尿困難、尿痛、尿頻、嚴(yán)重者可發(fā)生尿潴留等現(xiàn)象。此外，還可能有其它癥狀同時出現(xiàn)，如發(fā)熱、全身不適、頭痛、頸項強(qiáng)直、腦膜炎和骶部神經(jīng)系統(tǒng)功能不全。HSV-2經(jīng)性器官接觸后，潛伏約2-20天(平均6天)，有免疫缺陷或免疫功能不全的人，如應(yīng)用免疫抑制劑、腎移植、嚴(yán)重?zé)齻?、重度營養(yǎng)不良、血液淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤病人等感染后癥狀加重，可出現(xiàn)皰疹性濕疹、復(fù)發(fā)性角膜潰瘍，甚至全身播散性皰疹而致命。感染
1-3周后體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體及補(bǔ)體結(jié)合抗體，殘存的病毒向周圍神經(jīng)沿神經(jīng)軸轉(zhuǎn)入骶神經(jīng)節(jié)，并長期潛伏，進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)某種誘發(fā)因素如焦慮、精神創(chuàng)傷、受涼、日曬、吹風(fēng)、創(chuàng)傷、感染、藥物過敏、高熱、月經(jīng)、妊娠等破壞身體生理平衡時，神經(jīng)細(xì)胞中出現(xiàn)病毒增殖所需的特異性轉(zhuǎn)錄酶，激活病毒而引起復(fù)發(fā)，體液抗體不能制止皰疹病毒復(fù)發(fā)，細(xì)胞免疫減弱對復(fù)發(fā)有重大影響。生殖器皰疹與生殖器惡性腫瘤關(guān)系密切，引起生殖器皰疹的HSV-2可能是宮頸癌的潛在致癌因子。研究發(fā)現(xiàn)，患過生殖器皰疹的婦女比未患過者得宮頸癌的危險性大5-10倍，并且，在宮頸癌組織、剝脫細(xì)胞或癌前期細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了 HSV-2特異抗原，從而表明II型單純皰疹病毒在宮頸癌的發(fā)生過程中起了重要作用。另外，從陰莖癌病人的活檢材料中也觀察到單純皰疹病毒樣顆粒。此外，近年來人們也注意到孕婦與HSV-2感染的嚴(yán)重性。對妊娠的患者或無癥狀排毒來說，最嚴(yán)重的是傳染給新生兒，孕婦患生殖器皰疹可導(dǎo)致胎兒畸形、流產(chǎn)、死產(chǎn)。對單純皰疹病毒感染引起的病毒性疾病目前尚無特效治療方法，臨床上主要的治療措施為采用阿昔洛韋等抗病毒藥物。此外，人白細(xì)胞干擾素也可抑制病毒繁殖，減少生殖器皰疹的復(fù)發(fā)率。然而使用此類激素類藥品、抗菌素類藥品藥物存在較大的毒副作用和易使病人產(chǎn)生耐藥性和菌群失調(diào)等不足之處。中醫(yī)將單純皰疹病毒感染疾病稱為“陰瘡”，其病性早期屬熱證、實證，為濕熱、毒火阻滯肝脈；后期則伴有肝腎不足。中藥外用藥包括外用1%氯鋅油，紫草油等方法，但治療效果不十分理想；常用方藥為清毒神圣湯加減、牛黃解毒丸、六味地黃丸加減和龍膽瀉肝湯等，但對本病癥無顯著的針對性。因此，應(yīng)用現(xiàn)代病毒藥理學(xué)技術(shù)、利用現(xiàn)代分離純化手段，從中醫(yī)藥寶庫中發(fā)掘出新的抑制單純皰疹病毒感染和防治皰疹疾病的天然藥物，尤其是創(chuàng)新型中藥是迫在眉睫的。蟑螂，為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，最常見為美洲大蠊 (Periplaneta americana Linn.)。蟑螂入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,其中把它列為中品，謂“味咸、寒；治血瘀癥堅寒熱、破積聚、喉咽閉、內(nèi)寒無子”(孫星衍等，《神農(nóng)本草經(jīng)》，商務(wù)印書館，1955:90)。“蟑螂”為其俗名首見于《本草綱目拾遺》，也稱其為石姜、滑蟲；各地方有其不同的稱法，如偷油婆、茶婆子、灶螞子等。蜚蠊科(Blattidae)是一個龐大的昆蟲家族，在地球上已生存了 3. 2億年，與恐龍屬同一時代出現(xiàn)的生物。無疑它是世界上生命力最強(qiáng)、最古老、至今繁衍最成功的昆蟲類群之一。1960年P(guān)rincis曾報道蜚蠊在世界范圍內(nèi)約有3500種，我國已有記錄的共253種(馮平章，郭予元，吳福禎，中國蟑螂種類及防治，北京中國科學(xué)技術(shù)出版社，1997年4月)。其主要分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)的室內(nèi)或野外，美洲大蠊是其中少數(shù)幾種家居蜚蠊品種之一。主要棲息于廚房、食堂、倉庫等處損害食物、衣服、書籍等，美洲大蠊作為室內(nèi)害蟲，取食并污染人的食物，傳播痢疾、傷寒、蛔蟲、蟯蟲等多種疾病。從廚房和倉庫等收集到的226只蟑螂體表及腸道內(nèi)檢出致病菌25種，感染率高達(dá)99. 9%(Pai H. H.等，Isolation ofbacteria with antibiotic resistance from householdcockroaches(Periplaneta americana and Blattella germanica), Acta Tropica,2005,93(3) :259)。蟑螂作為害蟲是城市衛(wèi)生防疫部門和海關(guān)檢疫部門重點(diǎn)防治對象之一。然而，在科技日新月異的今天，面對上千種針對它的各種殺滅劑，這一昆蟲群體依然十分活躍，這表明其體內(nèi)具有某些特殊的物質(zhì)和其特有的作用機(jī)制，此引起了國內(nèi)外一些學(xué)者的關(guān)注。近幾年來隨著我國對傳統(tǒng)中醫(yī)藥資源研究開發(fā)的重視，有些學(xué)者對這一幾千年來無法根絕的害蟲進(jìn)行了應(yīng)用開發(fā)方面的研究，并取得了可喜的成就，發(fā)掘出了這一傳統(tǒng)意義上的害蟲的正面價值。以美洲大蠊醇提物制成的產(chǎn)品“康復(fù)新”，在燒傷、燙傷等外傷創(chuàng)面的良好療效；從美洲大蠊醇提物中精制而成的“心脈龍注射液”，具強(qiáng)心升壓，改善微循環(huán)，興奮呼吸，利尿，增加心、腦、肺、腎的血流量?！靶拿}龍注射液”主治右心衰，也可治急慢性心衰、失血性休克、低血壓、室性早博、病竇性綜合癥、心腦缺血性疾病，為2004年通過中國國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)審批的國家二類新藥(中藥)。藍(lán)江林等利用大腸桿菌、溴氫菊酯、昆蟲生理鹽水、紫外線、超聲波作為誘導(dǎo)源進(jìn)行誘導(dǎo)，獲得具有抗菌活性的血淋巴，在經(jīng)誘導(dǎo)的美洲大蠊血淋巴中提取分離得到抗菌肽成分。對經(jīng)大腸桿菌誘導(dǎo)的美洲大蠊的血淋巴進(jìn)行抑菌作用測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的數(shù)量在一定的測試時間內(nèi)逐漸減少。該研究還通過電鏡觀察表明經(jīng)誘導(dǎo)的美洲大蠊學(xué)血淋巴中的抗菌肽首先使細(xì)菌的外層及細(xì)胞質(zhì)膜損傷，形成開口，導(dǎo)致內(nèi)容物外泄而死亡，最后菌體崩解成碎片。因此認(rèn)為美洲大蠊抗菌肽對大腸桿菌不是一般的抑菌作用，而是直接殺滅作用。(藍(lán)江林，周先治，卓侃等，美洲大蠊(Periplaneta americana L.)抗菌肽殺菌作用初步觀察，福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2004，33(2) :166)。對蜚蠊科昆蟲澳洲大蠊(Periplaneta australasie Fabricus)全蟲(去翅及足)的油狀醇提取物進(jìn)行的體內(nèi)篩選證明澳洲大蠊提取物對S-180及人食管癌小鼠異種移植均有顯著的抗癌作用(黃厚聘，程才芬，李淑芳，蟑螂油的抗癌作用，中草藥，1981，12(1) :35)。陳利銘發(fā)現(xiàn)蟑螂提取物AT2能增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，并能使脾臟 重量增加，在體外可增加T淋巴細(xì)胞對刀豆蛋白A (Con A)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)(陳利銘，蟑螂提取物AT2抗癌作用的臨床及實驗研究，中西醫(yī)結(jié)合雜志，1986，(11) :648)。AT2治療原發(fā)性肝癌49例，臨床觀察表明其具有緩解癥狀、使甲胎蛋白下降、延長患者生存期的功效。在臨床應(yīng)用方面，蟑螂活蟲提取物治療原發(fā)性肺癌有良好效果。廖劍英以“康復(fù)新”治療惡性纖維組織細(xì)胞瘤，取得良好效果(廖劍英，康復(fù)新治療惡性纖維組織細(xì)胞瘤I例，大理學(xué)院學(xué)報，2003，2 (3) :92)。有相關(guān)報道表明蟑螂提取物在抗腫瘤的同時具有一定的增強(qiáng)免疫功能的作用(羅志宏，占漢章，李艷紅等，中藥康復(fù)新在頭頸部惡性腫瘤治療中的作用觀察，中國中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科雜，1998，6 (3) :132 ；嚴(yán)奉祥等，中藥康復(fù)新的在體免疫藥理學(xué)特征，大理醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1991，3(1):21)。對美洲大蠊在制藥方面的研究多集中于美洲大蠊中的粗提物，李樹楠等從美洲大蠊的醇提物中除去油脂，用二氧化碳吸附后除去色素和過敏成分，用于治療心血管疾病(國家發(fā)明專利CN 1067243C);劉耀北等用乙酸提取蟑螂提取物，對肝癌細(xì)胞BEL7404和BEL7721進(jìn)行癌細(xì)胞增殖抑制試驗，發(fā)現(xiàn)粗提物可以有明顯抑制癌細(xì)胞生長的作用(國家發(fā)明專利CN 1199991C);廖吉等報道了用6號提取液從蜚蠊蟲體中制備降脂、調(diào)節(jié)膽固醇、調(diào)節(jié)血糖、防治腫瘤和預(yù)防心血管疾病、抗風(fēng)濕作用的保健食品(國家發(fā)明專利CN1230183C)；嚴(yán)少宏等闡述了一種美洲大蠊粗浸膏的優(yōu)化提取方式(國家發(fā)明專利CN1255117C);徐燕和公開了一種類似的粗浸膏制備方法(國家發(fā)明專利CN 1548058A);嚴(yán)少宏等公開了一種美洲大蠊粗浸膏綜合利用的的提取方式(國家發(fā)明專利CN 1593467A)。以上專利都未涉及美洲大蠊在制備抗單純皰疹病毒藥用方面的用途。發(fā)明人所在研究團(tuán)隊對蟑螂進(jìn)行了十余年的研究，所研發(fā)的“康復(fù)新”、“心脈隆注射液”、“肝龍注射液”取得了 3只國家新藥證書，產(chǎn)品已經(jīng)上市銷售。在我們對美洲大蠊的后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)用醇水混合溶劑提取美洲大蠊蟲體具有體外抗單純皰疹病毒的功效(王曉雨，劉光明，宋麗艷等，國家發(fā)明專利ZL 200810060885. 9)。但是，該專利公開的是以大孔樹脂作為分離材料得到的有效部位，對于多肽類分子量并無選擇性。而對于藥物的質(zhì)量控制，希望得到分子量在一定范圍內(nèi)的多肽，以便利于質(zhì)量控制。而全新設(shè)計的提取工藝，也有望發(fā)現(xiàn)新的抗病毒活性部位?；诖?，我們?yōu)榱藢ふ屹|(zhì)量更易于控制的新的抗病毒活性物質(zhì)，應(yīng)用了先進(jìn)的膜分離法對美洲大蠊提取物進(jìn)行了活性篩選下的抗單純皰疹病毒有效部位研究；并發(fā)現(xiàn)了用濾孔小于5000道爾頓(即<5KDa)的超濾膜進(jìn)行分離，能得到新的抗單純皰疹病毒活性部位。其產(chǎn)率比用大孔樹脂法得到提高，且質(zhì)量控制更為精準(zhǔn)。查新結(jié)果顯示，以往均無由美洲大蠊醇提物經(jīng)膜分離法得到的提取物作為主藥進(jìn)行配制的藥物制劑的相關(guān)報道，更無運(yùn)用此活性物質(zhì)于防治病毒感染疾病的文獻(xiàn)報道。從而構(gòu)成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從蟑螂中提取的分子量小于5000道爾頓(<5KDa)的活性物質(zhì)有效部位；本發(fā)明的另一目的是提供一種制備蟑螂中分子量<5KDa的活性物質(zhì)有效部位的方法；本發(fā)明的另一目的是提供了從蟑螂中提取的分子量<5KDa的活性物質(zhì)有效部位用于制備防治單純皰疹病毒感染類疾病藥物、日化用品和/或醫(yī)療器械的用途；
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本發(fā)明的又一目的是提供了一種含有從蟑螂中提取的分子量<5KDa的活性物質(zhì)有效部位用于制備防治單純皰疹病毒感染的多種制劑形式，包括水凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、外用搽劑、軟膏劑。根據(jù)本發(fā)明人深入的研究，發(fā)現(xiàn)蟑螂的抗病毒活性成分可以通過工藝優(yōu)化得到富集，本發(fā)明人采用水或水醇溶劑提取得到的美洲大蠊醇提物輔以孔徑大小一定的超濾膜進(jìn)行超濾，得到分子量小于5000道爾頓的有效部位(<5KDa部位)。具體而言，本發(fā)明中美洲大蠊具抗單純皰疹病毒活性的有效部位提取物的制備方法如下用水或有機(jī)溶劑和緩沖溶劑提取經(jīng)粉碎或未粉碎的美洲大蠊蟲體，濃縮提取回收溶劑，特定濃縮比/特定轉(zhuǎn)速和PH值下進(jìn)行超濾膜分離純化；得到的分子量小于5KDa的多肽類活性有效部位經(jīng)減壓濃縮至無醇味，減壓濃縮或冷凍干燥，粉碎得產(chǎn)品。本發(fā)明中的動物藥材可以是蟑螂任一部位，即可以是美洲大蠊(Periplanetaamericana)頭、身、翅，也可以是它們的混合物，優(yōu)選全蟲。可以是干燥全蟲，也可以是未經(jīng)干燥的全蟲或活體全蟲。本發(fā)明得到的美洲大蠊醇提物經(jīng)超濾膜分離得到的分子量小于5KDa的多肽類有效部位具有重要的生物活性，體外具有明顯的抑制單純皰疹病毒(HSV-1和HSV-2)感染的Veix)細(xì)胞載體復(fù)制活性。其抑制單純皰疹病毒的活性高于粗提物，并略優(yōu)于ZL200810060885. 9專利中公開的由大孔樹脂制備得到的美洲大蠊醇提物有效部位(1_60與
11-60)的抗單純皰疹病毒活性；而根據(jù)本發(fā)明的制備方法制備<5KDa部位的收率為1-60的
2倍多，為11-60的6倍。急性毒性試驗進(jìn)一步證實，ICR小鼠口服該有效部位具有相當(dāng)?shù)陌踩?。以上說明本發(fā)明所提供的以超濾膜分離制備方法得到分子量小于5000道爾頓的多肽類有效部位與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有開發(fā)成為創(chuàng)新型抗病毒天然藥物的新穎性及巨大潛力，據(jù)此完成本發(fā)明。美洲大蠊醇提物經(jīng)超濾膜分離得到的分子量小于5KDa的多肽類有效部位可以與藥學(xué)上常用的輔料或載體結(jié)合，制備得到具有抗病毒功效的水凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、外用搽劑、軟膏劑，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。本發(fā)明的美洲大蠊醇提物經(jīng)超濾膜分離得到的分子量小于5KDa的多肽類有效部位或其可藥用鹽還可以與現(xiàn)已上市的治療單純皰疹病毒感染的常用藥物聯(lián)合或交叉使用，制備得到具有治療單純皰疹病毒感染、口腔潰瘍的組合物或復(fù)方制劑?？山M合的藥劑例子包括阿昔絡(luò)韋(ACV)及其衍生物伐昔洛韋(萬乃洛韋，VCV)、泛昔絡(luò)韋(FCV)、噴昔洛韋(PCV)、阿糖腺苷(ara-T)、溴乙烯去氧鳥苷(BVDU)、膦甲酸(PFA)、更昔絡(luò)韋(GCV)，還有人白細(xì)胞干擾素等。此外，其還可以與神經(jīng)痛鎮(zhèn)痛藥物以及解熱鎮(zhèn)痛藥物合并用藥。本發(fā)明的有益之處在于本發(fā)明使用超濾膜分離法制備出美洲大蠊醇提物中分子量小于5KDa的多肽類有效部位，其原料來源方便易得、制備步驟簡便、利于產(chǎn)業(yè)化。超濾膜分離法產(chǎn)率較用大孔樹脂法大大提高，能有效降低生產(chǎn)成本，得到的產(chǎn)物具有顯著的抑制HSV-1、HSV-2病毒的藥效活性，對于開發(fā)市場廣大的抑制病毒感染類疾病藥物、日化用品、醫(yī)療器械提供了新的物質(zhì)基礎(chǔ)，通過規(guī)范化養(yǎng)殖蟑螂又能給連片特困地區(qū)的農(nóng)民增加收入、脫貧，具有潛在的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
具體實施方案為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面分別用超濾膜分離法富集美洲大蠊醇提物中分子量小于5KDa的多肽類有效部位的實施例及對單純皰疹病毒HSV-I和HSV-2抑制作用的藥理實驗結(jié)果，說明其在抗單純皰疹病毒、抑制口腔潰瘍、防治生殖器皰疹領(lǐng)域中的新用途。本發(fā)明人還測試了其對Vero細(xì)胞的半數(shù)細(xì)胞毒活性數(shù)據(jù)TD50，用以說明該化合物的毒性，從而評價其治療指數(shù)(TI)，并采用該活性物質(zhì)(<5KDa有效部位)進(jìn)行了 ICR小鼠的口服灌胃急性毒性試驗，說明該有效部位對動物的毒性，由此來反映在人體使用時的安全性。若無特別說明，本發(fā)明的百分比指的是重量百分比。必須說明，本發(fā)明的實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實施例I :美洲大蠊水提物經(jīng)超濾膜分離法富集分子量小于5KDa的多肽類有效部位(樣品A)的制備I. I美洲大蠊水提物的制備美洲大蠊藥材3公斤，加雙蒸水10000毫升，45° C浸泡提取I次，24小時；50° C浸泡提取I次，24小時；55° C浸泡提取I次，24小時。合并提取液，減壓濃縮至干，真空干燥，即得美洲大蠊水提物。I. 2采用5KDa超濾膜過濾正交試驗制備樣品A經(jīng)對影響膜分離效果的因素進(jìn)行單因素試驗，確定影響因素是轉(zhuǎn)速、時間、pH值、濃縮比，并最終確定影響因素范圍。根據(jù)單因素實驗結(jié)果，設(shè)計正交實驗方案，確定最佳工藝。I. 2. I不同pH值對超濾效果的影響將I. 2項下制備得到的美洲大蠊水提物溶解，采用一定濃度的氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)其PH值分別為8、9、10和11四個梯度，濃度為0. 3毫克/毫升(mg/mL)，轉(zhuǎn)速為2500轉(zhuǎn)/分鐘(r/min)，時間分別為10、20、30、40、50和60分鐘(min)、考察對超濾效果的影響。I. 2. 2不同濃縮比對超濾效果的影響將I. 2項下制備得到的美洲大蠊水提物溶解，采用不同量溶解，使其濃縮比分別為0. 2,0. 3,0. 4和0. 5mg/mL四個梯度，轉(zhuǎn)速為2500r/min, pH值為9，時間分別為10、20、30、40、50和60min、考察對超濾效果的影響。I. 2. 3不同轉(zhuǎn)速對超濾效果的影響將I. 2項下制備得到的美洲大蠊水提物溶解，使其轉(zhuǎn)速分別為1500、2500、3500和4500r/min四個梯度，濃度為0. 3mg/mL, pH值為9，時間分別為10、20、30、40、50和60min、、考察對超濾效果的影響。I. 2. 4不同時間對超濾效果的影響將I. 2項下制備得到的美洲大蠊水提物溶解，使其時間分別為10、20、30、40、50和60min六個梯度,濃度為0. 3mg/mL, pH值為9,轉(zhuǎn)速為2500r/min,考察對超濾效果的影響。通過以上單因素試驗，確定其主要影響因素及其范圍分別是濃縮比(0. 2,0. 3和0. 4mg/mL)、轉(zhuǎn)速(2500、3500 和 4500r/min)和 pH 值(9、10 和 11)。I. 2. 5用三因素三水平正交實驗驗證出最佳提取參數(shù)通過三因素三水平正交實驗，推斷出超濾提取最佳組合是轉(zhuǎn)速4500r/min、pH= 11 和濃度為 0. 3mg/mL。I. 2. 6分子量<5KDa多肽樣品制備 美洲大蠊水提物300毫克,用水1000毫升溶解；調(diào)制其pH值為11后,傾入置有孔徑為5KDa的超濾膜的超濾裝置中，以4500r/min轉(zhuǎn)速超濾30分鐘。濾液真空干燥，即得分子量<5KDa多肽樣品(65毫克)，收率21. 7%。 I. 2. 7SDS-PAGE電泳檢測樣品A的分子量部分儀器與試劑三羥甲基氨基甲烷(Tris) =Solarbio公司；十二烷基硫酸鈉(SDS) :Sigma公司；甘氨酸Solarbio公司；丙烯酰胺Amresco公司；N，N'-亞甲基雙丙烯酸胺Amresco公司；TEMED :Bio Basic Inc.公司；N_三輕甲基甲基甘氨酸(Tricine)Solarbio公司；0-巰基乙醇Bio Basic Inc.公司；溴酚藍(lán)生工生物工程(上海)有限公司；超低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)記(Marker，3. 3-20. IKDa) =Solarbio公司；考馬斯亮藍(lán)G-250 Solarbio公司；考馬斯亮藍(lán)R-250 Solarbio公司；3_(環(huán)己胺)-I-丙磺酸鈉(CAPS)Solarbio公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF) =Solarbio公司；HD_3型紫外檢測儀上海滬西分析儀器廠有限公司；HD-A型電腦采集器上海滬西分析儀器廠有限公司；QL-866型旋渦混合器海門其林貝爾儀器制造有限公司；Mini-PR0TEAN Tetra Cell電泳系統(tǒng)Bio-Rad公司；TS-1型脫色搖床海門其林貝爾儀器制造有限公司；In Genius LHR型凝膠成像分析系統(tǒng)Gene公司。采用SDS-PAGE法，雙垂直電泳槽，分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，濃縮膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3. 5%，供試品上樣量為10微升，濃縮膠電壓為10mA，分離膠電壓為20mA。采用考馬斯亮藍(lán)染色法。與標(biāo)準(zhǔn)低分子量蛋白質(zhì)marker比較，確認(rèn)由上述方法制備而得的美洲大蠊水提物超濾膜分離后得到的樣品95%以上為分子量<5KDa的物質(zhì)。I. 2. 8SDS-PAGE電泳檢測樣品A的性質(zhì)采用Folin-酚試劑法(Lowry法)測定樣品A中蛋白質(zhì)的含量為65%。將樣品A按照標(biāo)準(zhǔn)方法水解后與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸以HPLC法比對后確定，該分子量<5KDa多肽樣品由17種常見氨基酸組成。I. 3與用D-IOl大孔樹脂法得到的活性部位之收率比較I. 3. I按照專利ZL200810060885. 9公開的內(nèi)容制備樣品B(I)美洲大蠊藥材3公斤，加55%乙醇10000毫升，室溫浸泡提取，提取3次，每次24小時。合并提取液，減壓濃縮至干，真空干燥，即得美洲大蠊醇提物。(2)取得到的美洲大蠊醇提物20克，用30克D-IOl大孔吸附樹脂吸附拌樣，上200克D-IOl大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫至無色，續(xù)用30 %乙醇-水溶液洗脫至無色，取洗脫液10毫升減壓濃縮至干，冷凍真空干燥，即得提取物(11-30)[美洲大蠊醇提物D-101大孔吸附樹脂柱層析30%醇洗液];續(xù)用60%乙醇-水溶液洗脫至無色，取洗脫液10毫升減壓濃縮至干，冷凍真空干燥，得提取物(11-60)[美洲大蠊醇提物D-101大孔吸附樹脂柱層析60%醇洗液]，即樣品B。I. 3. 2樣品B收率將上述方法制備得到的提取物11-30與11-60稱重，分別為2. 96克和724. 9毫克。針對美洲大蠊醇提物20克而言，提取物11-60 (即樣品B)的收率為3.6%。而按照本實施例之超濾膜法，300毫克美洲大蠊粗提物經(jīng)超濾膜操作后得到65毫克有效部位，收率為21. 7% ;顯而易見，以超濾膜法進(jìn)行對多肽部位的富集，損失小，收率大大提高(為大孔樹脂方法制備得到的樣品之6倍)。I. 4與用D-101大孔樹脂法得到的活性部位的分子量之比較
I. 4. I將上述I. 3項制備得到的樣品B (11-60 [美洲大蠊醇提物D-101大孔吸附樹脂柱層析60%醇洗液])按照本實施例I. 2. 7項所描述之SDS-PAGE電泳法檢測分子量，以超低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker (3. 3-20. IKDa)為對照，可知樣品B中分子量<5KDa的物質(zhì)占52% ;而5-15KDa者為38% ;>15KDa者占10%。與美洲大蠊水提物超濾膜分離后得到的有效部位樣品95%以上為分子量<5KDa的物質(zhì)相比，用D-101大孔樹脂法得到的活性部位分子量分布較為分散，質(zhì)量控制上不如用超濾膜方法得到的分子量集中的多肽部位容易受到控制。實施例2 :美洲大蠊醇提物經(jīng)超濾膜分離法富集分子量小于5KDa的多肽類有效部位(樣品C)的制備2. I美洲大蠊醇提物的制備美洲大蠊藥材3公斤，加55%乙醇10000毫升，室溫浸泡提取，提取3次，每次24小時。合并提取液，減壓濃縮至干，真空干燥，即得美洲大蠊醇提物。2. 2分子量<5KDa多肽活性物質(zhì)(樣品C)的制備依照實施例I中正交試驗優(yōu)選出的提取參數(shù)，取2. I制備得到的美洲大蠊醇提物300毫克,用溫水1000毫升溶解；調(diào)制其pH值為11后,傾入置有孔徑為5KDa的超濾膜的超濾裝置中，以4500rpm轉(zhuǎn)速超濾30分鐘。濾液真空干燥，即得分子量<5KDa多肽樣品(69暈克)，收率23%。2. 3SDS-PAGE電泳檢測樣品C的分子量儀器與試劑同實施例I。采用SDS-PAGE法，雙垂直電泳槽，分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%,濃縮膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3. 5%,供試品上樣量為10微升,濃縮膠電壓為IOmA,分尚膠電壓為20mA。采用考馬斯亮藍(lán)染色法。與標(biāo)準(zhǔn)低分子量蛋白質(zhì)marker比較，確認(rèn)由2. 2方法制備而得的樣品C其93%以上為分子量<5KDa的物質(zhì)。2. 4SDS-PAGE電泳檢測樣品C的性質(zhì)采用Folin-酚試劑法(Lowry法)測定2. 2方法所制備出之樣品C中蛋白質(zhì)的含量為66%。將樣品C按照標(biāo)準(zhǔn)方法水解后與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸以HPLC法比對后確定，該分子量<5KDa多肽樣品由17種常見氨基酸組成。實施例3 :美洲大蠊丙酮-水提物經(jīng)超濾膜分離法富集分子量小于5KDa的多肽類有效部位(樣品D)的制備3. I美洲大蠊丙酮-水提物的制備
美洲大蠊藥材3公斤，加70%丙酮水溶液10000毫升，室溫浸泡提取，提取3次，每次24小時。合并提取液，減壓濃縮至干，真空干燥，即得美洲大蠊丙酮-水提物。3. 2分子量<5KDa多肽樣品(樣品D)的制備依照實施例I中正交試驗優(yōu)選出的提取參數(shù)，取2. I制備得到的美洲大蠊丙酮-水提物300毫克，用溫水1000毫升溶解；調(diào)制其pH值為11后，傾入置有孔徑為5KDa的超濾膜的超濾裝置中，以4500rpm轉(zhuǎn)速超濾30分鐘。濾液真空干燥，即得分子量<5KDa多肽樣品(67毫克)，收率為22. 3%。3. 3SDS-PAGE電泳檢測樣品D的分子量儀器與試劑同實施例I。采用SDS-PAGE法，雙垂直電泳槽，分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%,濃縮膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3. 5%,供試品上樣量為10微升,濃縮膠電壓為IOmA,分尚膠電壓為20mA。采用考馬斯亮藍(lán)染色法。與標(biāo)準(zhǔn)低分子量蛋白質(zhì)marker比較，確認(rèn)由3. 2方法制 備而得的樣品D其90%以上為分子量<5KDa的物質(zhì)。3. 4SDS-PAGE電泳檢測樣品D的性質(zhì)采用Folin-酚試劑法(Lowry法)測定3. 2方法所制備的樣品D中蛋白質(zhì)的含量為61%。將樣品D按照標(biāo)準(zhǔn)方法水解后與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸以HPLC法比對后確定，該分子量<5KDa多肽樣品由17種常見氨基酸組成。實施例4 :微量細(xì)胞病變抑制(CPE)法研究從美洲大蠊提取的各種樣品對單純皰疹病毒HSV-2的抑制作用4. I實驗?zāi)康囊訦SV-2病毒感染的Vero細(xì)胞為模型，篩選抗單純皰疹病毒藥物，其中樣品來自實施例1-3中制得的四種樣品(樣品A :1. 2. 6所述之美洲大蠊水提物經(jīng)超濾膜制備的分子量<5KDa多肽樣品；樣品B :1. 3. I所述之美洲大蠊醇提物D-101大孔吸附樹脂柱層析60%醇洗液(11-60);樣品C :實施例2中制得的美洲大蠊醇提物中分子量<5KDa多肽樣品；樣品D :實施例3中制得的美洲大蠊丙酮-水提物中分子量<5KDa多肽樣品)。4. 2材料和儀器4. 2. I病毒和細(xì)胞4. 2. I. I病毒HSV_2病毒由南通市疾控中心提供；4. 2. I. 2細(xì)胞Vero細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。4. 2. 2 試劑4. 2. 2. IRPMI 1640 培養(yǎng)基=Gibco 公司產(chǎn)品；4. 2. 2. 2L-谷胺酰氨AMRESC0產(chǎn)品，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司分裝；4. 2. 2. 3MTT AMRESC0產(chǎn)品，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司分裝；4. 2. 2. 4胎牛血清=Gibco公司產(chǎn)品；4. 2. 2. 5青霉素鈉江西東風(fēng)藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；4. 2. 2. 6硫酸鏈霉素華北制藥股份有限公司產(chǎn)品；4. 2. 2. 7陽性對照藥阿昔洛韋(ACV)，湖北科益藥業(yè)股份有限公司，0. 25克/支。4. 2. 3 儀器4. 2. 3. ICO2培養(yǎng)箱美國Shellab公司產(chǎn)品；4. 2. 3. 2XD-2倒置顯微鏡重慶光電儀器有限公司產(chǎn)品；
4. 2. 3. 3生物安全柜美國LABC0NC0公司產(chǎn)品；4. 2. 3. 4Synergy HT 酶標(biāo)儀美國 BI0-TEK 公司產(chǎn)品；4. 2. 3. 5LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。4. 3 方法4. 3. I病毒毒力測定在長成單層的細(xì)胞中加入10倍連續(xù)倍比稀釋的病毒液，從KT1到10_9等共9個濃度，在37°C、5%二氧化碳、100%相對濕度條件下培養(yǎng)48小時，然后用MTT法比色，測定病毒的毒力，以TCID5tl表示。4. 3. 2樣品毒性測定用培養(yǎng)基將藥物連續(xù)稀釋成4個濃度(200微克/毫升，100微克/暈升，10微克/暈升，I微克/暈升)，分別加入細(xì)胞已長成單層的96孔培養(yǎng)板中，每孔200微升,置于37°C、5*%二氧化碳、100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)72小時后用MTT [3-(4，5- 二甲基噻唑-2)-2，5- 二苯基四氮唑溴鹽]法測定樣品對細(xì)胞的毒性，計算半數(shù)中毒濃度(TD5tlX4. 3. 3細(xì)胞病變抑制法測定樣品對病毒生長抑制作用細(xì)胞接種96孔培養(yǎng)板，37°C、5%二氧化碳、100%相對濕度培養(yǎng)24小時，加入2X IOOTCID5q的病毒100微升，吸附2小時，傾出病毒，分別加入最大濃度為無毒濃度的不同濃度樣品，每濃度3孔，同時設(shè)正常細(xì)胞對照和病毒感染對照，37 °C、5 % 二氧化碳、100 %相對濕度培養(yǎng)72小時后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變。以五級標(biāo)準(zhǔn)作為判斷細(xì)胞病變的標(biāo)準(zhǔn)“ 一”指細(xì)胞無變化，分值為8分；“ + ”指25%以下細(xì)胞出現(xiàn)病變，分值為6分；“ + + ”指25% 50%細(xì)胞出現(xiàn)病變，分 值為4分；“ + + + ”指50% 75%細(xì)胞出現(xiàn)病變，分值為2分；“ + + + + ”指75%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變，分值為0分。計算半數(shù)抑制濃度(IC5tl),同時用阿昔洛韋(ACV)作為陽性對照藥。計算樣品治療指數(shù)TI =半數(shù)中毒濃度(TD5tl)/半數(shù)抑制濃度(IC5tlX4. 4實驗結(jié)果樣品A-D及陽性對照藥物阿昔洛韋對HSV-2復(fù)制的半數(shù)抑制濃度和治療指數(shù)如表
一所示。表一.樣品A-D及陽性對照藥物阿昔洛韋對HSV-2的抑制作用
樣品_TD5p (微克/毫升)IC5c (微克/毫升) TI (治療指數(shù))
A >200 3.6 >55B >100 4.2 >23C >200 3.2 >62D >200 2.7 >74陽性對照藥(阿昔洛韋)_>400_024_>1666_注TD5(i :樣品對細(xì)胞生長的半數(shù)抑制濃度(微克/毫升);IC5(I :樣品對病毒復(fù)制的半數(shù)抑制濃度(微克/毫升)；TI :治療指數(shù)，TI=TD50/IC50O4. 5 結(jié)論上述試驗結(jié)果說明，美洲大蠊水提物經(jīng)超濾膜制備的分子量<5KDa多肽樣品(樣品A)、美洲大蠊醇提物中分子量<5KDa多肽樣品(樣品C)、美洲大蠊丙酮-水提物中分子量<5KDa多肽樣品(樣品D)對II型單純皰疹病毒HSV-2有強(qiáng)效的的抑制作用，且三者對HSV-2的抑制強(qiáng)度略優(yōu)于美洲大蠊醇提物D-IOl大孔吸附樹脂柱層析60%醇洗液(樣品B)，而其治療指數(shù)則明顯高于樣品B ;說明美洲大蠊中抑制單純皰疹病毒HSV-2的有效成分極可能集中在分子量<5KDa多肽樣品范圍中，從而可以預(yù)期其進(jìn)一步開發(fā)成為治療生殖器皰疹疾病的天然藥物，或與已上市之治療HSV-2病毒感染藥物聯(lián)合使用。根據(jù)實施例1-3中對<5KDa多肽樣品及大孔樹脂制備的樣品之收率和質(zhì)量控制難易程度等可知用超濾法對水或有機(jī)溶劑提取的美洲大蠊提取物中分子量<5KDa多肽樣品比D-101大孔樹脂提取的抗HSV-2活性部位的抑制活性強(qiáng)、收率更高，有效克服了 D-101大孔樹脂提取物質(zhì)量控制不易的難題，從而具有顯著的優(yōu)越性。此說明用超濾法制備的美洲大蠊提取物中分子量<5KDa多肽樣品更有希望發(fā)展成為質(zhì)量可控、安全有效的抗HSV-2和防治生殖器皰疹病毒的藥品、日化用品和/或醫(yī)療器械。實施例5 :微量細(xì)胞病變抑制(CPE)法研究從美洲大蠊中制備得到的各樣品對HSV-I的抑制作用5. I實驗?zāi)康囊訦SV-I病毒感染的Vero細(xì)胞為模型，篩選抗HSV藥物，其中樣品來自實施例1-3中制得的四種樣品(樣品A :1. 2. 6所述之美洲大蠊水提物經(jīng)超濾膜制備的分子量<5KDa多肽樣品；樣品B :1. 3. I所述之美洲大蠊醇提物D-101大孔吸附樹脂柱層析60%醇洗液(11-60);樣品C :實施例2中制得的美洲大蠊醇提物中分子量<5KDa多肽樣品；樣品D :實施例3中制得的美洲大蠊丙酮-水提物中分子量<5KDa多肽樣品)。5. 2細(xì)胞培養(yǎng)和病毒傳代5. 2. 1HSV-1病毒由南通市疾控中心提供；材料和儀器同實施例4。5. 3實驗方法5. 3. I采用MTT法測定樣品A-D及陽性對照對Vero細(xì)胞生長的抑制作用(I)將Vero細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活小牛血清、100U/毫升青霉素和100微克/毫升的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置37°C、5%二氧化碳、100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將HSV-I加入長有的Veix)的細(xì)胞瓶中，置37°C、5%二氧化碳、100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清，置低溫下保存。(2)取對數(shù)生長期的Veix)細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成IX IO5/毫升，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100微升，在37°C、5%二氧化碳、100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后加入用培養(yǎng)基稀釋的實施例1-3制備得到的樣品A-D及陽性對照阿昔洛韋(ACV)，濃度分別為400微克/暈升,200微克/暈升,40微克/暈升和8微克/暈升。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)72小時后，每孔加入MTT試劑10微升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄去培養(yǎng)基，每孔加入二甲亞砜200微升，用振蕩器振蕩20分鐘，在570nm波長下用酶標(biāo)儀測定OD值，以只加培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔為空白對照。實驗重復(fù)三次，根據(jù)不同濃度下對細(xì)胞生長的抑制率，計算對細(xì)胞生長的半數(shù)中毒濃度(TD5tlX抑制率(%)=(空白對照OD值-實驗組OD值)/空白對照OD值X 100%。5. 3. 2用微量細(xì)胞病變抑制法測定樣品對病毒生長抑制作用取對數(shù)生長期的Veix)細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成IX IO5/毫升，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37°C，5% 二氧化碳，100%相對濕度培養(yǎng)24小時，加入IOOTCId50的病毒100、微升，傾出病毒，分別加入最大濃度為無毒濃度的不同濃度的實施例1-3制備得到的樣品A-D,同時設(shè)正常細(xì)胞對照和病毒感染對照，37°C，5%二氧化碳，100%相對濕度培養(yǎng)48小時后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變。以五級標(biāo)準(zhǔn)作為判斷細(xì)胞病變的標(biāo)準(zhǔn)，一細(xì)胞無變化，分值為8分；+ :25%以下細(xì)胞出現(xiàn)病變，分值為6分；++ :25% 50%細(xì)胞出現(xiàn)病變，分值為4分；+ + + :50% 75%細(xì)胞出現(xiàn)病變，分值為2分；+ + + +:75%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變，分值為0分。計算半數(shù)抑制濃度(IC5tl),同時用阿昔洛韋作為陽性對照藥。計算樣品治療指數(shù)TI =半數(shù)中毒濃度(TD5tl)/半數(shù)抑制濃度(IC5tlX5. 4實驗結(jié)果實施例1-3制備得到的樣品A-D均能顯著抑制HSV-I的復(fù)制，其對HSV-I的半數(shù)抑制濃度和治療指數(shù)如表二所示。表二.樣品A-D及陽性對照藥物阿昔洛韋對HSV-I的抑制作用
權(quán)利要求
1.一種從蟑螂中提取的活性物質(zhì)，其特征是所述活性物質(zhì)是分子量小于5000道爾頓的多肽。
2.權(quán)利要求I所述之從蟑螂中提取的活性物質(zhì)用于制備防治單純皰疹病毒感染性疾病的藥物用途，其特征是所述藥物用途通過藥物制劑、日化用品、醫(yī)療器械形式體現(xiàn)；所述單純皰疹病毒是指I型單純皰疹報病毒HSV-I和/或II型單純皰疹病毒HSV-2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的藥物用途，其特征是所述藥物制劑、日化產(chǎn)品、醫(yī)療器械的形式是水凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、外用搽劑、軟膏劑。
4.一種制備權(quán)利要求I所述活性物質(zhì)的方法，其特征是用超濾膜分離法截取蟑螂提取物中分子量小于5000道爾頓的物質(zhì)；其中蟑螂提取物是指蜚蠊科昆蟲蟑螂蟲體經(jīng)溶劑及緩沖溶液提取而得，溶劑是指水或有機(jī)溶劑。
5.一種具有抗單純皰疹病毒感染的藥物組合物，其特征是該藥物組合物含有根據(jù)權(quán)利要求I的活性物質(zhì)、藥用輔料及可藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蟑螂多肽類物質(zhì)的制備方法及其抗皰疹病毒醫(yī)藥用途。具體而言，本發(fā)明涉及一種具有防治單純皰疹病毒感染類疾病功能的蟑螂提取物有效部位及其制備方法和醫(yī)藥用途。本發(fā)明的美洲大蠊提取物有效部位是分子量小于5000道爾頓的多肽類物質(zhì)，由蜚蠊科美洲大蠊(Periplaneta americana)蟲體鮮品或干品經(jīng)水或有機(jī)溶劑和緩沖液提取后再經(jīng)膜分離法精制而成，該有效部位多肽類活性物質(zhì)具有明顯的抗單純皰疹病毒HSV-1和HSV-2活性，可制備成水凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、外用搽劑、軟膏劑形式，用于制備預(yù)防和治療單純皰疹病毒感染的藥物、日化用品或醫(yī)療器械。
文檔編號A61K38/00GK102743739SQ20121013742
公開日2012年10月24日 申請日期2012年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月6日
發(fā)明者巫秀美, 張成桂, 戴志明, 楊榮新, 趙昱 申請人:大理學(xué)院