專利名稱：一種基因和疏水藥物共負(fù)載peg化納米粒子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子的制備方法。它結(jié)合了基因治療和化學(xué)治療，屬于基因治療領(lǐng)域新型高效非病毒基因傳遞體系的制備方法和技術(shù)。
背景技術(shù)：
癌癥(惡性腫瘤)由于缺乏有效治療手段，已成為影響人類健康的重要疾病，每年直接用于腫瘤治療的費(fèi)用數(shù)以百億計(jì)。癌癥成為科學(xué)家尚未攻克的最頑固堡壘之一，也是當(dāng)代科學(xué)研究最具有挑戰(zhàn)性的課題之一。化學(xué)療法是惡性腫瘤綜合治療的重要手段之一。但由于其藥物用量大，缺乏專一性，使得在抑制癌組織的同時(shí)對(duì)正常人體細(xì)胞也造成嚴(yán)重的毒副作用，患者在治療期間容易產(chǎn)生多重耐藥性。因此，為減少抗癌藥對(duì)人體正常細(xì)胞的毒副作用，尋找安全穩(wěn)定的藥物載體對(duì)化學(xué)療法的進(jìn)一步發(fā)展至關(guān)重要?；蛑委熓菍⑷说慕】祷蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入人體細(xì)胞，以糾正基因的缺陷或發(fā)揮治療作用，從而治療疾病的生物醫(yī)學(xué)新技術(shù)。其關(guān)鍵是選擇合適的基因載體及基因?qū)敕椒ǎ鼓康幕蚰軌蛟诎屑?xì)胞中獲得安全、高效、可控且穩(wěn)定的表達(dá)。聚陽離子由于具有制備簡(jiǎn)單、免疫原性低、載基因容量大等特點(diǎn)，成為基因治療載體的主要發(fā)展方向之一。但這類聚陽離子/DNA組裝體在體內(nèi)容易發(fā)生聚集，而被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除出體內(nèi)，降低基因傳遞體系在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間并影響基因轉(zhuǎn)染效率。制備聚乙二醇(PEG)化的基因傳遞體系可有效解決上述問題。已有研究發(fā)現(xiàn)，將治療基因與抗癌藥物同時(shí)輸送到腫瘤細(xì)胞中，構(gòu)建高效安全的基因藥物復(fù)合載體，達(dá)到基因療法和化學(xué)療法的協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)基因和抗癌藥物的有效傳遞，有效解決癌細(xì)胞的多藥耐藥性，具有重要的科學(xué)和應(yīng)用價(jià)值。因此通過￠-環(huán)糊精與二茂鐵的主客體作用引入PEG鏈段，通過￠-環(huán)糊精與疏水藥物的包結(jié)作用負(fù)載藥物，可制備基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子，為采用化學(xué)藥物與基因聯(lián)合治療惡性腫瘤提供了新的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子的制備方法。基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子的制備方法的步驟如下
1)配置濃度為0.5 4 mg/mL的P -環(huán)糊精修飾聚陽離子溶液；
2)配置濃度為0.5 4 mg/mL的二茂鐵修飾聚乙二醇溶液；
3)將步驟I)和步驟2)溶液混合，使P-環(huán)糊精與二茂鐵的摩爾比為4:1 2:1，超聲30 min后靜直；
4)配置濃度為2mg/mL的疏水藥物溶液； 5)將步驟4)制備的疏水藥物溶液滴加到步驟3)溶液中，使3-環(huán)糊精與疏水藥物的摩爾比為1:1 1:4，避光攪拌24 h，透析8 24h，凍干，得到￠-環(huán)糊精修飾聚陽離子/二茂鐵修飾聚乙二醇/疏水藥物包合物粉末；6)配置濃度為0.05 I mg/mL的P -環(huán)糊精修飾聚陽離子/ 二茂鐵修飾聚乙二醇/疏水藥物包合物溶液；
7)配置濃度為75 100l^g/mL的DNA溶液；
8)將步驟6)溶液加入到等體積步驟7)溶液中，漩渦混合并靜置30min，獲得基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子。所述的0 -環(huán)糊精修飾聚陽離子包括P -環(huán)糊精修飾聚乙烯亞胺、P -環(huán)糊精修飾聚賴氨酸或3-環(huán)糊精修飾殼聚糖。所述的疏水藥 物包括阿霉素或紫杉醇。本發(fā)明通過主客體作用制備基因和疏水藥物共負(fù)載的PEG化納米粒子，通過 環(huán)糊精與二茂鐵的主客體作用引入PEG鏈段，通過￠-環(huán)糊精與疏水藥物的包結(jié)作用負(fù)
載藥物，為采用化學(xué)藥物與基因聯(lián)合治療惡性腫瘤提供了新的制備方法。制備方法簡(jiǎn)單易操作，PEG化的程度、藥物及基因的裝載量易調(diào)節(jié)，顯著提高了基因和疏水藥物共負(fù)載納米粒子在生理鹽溶液中的穩(wěn)定性。


圖I為基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子與PEI-g-CD/DOX/ DNA組裝體在生理鹽溶液中放置不同時(shí)間的粒徑變化；
圖2為基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子在生理鹽溶液放置Ih后的透射電鏡照
片;
圖3為基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子與PEI-g-CD/DNA組裝體及PEI-g-CD/DOX/ DNA組裝體的(-電位值；
圖4為基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子的體外藥物釋放曲線。
具體實(shí)施例方式一種基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子的制備方法的步驟如下
1)配置濃度為0.5 4 mg/mL的P -環(huán)糊精修飾聚陽離子溶液；
2)配置濃度為0.5 4 mg/mL的二茂鐵修飾聚乙二醇溶液；
3)將步驟I)和步驟2)溶液混合，使P-環(huán)糊精與二茂鐵的摩爾比為4:1 2:1，超聲30 min后靜直；
4)配置濃度為2mg/mL的疏水藥物溶液；
5)將步驟4)制備的疏水藥物溶液滴加到步驟3)溶液中，使3-環(huán)糊精與疏水藥物的摩爾比為1:1 1:4，避光攪拌24 h，透析8 24h，凍干，得到￠-環(huán)糊精修飾聚陽離子/二茂鐵修飾聚乙二醇/疏水藥物包合物粉末；
6)配置濃度為0.05 I mg/mL的P -環(huán)糊精修飾聚陽離子/ 二茂鐵修飾聚乙二醇/疏水藥物包合物溶液；
7)配置濃度為75 100l^g/mL的DNA溶液；
8)將步驟6)溶液加入到等體積步驟7)溶液中，漩渦混合并靜置30min,獲得基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子。所述的0 -環(huán)糊精修飾聚陽離子包括^ -環(huán)糊精修飾聚乙烯亞胺、0 -環(huán)糊精修飾聚賴氨酸或3 -環(huán)糊精修飾殼聚糖。所述的疏水藥物包括阿霉素或紫杉醇。
實(shí)施例I :
配置濃度為4 mg/mL的P -環(huán)糊精修飾聚乙烯亞胺(PEI-g-⑶)溶液和濃度為4 mg/mL的二茂鐵修飾聚乙二醇(PEG - Fe)溶液。將兩種溶液按PEI-g-⑶中P -⑶與PEG-Fc的摩爾比為2:1的比例混合，超聲30 min后靜置待用。將2 mg/mL阿霉素(DOX)二甲基亞砜溶液滴加到上述的混合溶液中，使PEI-g-⑶中⑶與DOX的摩爾比為I: I的比例，避光攪拌24 h，再透析8 h 24 h，凍干，得到PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX包合物粉末。按上述制備的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX包合物粉末，采用紫外-可見光分光光度計(jì)(UV)測(cè)定阿霉素(DOX)的載藥量和包封率，測(cè)得載藥量為9%，包封率為57%，說明3 -環(huán)糊精修飾聚乙烯亞胺可以有效包合疏水藥物DOX。配置濃度為0. 5 mg/mL 的 PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX 溶液和濃度為 75 l^g/mL 的 p53(抗癌基因)溶液。取上述的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX溶液與250ML DNA溶液等體積漩渦混合并靜置30 min，制備得基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子。按上述制備的基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子，利用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和透射電鏡(TEM)研究共負(fù)載納米粒子 在生理鹽濃度下的穩(wěn)定性，結(jié)果見圖I、圖2。圖I為共負(fù)載納米粒子與PEI-g-⑶/DOX/ DNA組裝體在生理鹽溶液中放置不同時(shí)間的粒徑的變化情況，圖2為共負(fù)載PEG化納米粒子在生理鹽溶液放置Ih后的透射電鏡照片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明共負(fù)載PEG化納米粒子在生理鹽溶液中較少聚集，穩(wěn)定性較好。采用電位分析儀研究上述制備的基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子的表面電位，由于PEG鏈段的屏蔽作用和體積排斥作用，組裝體的;-電位顯著降低，見圖3。實(shí)施例2:
配置濃度為2 mg/mL的P -環(huán)糊精修飾聚賴氨酸(PLL-g-⑶)溶液和濃度為2 mg/mL的二茂鐵修飾聚乙二醇(PEG - Fe)溶液。將兩種溶液按PLL-g-⑶中￠-⑶與PEG-Fc的摩爾比為3:1的比例混合，超聲30 min后靜置待用。將2 mg/mL紫杉醇(PTX)氯仿溶液滴加到上述的混合溶液中，使PLL-g-⑶中⑶與PTX的摩爾比為1:2的比例，避光攪拌24 h，再透析8 h^24 h，凍干，得到PLL-g-CD/PEG-Fc/PTX包合物粉末。配置濃度為0. 5 mg/mL的PLL-g-CD/PEG-Fc/PTX溶液和濃度為75 l^g/mL的pl6 (多腫瘤抑制因子I基因)溶液。取上述的PLL-g-CD/PEG-Fc/PTX溶液與250 ML DNA溶液等體積漩渦混合并靜置30 min，制備得基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子。實(shí)施例3
配置濃度為0. 5 mg/mL的P -環(huán)糊精修飾殼聚糖(CS-g-⑶)溶液和濃度為I mg/mL的二茂鐵修飾聚乙二醇(PEG - Fe)溶液。將兩種溶液按CS-g-⑶中P -⑶與PEG-Fc的摩爾比為4:1的比例混合，超聲30 min后靜置待用。將2 mg/mL紫杉醇(PTX)氯仿溶液滴加到上述的混合溶液中，使CS-g-⑶中⑶與PTX的摩爾比為1:4的比例，避光攪拌24 h，再透析8 h^24 h，凍干，得到CS-g-CD/PEG-Fc/PTX包合物粉末。配置濃度為0. 5 mg/mL的CS-g-CD/PEG-Fc/PTX溶液和濃度為75 l^g/mL的p53溶液。取上述的CS-g-CD/PEG-Fc/PTX溶液與250 MLDNA溶液等體積漩渦混合并靜置30 min，制備得基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子。實(shí)施例4:
配置濃度為I mg/mL的￠-環(huán)糊精修飾聚乙烯亞胺(PEI-g-⑶)溶液和濃度為0.5 mg/mL的二茂鐵修飾聚乙二醇(PEG - Fe)溶液。將兩種溶液按PEI-g-⑶中P -⑶與PEG-Fc的摩爾比為3:1的比例混合，超聲30 min后靜置待用。將2 mg/mL阿霉素(DOX)二甲基亞砜溶液滴加到上述的混合溶液中，使PEI-g-⑶中⑶與DOX的摩爾比為1:3的比例，避光攪拌24 h，再透析8 h 24 h，凍干，得到PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX包合物粉末。配置濃度為I mg/mL的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX溶液和濃度為100 l^g/mL的pORF_hTRAIL (腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體質(zhì)粒)溶液。取上述的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX溶液與3. 75 mL DNA溶液等體積漩渦混合并靜置30 min,制備得基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子。
按上述制備的基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子，運(yùn)用紫外-可見光分光光度計(jì)(UV)測(cè)定阿霉素(DOX)的釋放曲線。將5 mL實(shí)施例4制備的共負(fù)載納米粒子溶液加入到截留分子量為3500 Da的透析袋中，將透析袋置于10 mL PBS溶液中，然后于37°C恒溫水浴、搖床震蕩下透析。每隔一段時(shí)間，取出I mL透析液，并加入I mL新鮮的PBS溶液。通過檢測(cè)釋放溶液中DOX的紫外吸收值來計(jì)算DOX的釋放量，結(jié)果如圖4所示。實(shí)施例5:
配置濃度為I mg/mL的￠-環(huán)糊精修飾聚乙烯亞胺(PEI-g-⑶)溶液和濃度為2 mg/mL的二茂鐵修飾聚乙二醇(PEG - Fe)溶液。將兩種溶液按PEI-g-⑶中P -⑶與PEG-Fc的摩爾比為2:1的比例混合，超聲30 min后靜置待用。將2 mg/mL阿霉素(DOX)二甲基亞砜溶液滴加到上述的混合溶液中，使PEI-g-⑶中⑶與DOX的摩爾比為1:4的比例，避光攪拌24 h，再透析8 h 24 h，凍干，得到PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX包合物粉末。按上述制備的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX包合物粉末，采用紫外-可見光分光光度計(jì)(UV)測(cè)定阿霉素(DOX)的載藥量和包封率，測(cè)得載藥量為5. 6%，包封率為48%。配置濃度為0. 05 mg/mL 的 PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX 溶液和濃度為 100 l^g/mL 的含P53 (抗癌基因)的DNA溶液。取上述的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX溶液與24 ML DNA溶液等體積漩渦混合并靜置30 min,制備得基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子。配置濃度為0. 05 mg/mL 的 PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX 溶液和濃度為 100 l^g/mL 的含PEGFP (綠色熒光蛋白質(zhì)粒，不含抗癌基因)的DNA溶液。取上述的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX溶液與24 m DNA溶液等體積漩渦混合并靜置30 min，制備得基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子。按上述制備的基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子，采用MTT法，利用酶標(biāo)儀進(jìn)行細(xì)胞毒性動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。將本發(fā)明實(shí)施例5制備的含兩種不同質(zhì)粒的基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子分別置于人肝癌細(xì)胞H印G2細(xì)胞中孵育48 h、72 h、96 h、144 h，然后于細(xì)胞培養(yǎng)液中加入5 mg/mL四唑鹽(MTT)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去原培養(yǎng)液，每孔加入200U LDMSO溶解結(jié)晶，最后于570 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔OD值，并算出不同濃度下的細(xì)胞活性。由結(jié)果可知，含有p53抗癌基因的共負(fù)載PEG化納米粒子比不含抗癌基因共負(fù)載PEG化納米粒子毒性大，說明P53抗癌基因與阿霉素共同作用，逐漸殺死HepG2細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子的制備方法，其特征在于它的步驟如下 1)配置濃度為0.5 4 mg/mL的P -環(huán)糊精修飾聚陽離子溶液； 2)配置濃度為0.5 4 mg/mL的二茂鐵修飾聚乙二醇溶液； 3)將步驟I)和步驟2)溶液混合，使P-環(huán)糊精與二茂鐵的摩爾比為4:1 2:1，超聲30 min后靜直； 4)配置濃度為2mg/mL的疏水藥物溶液； 5)將步驟4)制備的疏水藥物溶液滴加到步驟3)溶液中，使3-環(huán)糊精與疏水藥物的摩爾比為1:1 1:4，避光攪拌24 h，透析8 24h，凍干，得到￠-環(huán)糊精修飾聚陽離子/二茂鐵修飾聚乙二醇/疏水藥物包合物粉末； 6)配置濃度為0.05 I mg/mL的P -環(huán)糊精修飾聚陽離子/ 二茂鐵修飾聚乙二醇/疏水藥物包合物溶液； 7)配置濃度為75 100l^g/mL的DNA溶液； 8)將步驟6)溶液加入到等體積步驟7)溶液中，漩渦混合并靜置30min，獲得基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子的制備方法，其特征在于所述的P -環(huán)糊精修飾聚陽離子包括^ -環(huán)糊精修飾聚乙烯亞胺、P -環(huán)糊精修飾聚賴氨酸或3-環(huán)糊精修飾殼聚糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子的制備方法，其特征在于所述的疏水藥物包括阿霉素或紫杉醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子的制備方法。它的步驟如下1)配置β-環(huán)糊精修飾聚陽離子溶液；2)配置二茂鐵修飾聚乙二醇溶液；3)將步驟1)和步驟2)溶液混合，超聲后靜置；4)配置疏水藥物溶液；5)將步驟4)制備的疏水藥物溶液滴加到步驟3)溶液中，避光攪拌，透析，凍干，得到包合物粉末；6)配置包合物溶液；7)配置DNA溶液；8)將步驟6)溶液加入到等體積步驟7)溶液中，漩渦混合并靜置，獲得基因和疏水藥物共負(fù)載PEG化納米粒子。本發(fā)明通過主客體作用制備基因和疏水藥物共負(fù)載的PEG化納米粒子，制備方法簡(jiǎn)單易操作，顯著提高了基因和疏水藥物共負(fù)載納米粒子在生理鹽溶液中的穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)A61K31/337GK102697732SQ20121015349
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月17日
發(fā)明者唐三, 李文宇, 王幽香, 陳麗娜 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)