專(zhuān)利名稱(chēng)：植物類(lèi)抗癌靶向納米制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體是涉及ー種植物類(lèi)抗癌靶向納米制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
植物類(lèi)藥物中的紫杉醇、多西紫杉醇屬于廣譜抗癌藥，已廣泛用于治療乳腺癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤。在應(yīng)用過(guò)程中這類(lèi)抗癌藥主要面臨的問(wèn)題包括溶解度低，毒副作用高，生物利用率低，易產(chǎn)生抗藥性等。為了解決溶解度低的問(wèn)題，這類(lèi)藥的傳統(tǒng)制劑需要大量使用增溶劑如聚氧こ烯蓖麻油。然而，該輔料不僅可以引起許多副反應(yīng)，如血管舒張，血壓過(guò)低，呼吸困難，以及嚴(yán)重過(guò)敏等癥狀，而且，該輔料也不具備對(duì)癌細(xì)胞的靶向性，抗癌藥的生物利用度低下，輔料的毒副作用極為顯著。為了解決輔料毒副作用的問(wèn)題，人們發(fā)明了納米給藥系統(tǒng)，如紫杉醇的蛋白給藥系統(tǒng)和脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)(US Patent 6，096，331，US Patent 5，916，596)。這類(lèi)納米給藥系統(tǒng)利用紫杉醇和載體的疏水作用，形成納米小球，以增加紫杉醇的溶解性；由于載體白蛋白和脂質(zhì)體的生物相容性，在紫杉醇注射過(guò)程中對(duì)人體不產(chǎn)生任何毒副作用，因而減小了病人由于輔料的毒副反應(yīng)所承受的痛苦。由于這類(lèi)載體的平均粒徑在130-150納米之間，表面的親水基團(tuán)不豐富，它們?cè)隗w內(nèi)循環(huán)過(guò)程中易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬和清除，然后導(dǎo)向肝、脾、肺、骨髓等單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(MPS)，同時(shí)，在這些器官中也可通過(guò)EPR (Enhanced Permeability retention)增強(qiáng)滲透和保留作用聚集，因此,現(xiàn)有的納米抗癌藥給藥系統(tǒng)不僅可以增加抗癌藥的溶解度，而且對(duì)肝、肺等巨噬細(xì)胞豐富的器官有一定的靶向性。這類(lèi)通過(guò)EPR作用的靶向性被稱(chēng)之為被動(dòng)靶向。以紫杉醇/白蛋白納米給藥系統(tǒng)為例，這個(gè)系統(tǒng)是由白蛋白與紫杉醇結(jié)合形成的納米微粒，這些微粒的大小大在100到150納米之間，只有人體紅細(xì)胞的百分之一。在制備過(guò)程中，紫杉醇溶于有機(jī)溶劑如三氯甲烷，在高壓均質(zhì)條件下紫杉醇溶液與白蛋白溶液共混，通過(guò)與白蛋白結(jié)構(gòu)中的疏水部分結(jié)合形成疏水的內(nèi)核，白蛋白的親水部位則將其疏水內(nèi)核包裹，形成一個(gè)保護(hù)層起到穩(wěn)定所包裹的藥物和納米顆粒的作用。在系統(tǒng)給藥時(shí)，由于體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用，紫杉醇/白蛋白納米粒在體內(nèi)循環(huán)過(guò)程中逐步累積到肝，肺，脾等部位，因此，其對(duì)這些部位的腫瘤細(xì)胞有較好的被動(dòng)靶向治療作用；然而，對(duì)其它部位如乳腺等部位則其靶向效果并不好；此外，紫杉醇和白蛋白主要是通過(guò)疏水作用形成復(fù)合物，當(dāng)其被注射到體內(nèi)后，由于體內(nèi)存在大量的白蛋白，體內(nèi)的白蛋白很容易置換結(jié)合在納米粒中的紫杉醇；復(fù)合物中的紫杉醇也可以迅速與體內(nèi)的白蛋白結(jié)合，因?yàn)檎＜?xì)胞既可以吞噬普通的白蛋白，也可以吞噬帶有紫杉醇的的白蛋白，所以，紫杉醇/白蛋白復(fù)合物對(duì)正常細(xì)胞的毒性也會(huì)較高。紫杉醇/脂質(zhì)體納米給藥體系通過(guò)脂質(zhì)體對(duì)紫杉醇的包埋，增加紫杉醇的溶解度，在注射過(guò)程中由于脂質(zhì)體的生物相容性，對(duì)病人產(chǎn)生的毒副作用較小。然而，在體內(nèi)脂 質(zhì)體立即與紫杉醇分離，紫杉醇與體內(nèi)的白蛋白結(jié)合。與聚氧こ烯蓖麻油比較，雖然兩者都可増加紫杉醇的溶解度，藥物動(dòng)力學(xué)相似，但是脂質(zhì)體的毒副作用則比后者大幅降低。從上面的描述可以看到，已有的抗癌藥給藥系統(tǒng)的主要缺點(diǎn)為1、載體在體內(nèi)不穩(wěn)定，如脂質(zhì)體在體內(nèi)很快分散，抗癌藥與體內(nèi)的循環(huán)系統(tǒng)中的白蛋白結(jié)合，這樣載體實(shí)際上只起到對(duì)抗癌藥增溶的作用而在體內(nèi)不能起到藥物的載體和載體的靶向的作用；2、被動(dòng)革巴向性由于載藥納米粒子的大小在100到150納米之間,在體內(nèi)循環(huán)過(guò)程中，大部分載藥納米粒子很容易被體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞所吞噬，在肝、脾、肺等組織內(nèi)聚集，對(duì)這些組織內(nèi)的腫瘤有較好的療效作用，但對(duì)其它部位的腫瘤則療效有限；3、抗癌藥不能與載體形成穩(wěn)定的復(fù)合物，藥物容易游離到血液中與其中的白蛋白結(jié)合；4、納米抗癌藥在體外的溶液中的穩(wěn)定性只有數(shù)小時(shí)到一天的時(shí)間，抗癌藥與白蛋白形成的復(fù)合物緩慢解離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之ー是提供ー種植物類(lèi)抗癌靶向納米制劑，該植物類(lèi)抗癌靶向納米制劑穩(wěn)定性好，并具有生物靶向性。 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下ー種植物類(lèi)抗癌靶向納米制劑，其重量百分比的組成如下人血白蛋白43 — 60% ；植物類(lèi)抗癌藥物I. 5 — 7. 5% ;分子量為3000-1. 8xl06Da 的透明質(zhì)酸24 — 40% ；納米粒子穩(wěn)定劑3· 5 — 15%，其余組分為水(通常為I — 10%),構(gòu)成總和為100%。優(yōu)選地，所述植物類(lèi)抗癌靶向納米制劑，其重量百分比的組成如下人血白蛋白45 — 50% ；植物類(lèi)抗癌藥物4 一 5% ；分子量為3000-1. 8xl06Da 的透明質(zhì)酸32 — 38% ；納米粒子穩(wěn)定劑5 — 7%，其余組分為水(通常為1_7%)。優(yōu)選地，所述透明質(zhì)酸的分子量為5000-2. OxlO5Da0優(yōu)選地，所述納米粒子穩(wěn)定劑是d-α生育酚琥珀酸聚こニ醇酯(TPGS)、ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0嵌段共聚物或PVP。這些聚合物的疏水部分與紫杉醇、多西紫杉醇結(jié)合并進(jìn)入白蛋白的疏水區(qū)域，親水部分則在白蛋白表面形成ー層親水層，起到穩(wěn)定白蛋白和紫杉醇所形成的復(fù)合物的作用。優(yōu)選地，所述植物類(lèi)抗癌藥物是紫杉醇、多西紫杉醇、喜樹(shù)堿及其衍生物。靶向分子透明質(zhì)酸既可以通過(guò)非共價(jià)鍵與白蛋白形成復(fù)合物起到靶向作用，也可以通過(guò)共價(jià)鍵與白蛋白形成共軛物起到靶向作用。通過(guò)共價(jià)鍵制備靶向分子和藥物載體的共軛物有兩種エ藝可以使用，其中先制備靶向分子的活性酷再將靶向分子接到藥物載體上比直接通過(guò)偶聯(lián)將靶向分子接到藥物載體上反應(yīng)更利于控制，所形成的共軛物是由靶向分子和白蛋白通過(guò)酰胺鍵形成的而非白蛋白上的氨基和羧基通過(guò)酰胺鍵形成的。本發(fā)明的另ー目的是提供上述植物類(lèi)抗癌靶向納米制劑的制備方法。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下植物類(lèi)抗癌靶向納米制劑的制備方法，包括以下步驟
(I)制備透明質(zhì)酸-白蛋白共軛物將透明質(zhì)酸和人血白蛋白加入到無(wú)菌水中溶解，調(diào)節(jié)溶液pH為5. 0-6.0，將1-2倍透明質(zhì)酸摩爾數(shù)的EDCI (I-こ基-3-(3-ニ甲胺丙基)碳ニ亞胺鹽酸鹽)加入到上述溶液中，在室溫下攪拌過(guò)夜，反應(yīng)完畢后，透析除去未鍵合的透明質(zhì)酸、未反應(yīng)的EDCI和EDCI的反應(yīng)產(chǎn)物，冷凍干燥后用PBS緩沖液溶解得到人血白蛋白/透明質(zhì)酸溶液；或?qū)⑼该髻|(zhì)酸完全溶于O. IM的MES(2-(N-嗎啡啉)こ磺酸)緩沖液中，然后加入的偶聯(lián)劑EDCI和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，室溫下攪拌反應(yīng)，得到透明質(zhì)酸琥珀酰亞胺活性脂；再將透明質(zhì)酸琥珀酰亞胺活性脂加入到人血白蛋白的水溶液中，調(diào)節(jié)溶液PH 7.0-7. 5，室溫下攪拌反應(yīng)；反應(yīng)完畢后透析除去未反應(yīng)的原料和反應(yīng)副產(chǎn)物，冷凍干燥后，得透明質(zhì)酸-人血白蛋白共軛物；將透明質(zhì)酸-人血白蛋白共軛物用PBS緩沖液溶解，得到人血白蛋白/透明質(zhì)酸溶液；或?qū)⑷搜椎鞍變龈煞?，透明質(zhì)酸溶于PBS緩沖液中，得到人血白蛋白/透明質(zhì)酸溶 液；(2)配制植物類(lèi)抗癌藥溶液將植物類(lèi)抗癌藥物和納米粒子穩(wěn)定劑溶于有機(jī)溶劑中，得到抗癌藥溶液；( 3 )在高速均質(zhì)、高壓均質(zhì)或超聲處理?xiàng)l件下，將上述抗癌藥溶液加入到人血白蛋白/透明質(zhì)酸溶液中，然后除去有機(jī)溶劑；過(guò)濾冷凍干燥得到植物類(lèi)抗癌靶向納米制劑。在其中一些實(shí)施例中，所述有機(jī)溶劑為ニ氯甲烷、氯仿、ニ氯甲烷與こ醇混合物、或氯仿與こ醇混合物。更優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑為氯仿或こ醇與氯仿的混合物。步驟(3)中，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀加熱至30_45°C減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶剤。本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，透明質(zhì)酸與白蛋白既可以通過(guò)離子鍵和高分子鏈間的鏈纏結(jié)作用形成高分子的絡(luò)合物，又可以通過(guò)共價(jià)鍵形成更為穩(wěn)定的共軛聚合物，透明質(zhì)酸在納米粒子的表面形成ー層親水層，以避免納米材料中的白蛋白與血液中的人血白蛋白發(fā)生作用，同時(shí)避免納米粒子被循環(huán)系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞所吞噬。人血白蛋白、抗癌藥和納米穩(wěn)定劑通過(guò)特定的エ藝和制備條件形成緊密和穩(wěn)定的疏水納米核心，在優(yōu)選的エ藝條件采用高壓均質(zhì)的方法可制得的粒徑在IOOnm左右的靶向納米制劑。我們選用透明質(zhì)酸另ー個(gè)原因是因?yàn)镠A是自然發(fā)生的生物聚合物，在我們的身體的許多器官中都有它的存在。HA具有生物相容性和生物可降解性而且是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成之一。⑶44是HA在細(xì)胞表面的主要受體，它在上皮細(xì)胞，造血細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞等正常細(xì)胞上分布較少，而在癌細(xì)胞如淋巴癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、大腸癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞上則過(guò)分表達(dá)。因此，癌細(xì)胞對(duì)HA的親和作用和細(xì)胞吞噬作用則遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞。因此,我們可以利用HA對(duì)癌細(xì)胞表面上的CD44的特異結(jié)合，以HA為靶向分子，以CD44為受體，設(shè)計(jì)出對(duì)癌細(xì)胞具有生物靶向性的納米釋藥載體。為了解決已有釋藥系統(tǒng)的問(wèn)題，本發(fā)明設(shè)計(jì)的釋藥體系具備以下的組分和結(jié)構(gòu)I、藥物載體如人血白蛋白，既能用于藥物的包埋并通過(guò)形成納米材料增加藥物的溶解性，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的循環(huán)，又能與靶向分子結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物；2、靶向分子如透明質(zhì)酸，用于目標(biāo)腫瘤細(xì)胞表面的受體如CD44的生物靶向，同時(shí)在白蛋白載體表面形成ー層親水的凝膠層，既保護(hù)納米粒子不被體內(nèi)單核細(xì)胞吞噬，阻擋載藥納米粒子與體內(nèi)游離的白蛋白作用，防止抗癌藥被游離的白蛋白置換，又可作為藥物分子通過(guò)擴(kuò)散和溶解機(jī)制逃離納米粒子的最后一道屏障；3、納米粒子穩(wěn)定劑，如疏水分子膽固醇，ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0崁段聚合物，d-α生育酚琥珀酸聚こニ醇酷、PVP等，這類(lèi)分子不僅可以通過(guò)疏水作用輔助抗癌藥入紫杉醇與白蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物，也可以利用其親水高分子鏈防止循環(huán)系統(tǒng)中的白蛋白接近靶向納米粒子以減少抗癌藥被置換；4、抗癌藥如紫杉醇，多西紫杉醇，喜樹(shù)堿等；5、靶向納米粒子粒徑等于或者小于100納米以逃過(guò)體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，避免在肝區(qū)、肺、脾等器官遭到攔截，以延長(zhǎng)納米載藥系統(tǒng)在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間以利于靶向納米抗癌藥在腫瘤部位的生物靶向性及累積。本發(fā)明所述的植物類(lèi)抗癌靶向納米制劑，其具有以下的優(yōu)點(diǎn)1、藥物納米體系在體內(nèi)環(huán)境中穩(wěn)定，載體和藥物能形成良好的復(fù)合體；2、載體的靶向性應(yīng)是主動(dòng)靶向即載體表面的生物靶向分子能與腫瘤細(xì)胞上的特異受體結(jié)合形成生物靶向性，而非被動(dòng)靶向性；3、納米粒子的粒徑小于或者略大于100納米，有利于納米粒子在體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)而不被單核巨噬細(xì)胞吞噬和被肝臟內(nèi)的網(wǎng)狀系統(tǒng)攔截；4、納米抗癌藥在溶液中的穩(wěn)定性好，適于在溶液狀態(tài)下長(zhǎng)期保存，即載體和抗癌藥能夠形成穩(wěn)定的復(fù)合物。


圖I是本發(fā)明的的實(shí)施例14靶向納米制劑的穩(wěn)定性比較結(jié)果示意圖；圖2是本發(fā)明的實(shí)施例14的靶向納米制劑的生物靶向性比較結(jié)果示意圖；圖3是本發(fā)明的實(shí)施例14的靶向納米制劑對(duì)腫瘤的抑制作用比較結(jié)果示意圖；圖4是實(shí)施例11、實(shí)施例17靶向納米制劑與泰帝素；羥基喜樹(shù)堿注射液與穩(wěn)定性比較結(jié)果示意圖；圖5是實(shí)施例11、實(shí)施例17靶向納米制劑對(duì)腫瘤的抑制作用比較結(jié)果示意圖；圖6是實(shí)施例11、實(shí)施例17靶向納米制劑的生物靶向性比較結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式白蛋白和透明質(zhì)酸在特定酸堿條件下入pH 3-7可以通過(guò)相互間的離子鍵及范德華カ形成穩(wěn)定的復(fù)合物或者通過(guò)脂質(zhì)酸上的羧基和白蛋白上的自由氨基脫水形成酰胺鍵形成共軛物。然后加入抗癌藥如紫杉醇、多稀紫杉醇和納米材料穩(wěn)定劑如膽固醇再調(diào)控溶液的酸堿度和溫度通過(guò)納米粒子核心的白蛋白變性使上數(shù)種組分形成一個(gè)緊密的疏水的納米核心及一個(gè)親水的外殼。這個(gè)緊密的核心有助于抗癌藥的包埋和避免抗癌藥的游離出納米球；親水的透明質(zhì)酸層則既可以避免納米粒子被循環(huán)體系中的巨噬細(xì)胞吞噬，又可以靶向腫瘤細(xì)胞表面的CD44受體。本發(fā)明所用的白蛋白為注射用人血白蛋白，購(gòu)自安普萊士，上海萊士血制品有限公司。使用前透析除去產(chǎn)品中的添加剤，冷凍干燥得不含添加劑的白蛋白。以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一歩的闡述。實(shí)施例I制備紫杉醇/TPGS/透明質(zhì)酸/白蛋白納米制劑(I)將500mg人血白蛋白凍干粉，500mg分子量5000Da的透明質(zhì)酸溶于20mLPBS緩沖液中；調(diào)整溶液的PH為5. 5，得到白蛋白/透明質(zhì)酸溶液；(2)將50mg的紫杉醇，50mgTPGS溶于ImL的氯仿中；在攪拌條件下將紫杉醇溶液加入到上述白蛋白/透明質(zhì)酸溶液中，形成初乳；(3)初乳在高壓均質(zhì)機(jī)(9000-40000psi)處理下得到納米乳劑，納米乳劑轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在30-45°C減壓蒸發(fā)快速除去有機(jī)溶劑，無(wú)菌條件下冷凍干燥得到凍干粉末；凍干粉用生理鹽水重懸后在室溫下穩(wěn)定時(shí)間小于10小吋。經(jīng)納米激光粒度儀測(cè)定，通過(guò)上述方法制備的納米粒子的平均粒徑在160納米。實(shí)施例2制備紫杉醇/TPGS/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑(I)稱(chēng)取500mg人血白蛋白凍干粉，溶于20mL無(wú)菌水中；加400mg分子量為5KDa的透明質(zhì)酸到白蛋白溶液中，在充分?jǐn)嚢柘聦椎鞍淄耆芙?；隨后，用O. IN的鹽酸調(diào)整溶液的pH為5. 5 ;將二倍于透明質(zhì)酸摩爾數(shù)的EDCI加入到上述溶液中，在室溫下攪拌過(guò)夜；反應(yīng)完畢后，透析除去未鍵合的透明質(zhì)酸、未反應(yīng)的EDCI和EDCI的反應(yīng)產(chǎn)物，然后冷凍干燥；將上述冷凍干燥的透明質(zhì)酸-白蛋白共軛物溶于20mL PBS緩沖液中；調(diào)整溶液的pH為5. 5，得到白蛋白/透明質(zhì)酸溶液； (2)將50mg的紫杉醇，50mgTPGS溶于ImL的氯仿中；在攪拌條件下將紫杉醇溶液加入到白蛋白/透明質(zhì)酸溶液中，形成初乳；(3)初乳在高壓均質(zhì)機(jī)(9000-400(K)psi)處理下得到納米乳劑，納米乳劑轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在30-45°C減壓蒸發(fā)快速除去有機(jī)溶劑，無(wú)菌條件下冷凍干燥得到紫杉醇/TPGS/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑凍干粉末。凍干粉用生理鹽水重懸后在室溫下置放24小時(shí)，未見(jiàn)有沉淀生成。經(jīng)納米激光粒度儀測(cè)定，通過(guò)上述方法制備的納米粒子的平均粒徑在140納米。實(shí)施例3制備紫杉醇/TPGS/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑(I)制備透明質(zhì)酸-白蛋白共軛物先制備透明質(zhì)酸活性脂將400毫克的透明質(zhì)酸(分子量5KDa)溶解在IOmLO. IMMES緩沖液中，加入I. 2倍透明質(zhì)酸摩爾數(shù)的EDCI，與I. 2倍透明質(zhì)酸摩爾數(shù)的N-羥基硫代琥珀酰亞胺；在室溫下攪拌反應(yīng)30分鐘即制得透明質(zhì)酸琥珀酰亞胺活性脂；將500mg人血白蛋白凍干粉溶解在IOmL無(wú)菌水中，加入上述透明質(zhì)酸的琥珀酰亞胺活性脂溶液中；調(diào)整PH值至7. 0-7. 2，在室溫下攪拌反應(yīng)60分鐘；反應(yīng)完成后加入到分子量截至為10，000的透析膜內(nèi)，透析除去未反應(yīng)的試劑和反應(yīng)副產(chǎn)物；將透析后透明質(zhì)酸-白蛋白溶液冷凍干燥，將凍干的透明質(zhì)酸-白蛋白溶于PH為5. 5的磷酸鹽緩沖溶液(PBS緩沖液)中，得到白蛋白/透明質(zhì)酸溶液；(2)制備紫杉醇溶液稱(chēng)取50mg，紫杉醇，50mgTPGS溶于ImL的氯仿中得紫杉醇溶液；(3)制備紫杉醇/TPGS/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑在攪拌條件下將紫杉醇溶液加入到白蛋白/透明質(zhì)酸溶液中，形成初乳；初乳在高壓均質(zhì)機(jī)(9000-40000psi)處理下得到納米乳剤，納米乳劑轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在30-45°C減壓蒸發(fā)快速除去有機(jī)溶劑，無(wú)菌條件下冷凍干燥得到凍干粉末。凍干粉用生理鹽水重懸后在室溫下置放24小時(shí)，未見(jiàn)有沉淀生成。經(jīng)納米激光粒度儀測(cè)定，通過(guò)上述方法制備的納米粒子的平均粒徑在100納米。實(shí)施例4制備紫杉醇/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑具體實(shí)施過(guò)程同實(shí)施例3,透明質(zhì)酸的量由400mg改為200mg。納米粒子的平均粒徑為110納米，穩(wěn)定時(shí)間小于36小時(shí)。實(shí)施例5制備紫杉醇/TPGS/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑
具體實(shí)施過(guò)程同實(shí)施例3，紫杉醇的量由50mg調(diào)整為30mg。實(shí)施例6制備紫杉醇/TPGS/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑具體實(shí)施過(guò)程同實(shí)施例3，紫杉醇的量由50mg調(diào)整為75mg。納米粒子的平均粒徑為110納米，與實(shí)施例3相比穩(wěn)定時(shí)間變短。實(shí)施例7制備紫杉醇/TPGS/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑具體實(shí)施過(guò)程同實(shí)施例3，透明質(zhì)酸的分子量由5000變?yōu)?0000。納米粒子的平均粒徑為120納米，穩(wěn)定時(shí)間基本不變。實(shí)施例8制備紫杉醇/TPGS/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑
具體實(shí)施過(guò)程同實(shí)施例3，穩(wěn)定劑TPGS量由50mg變?yōu)?50mg。納米粒子的平均粒徑為110納米，與實(shí)施例3相比穩(wěn)定時(shí)間幾乎不變。實(shí)施例9制備紫杉醇/ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑具體實(shí)施過(guò)程同實(shí)施例3，除了穩(wěn)定劑由TPGS變?yōu)棣宝?-ΡΡ0-ΡΕ0。納米粒子的平均粒徑為125納米。實(shí)施例10制備紫杉醇/PVP/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑具體實(shí)施過(guò)程同實(shí)施例3，除了穩(wěn)定劑由TPGS變?yōu)镻VP。納米粒子的平均粒徑為110納米。實(shí)施例11制備多西紫杉醇/TPGS/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑具體實(shí)施過(guò)程同實(shí)施例3，除了藥物由紫杉醇變?yōu)槎嘞┳仙即肌＜{米粒子的平均粒ィ5為I ο納米。實(shí)施例12制備紫杉醇/TPGS/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑具體實(shí)施過(guò)程同實(shí)施例3，除了溶劑由氯仿改為ニ氯甲烷。實(shí)施例13制備紫杉醇/TPGS/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑具體實(shí)施過(guò)程同實(shí)施例3，除了溶劑由氯仿改為こ醇ニ氯甲烷1:9 (LOmL)0與實(shí)施例3相比，得到的納米制劑粒徑更小，穩(wěn)定時(shí)間更長(zhǎng)，但紫杉醇體外24h釋放多于實(shí)施例3的制劑。實(shí)施例14制備紫杉醇/TPGS/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑具體實(shí)施過(guò)程同實(shí)施例3，除了溶劑由氯仿改為こ醇氯仿1:9 (I. OmD0與實(shí)施例3相比，得到的納米制劑粒徑更小，穩(wěn)定時(shí)間更長(zhǎng)，與實(shí)施例13類(lèi)似。實(shí)施例15制備紫杉醇/TPGS/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑(I)制備透明質(zhì)酸-白蛋白共軛物先制備透明質(zhì)酸活性脂將400毫克的透明質(zhì)酸(分子量5KDa)溶解在IOmLO. IMMES緩沖液中，加入I. 2倍透明質(zhì)酸摩爾數(shù)的EDCI，與I. 2倍透明質(zhì)酸摩爾數(shù)的N-羥基硫代琥珀酰亞胺；在室溫下攪拌反應(yīng)30分鐘即制得透明質(zhì)酸琥珀酰亞胺活性脂；將500mg人血白蛋白凍干粉溶解在IOmL無(wú)菌水中，加入上述透明質(zhì)酸的琥珀酰亞胺活性脂溶液中；調(diào)整PH值至7. 0-7. 2，在室溫下攪拌反應(yīng)60分鐘；反應(yīng)完成后加入到分子量截至為10，000的透析膜內(nèi)，透析除去未反應(yīng)的試劑和反應(yīng)副產(chǎn)物；將透析后透明質(zhì)酸-白蛋白溶液冷凍干燥；(2)制備紫杉醇溶液稱(chēng)取50mg，紫杉醇，50mgTPGS溶于I. OmLl I的こ醇/氯仿混合液中使之全部溶解即得紫杉醇溶液；(3)制備紫杉醇/TPGS/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑將凍干的透明質(zhì)酸-白蛋白溶于pH為5. 7的磷酸鹽緩沖溶液中，在高速均質(zhì)條件下(10000-20000rpm,5min)將紫杉醇溶液加入到白蛋白/透明質(zhì)酸溶液中，形成納米乳劑；納米乳劑轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在30-45°C減壓蒸發(fā)快速除去有機(jī)溶劑，無(wú)菌條件下冷凍干燥得到凍干粉末。凍干粉用生理鹽水重懸后在室溫下置放4-6小時(shí)，觀(guān)察到有沉淀生成。經(jīng)納米激光粒度儀測(cè)定，通過(guò)上述方法制備的納米粒子的平均粒徑在300納米以上。實(shí)施例16制備紫杉醇/TPGS/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑(I)制備透明質(zhì)酸-白蛋白共軛物
先制備透明質(zhì)酸活性脂將400毫克的透明質(zhì)酸(分子量2xl05Da)溶解在IOmLO. IM MES緩沖液中，加入I. 2倍透明質(zhì)酸摩爾數(shù)的EDCI，與I. 2倍透明質(zhì)酸摩爾數(shù)的N-羥基硫代琥珀酰亞胺；在室溫下攪拌反應(yīng)30分鐘即制得透明質(zhì)酸琥珀酰亞胺活性脂；將500mg人血白蛋白凍干粉溶解在IOmL無(wú)菌水中，加入上述透明質(zhì)酸的琥珀酰亞胺活性脂溶液中；調(diào)整PH值至7. 0-7. 2，在室溫下攪拌反應(yīng)60分鐘；反應(yīng)完成后加入到分子量截至為10，000的透析膜內(nèi)，透析除去未反應(yīng)的試劑和反應(yīng)副產(chǎn)物；將透析后透明質(zhì)酸-白蛋白溶液冷凍干燥；(2)制備紫杉醇溶液稱(chēng)取50mg，紫杉醇，50mgTPGS溶于I. OmLl 9的こ醇/氯仿混合液中使之全部溶解即得紫杉醇溶液；(3)制備紫杉醇/TPGS/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑將凍干的透明質(zhì)酸-白蛋白溶于pH為5. 7的磷酸鹽緩沖溶液中，加入到白蛋白/透明質(zhì)酸溶液中，用超聲波處理器處理5min，功率200W，形成納米乳劑，納米乳劑轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在30-45°C減壓蒸發(fā)快速除去有機(jī)溶劑，無(wú)菌條件下冷凍干燥得到凍干粉末。凍干粉用生理鹽水重懸后在室溫下置放4小時(shí)，觀(guān)察到有沉淀生成。經(jīng)納米激光粒度儀測(cè)定，通過(guò)上述方法制備的納米粒子的粒徑超過(guò)300納米。實(shí)施例17 :制備喜樹(shù)堿/TPGS/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑(I)制備透明質(zhì)酸-白蛋白共軛物先制備透明質(zhì)酸活性脂將400毫克的透明質(zhì)酸(分子量5KDa)溶解在IOmLO. IMMES緩沖液中，加入I. 2倍透明質(zhì)酸摩爾數(shù)的EDCI，與I. 2倍透明質(zhì)酸摩爾數(shù)的N-羥基硫代琥珀酰亞胺；在室溫下攪拌反應(yīng)30分鐘即制得透明質(zhì)酸琥珀酰亞胺活性脂；將500mg人血白蛋白凍干粉溶解在IOmL無(wú)菌水中，加入上述透明質(zhì)酸的琥珀酰亞胺活性脂溶液中；調(diào)整PH值至7. 0-7. 2，在室溫下攪拌反應(yīng)60分鐘；反應(yīng)完成后加入到分子量截至為10，000的透析膜內(nèi)，透析除去未反應(yīng)的試劑和反應(yīng)副產(chǎn)物；將透析后透明質(zhì)酸-白蛋白溶液冷凍干燥；(2)制備喜樹(shù)堿溶液稱(chēng)取50mg喜樹(shù)堿,50mgTPGS溶于ImL的氯仿中得喜樹(shù)堿溶液；(3)制備喜樹(shù)堿/TPGS/透明質(zhì)酸-白蛋白納米制劑將凍干的透明質(zhì)酸-白蛋白溶于pH為5.5的磷酸鹽緩沖溶液中，在攪拌條件下將喜樹(shù)堿溶液加入到白蛋白/透明質(zhì)酸溶液中，形成初乳。初乳在高壓均質(zhì)機(jī)(9000-40000psi )處理下得到納米乳劑，納米乳劑轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在30-45 V減壓蒸發(fā)快速除去有機(jī)溶劑，無(wú)菌條件下冷凍干燥得到凍干粉末。凍干粉用生理鹽水重懸后在室溫下置放24小時(shí)，未見(jiàn)有沉淀生成。經(jīng)納米激光粒度儀測(cè)定，通過(guò)上述方法制備的納米粒子的平均粒徑在110納米。實(shí)施例18(I)納米制劑中各組分含量測(cè)定取IOmg上述實(shí)施例制備的納米制劑，加入Iml氯仿，用漩渦振蕩器充分震蕩，萃取出制劑中的藥物及穩(wěn)定劑，取出上清液，經(jīng)O. 22 μ m濾膜過(guò)濾后，用高壓液相色譜檢測(cè)藥物及穩(wěn)定劑含量。用純化水把不溶部分溶解，用高壓液相色譜法檢測(cè)透明質(zhì)酸濃度，雙縮脲法檢測(cè)白蛋白含量。(2)納米制劑在溶液中穩(wěn)定性考查
取凍干的上述實(shí)施例制備的納米制劑10mg，用2mL無(wú)菌過(guò)濾后的生理鹽水重懸，置室溫下保存，觀(guān)察混懸液狀態(tài)、有無(wú)沉淀及出現(xiàn)沉淀時(shí)間。(3)紫杉醇與人血清白蛋白結(jié)合的穩(wěn)定性的比較將50mg紫杉醇納米制劑放入截流分子量為5000的透析膜中置于pH值為7. 2的PBS緩沖溶液(含O. 2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的土溫80)中。定時(shí)取出定量的PBS緩沖溶液，用O. 22微米的濾膜過(guò)濾，然后用高壓液相色譜進(jìn)行分析。表I各實(shí)施例納米制劑的相關(guān)參數(shù)(其余組分為水，構(gòu)成總和為100%)
權(quán)利要求
1.ー種植物類(lèi)抗癌靶向納米制劑，其特征是，其重量百分比的組成如下 人血白蛋白43 — 60% ； 植物類(lèi)抗癌藥物1. 5 — 7. 5% ； 分子量為3000-1. 8xl06Da的透明質(zhì)酸24 — 40% ； 納米粒子穩(wěn)定劑3. 5 — 15% ； 其余組分為水，構(gòu)成總和為100%。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的植物類(lèi)抗癌靶向納米制劑，其特征是，其重量百分比的組成如下 人血白蛋白45 — 50% ； 植物類(lèi)抗癌藥物3 — 5% ； 分子量為3000-1. 8xl06Da的透明質(zhì)酸32 — 38% ； 納米粒子穩(wěn)定劑5 — 7% ； 其余組分為水，構(gòu)成總和為100%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的植物類(lèi)抗癌靶向納米制劑，其特征是，所述透明質(zhì)酸的分子量為 5000-2xl05Da。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的植物類(lèi)抗癌靶向納米制劑，其特征是，所述納米粒子穩(wěn)定劑是d- α生育酚琥珀酸聚こニ醇酷、ΡΕΟ-ΡΡΟ-ΡΕΟ嵌段共聚物、PVP中的ー種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的植物類(lèi)抗癌靶向納米制劑，其特征是，所述植物類(lèi)抗癌藥物是紫杉醇、多西紫杉醇、喜樹(shù)堿及其衍生物。
6.制備權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的植物類(lèi)抗癌靶向納米制劑的方法，其特征是，其步驟如下 (1)制備透明質(zhì)酸-白蛋白共軛物 將透明質(zhì)酸和人血白蛋白加入到無(wú)菌水中溶解，調(diào)節(jié)溶液PH為5. 0-6. O,將1-2倍透明質(zhì)酸摩爾數(shù)的EDCI加入到上述溶液中，在室溫下攪拌過(guò)夜，反應(yīng)完畢后，透析除去未鍵合的透明質(zhì)酸、未反應(yīng)的EDCI和EDCI的反應(yīng)產(chǎn)物，冷凍干燥后用PBS緩沖液溶解得到人血白蛋白/透明質(zhì)酸溶液；或 將透明質(zhì)酸完全溶于O. IM的MES緩沖液中，然后加入偶聯(lián)劑EDCI和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，室溫下攪拌反應(yīng)，得到透明質(zhì)酸琥珀酰亞胺活性脂；再將透明質(zhì)酸琥珀酰亞胺活性脂加入到人血白蛋白的水溶液中，調(diào)節(jié)溶液PH 7.0-7. 5，室溫下攪拌反應(yīng)；反應(yīng)完畢后透析除去未反應(yīng)的原料和反應(yīng)副產(chǎn)物，冷凍干燥后，得透明質(zhì)酸-人血白蛋白共軛物；將透明質(zhì)酸-人血白蛋白共軛物用PBS緩沖液溶解，得到人血白蛋白/透明質(zhì)酸溶液；或 將人血白蛋白凍干粉，透明質(zhì)酸溶于PBS緩沖液中，得到人血白蛋白/透明質(zhì)酸溶液； (2)配制植物類(lèi)抗癌藥溶液將植物類(lèi)抗癌藥物和納米粒子穩(wěn)定劑溶于有機(jī)溶劑中，得到抗癌藥溶液； (3)在高速均質(zhì)、高壓均質(zhì)或超聲處理?xiàng)l件下，將上述抗癌藥溶液加入到人血白蛋白-透明質(zhì)酸溶液中，然后除去有機(jī)溶劑；過(guò)濾冷凍干燥得到植物類(lèi)抗癌靶向納米制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征是，所述有機(jī)溶劑為ニ氯甲烷、氯仿、ニ氯甲烷與こ醇混合溶劑、或氯仿與こ醇混合溶劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征是，所述有機(jī)溶劑為氯仿或こ醇與氯仿的混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求6 — 8任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征是，步驟(3)中，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中加熱至30-45°C減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶剤。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種植物類(lèi)抗癌靶向納米制劑及其制備方法，其特征是，其重量百分比的組成如下人血白蛋白43－60%；植物類(lèi)抗癌藥物1.5－7.5%；分子量為3000-1.8x 106Da的透明質(zhì)酸24－40%；納米粒子穩(wěn)定劑3.5－15%，其余組分為水，構(gòu)成總和為100％。其制備方法包括制備透明質(zhì)酸-白蛋白共軛物；配制植物類(lèi)抗癌藥溶液；制備靶向納米制劑。該植物類(lèi)抗癌靶向納米制劑穩(wěn)定性好，并具有生物靶向性。
文檔編號(hào)A61K9/19GK102688200SQ20121014299
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月9日
發(fā)明者劉鋒 申請(qǐng)人:劉鋒