專利名稱：一種裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球、制備方法及其作為口服制劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，涉及納米載體在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用，具體涉及ー種裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球、制備方法及其作為ロ服制劑的應(yīng)用。裝載難溶性藥物的殼聚糖納米球經(jīng)ロ服后到達(dá)病變部位，發(fā)揮藥效。此發(fā)明具有潛在的臨床治療應(yīng)用價(jià)值。
背景技術(shù)：
難溶性藥物即水不溶性藥物或脂溶性藥物。近10年來(lái)，科研人員采用藥物高通量篩選技術(shù)篩選出了大量應(yīng)用于重大疾病治療的活性化合物，但篩選出的活性化合物大多分子量高、疏水性強(qiáng)。目前，在新開發(fā)的活性藥物中至少有40%因溶解度較低問題而不能應(yīng)用于臨床。此外，高達(dá)70%的合成藥物也都存在溶解度低的問題。在眾多的難溶性藥物中，具有代表性的是紫杉醇。紫杉醇(PTX)是紅豆杉屬植物中一種復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，也是目前所了解的唯一一種可以促進(jìn)微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管的廣譜抗癌藥物，對(duì)肺癌、卵巣癌、乳腺癌、頭頸癌、胃癌、前列腺癌、宮頸癌等都具有良好的治療作用。然而，由于其水溶性低，目前商品化制劑為了克服藥物的難溶問題，臨床使用的注射制劑是將藥物溶于聚氧こ烯蓖麻油與無(wú)水こ醇的混合溶媒中，經(jīng)葡萄糖或氯化鈉稀釋后進(jìn)行靜脈注射。這不僅會(huì)導(dǎo)致注射部位的疼痛，引起血管炎癥，而且聚氧こ烯蓖麻油在體內(nèi)降會(huì)釋放組胺，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的副反應(yīng)，如嚴(yán)重的致敏反應(yīng)、惡心、呼吸困難等。因此，病人在給藥前不得不先注射抗過敏藥物，導(dǎo)致整個(gè)治療過程繁瑣和不便，而且還需謹(jǐn)慎監(jiān)測(cè)用藥過程。另外，這種難溶性藥物因溶解度問題，導(dǎo)致透膜吸收差、生物利用度低。盡管科學(xué)家們?yōu)榇俗隽撕芏嗟难芯?，例如轉(zhuǎn)向新型制劑的研究，研究新的藥物載體。藥物載體是指能改變藥物進(jìn)入人體的方式和在體內(nèi)的分布、控制藥物的釋放速度并將藥物輸送到靶向器官的體系。由于各種藥物載體釋放和靶向系統(tǒng)能夠減少藥物降解及損失，降低副作用，提高生物利用度，因而對(duì)它的研究越來(lái)越受到重視。為了尋找合適的藥物載體，人們對(duì)各種體系脂質(zhì)體、聚合物膠束、聚乳酸(PLA)和固體脂質(zhì)體納米球內(nèi)等進(jìn)行了廣泛研究。然而，脂質(zhì)體在體內(nèi)容易被酶類氧化，穩(wěn)定性差，釋放藥物緩慢，突釋現(xiàn)象嚴(yán)重。而聚合物膠束由于在血液中會(huì)被稀釋到臨界膠束濃度以下，也存在著穩(wěn)定性差的問題。PLA、固體脂質(zhì)體等納米球疏水性強(qiáng)，雖然對(duì)難溶性藥物可能有較高的包埋率，但由于材料疏水性強(qiáng)，造成釋藥速率緩慢、血內(nèi)清除率高和生物利用度低等問題。另外，這些方法還存在著規(guī)模化制備困難、產(chǎn)品批次間差異性大的問題。為了提高難溶性藥物的水溶性、解決目前注射制劑嚴(yán)重毒副作用及現(xiàn)行研發(fā)制劑存在的問題，急需開發(fā)ー種親水性好、載藥率高、穩(wěn)定性好、生物利用度高的載藥體系。親水性生物可降解聚合物納米球在難溶性藥物包埋和傳輸方面具有潛在優(yōu)勢(shì)，通過對(duì)納米球制備材料篩選和制備過程控制，能夠使難溶性藥物以微晶或細(xì)小顆粒形式包裹于載體內(nèi)部，可大大改善難溶性藥物溶出。納米球還可通過EPR效應(yīng)(實(shí)體瘤組織的高通透性和滯留效應(yīng))到達(dá)腫瘤部位，實(shí)現(xiàn)藥物的被動(dòng)傳輸。另外，納米球可以拓展給藥途徑，如作為ロ服制劑使用，増加患者的耐受，減輕病人痛苦。殼聚糖是ー種天然的陽(yáng)離子生物高聚物，具有良好的生物粘附性、生物相容性和生物降解性等優(yōu)點(diǎn)，是制備ロ服納米藥物載體的理想材料。然而，目前殼聚糖納米球主要用于親水性藥物的裝載，對(duì)于裝載難溶性藥物還存在許多技術(shù)難點(diǎn)。目前親水性殼聚糖及其衍生物包埋難溶性藥物存在的難點(diǎn)(I)親水性的殼聚糖納米球無(wú)法實(shí)現(xiàn) 對(duì)難溶性藥物的直接裝載，本發(fā)明采用0/W/0復(fù)乳法實(shí)現(xiàn)對(duì)難溶性藥物的裝載，復(fù)乳液進(jìn)ー步固化即可制得裝載難溶性藥物的納米球。復(fù)乳液特別是納米復(fù)乳液滴在制備過程中的穩(wěn)定性是ー個(gè)極大的挑戰(zhàn)。(2)難溶性藥物如紫杉醇在制備過程中很容易析晶形成大的晶體顆粒而破壞乳液，造成藥物泄漏甚至包埋失敗。(3)純的殼聚糖納米球具有實(shí)心結(jié)構(gòu)，釋放液很難進(jìn)入納米球，導(dǎo)致藥物釋放速率緩慢。(4)殼聚糖制備的納米球大多采用化學(xué)交聯(lián)法，經(jīng)化學(xué)交聯(lián)固化后，納米球表面的活性基團(tuán)氨基大多被利用，這會(huì)大大降低納米載體的生物粘附性，進(jìn)而降低其給藥后的生物利用度。(5)制備方法非常有限，主要采用機(jī)械攪拌法、均質(zhì)乳化法、超聲乳化法等，采用這種方法在制備乳液時(shí)，由于粒徑不均一，小的乳滴會(huì)被大的乳滴吸收，同時(shí)大的乳滴又會(huì)因剪切力的作用而破壞，這導(dǎo)致所制得的殼聚糖納米球粒徑很不均一。而且，由于乳滴的粒徑不均一，在交聯(lián)過程中小液滴容易被大液滴吸附，大液滴又容易被剪切成小液滴，從而會(huì)形成很多交聯(lián)凝聚物。同時(shí)，在液滴的合并和破裂過程中，內(nèi)包藥物容易逃逸到液滴外面，導(dǎo)致藥物的包埋率降低。納米球粒徑的不均一還會(huì)為殼聚糖及其衍生物納米球的實(shí)際應(yīng)用帶來(lái)諸多困難。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球產(chǎn)品及其制備過程中存在的問題，本發(fā)明的目的之ー在于提供ー種裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球及其作為ロ服制劑的應(yīng)用。本發(fā)明提供ー種裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球，該產(chǎn)品粒徑均一，多分散指數(shù)在O. I以內(nèi)，對(duì)難溶性藥物的載藥率高達(dá)10-50%。難溶性藥物納米晶以原位結(jié)晶的形式均勻分布在殼聚糖及其衍生物納米球中。通過在納米球基質(zhì)中添加一定量的殼聚糖衍生物，實(shí)現(xiàn)納米球多孔結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，孔徑可控制在20納米以內(nèi)，保證藥物穩(wěn)定快速釋放，釋放速率可控。該產(chǎn)品是ー種ロ服制劑，由于具有良好的細(xì)胞和黏附、細(xì)胞內(nèi)吞及膜通透特性，該產(chǎn)品的ロ服生物利用度高達(dá)5-15%。該產(chǎn)品經(jīng)ロ服后對(duì)相應(yīng)的疾病展示出良好的治療效果及較低的毒副作用。再加之殼聚糖-売聚糖衍生物天然的親水性及納米球本身在EPR效應(yīng)的作用下被動(dòng)靶向腫瘤的優(yōu)勢(shì)，從而展示出較低的毒副作用。該產(chǎn)品裝載的難溶性藥物能夠穩(wěn)定快速釋放，還可以通過改變載體孔徑控制釋藥速率。該產(chǎn)品具有良好的細(xì)胞黏附和細(xì)胞內(nèi)吞特性，展示出良好的治療效果。所述載藥率按下式計(jì)算
賴率修mmi裏所述裝載難性溶藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球?qū)﹄y溶性藥物的載藥率為10-50%。所述難溶性藥物納米晶均勻分布在殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球中，藥物能夠穩(wěn)定快速釋放，且釋放速率可控。所述難溶性藥物以原位結(jié)晶的形式均勻分布在殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球中，極大地提高了親水性殼聚糖對(duì)難溶性藥物的裝載率和包埋率，克服了親水性殼聚糖無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)難溶性藥物的有效包埋等困難，避免了難溶性藥物以大的晶體形式存在于載體中而導(dǎo)致的突釋現(xiàn)象。所述難溶性藥物納米晶的粒徑為15nm以內(nèi)，優(yōu)選IOnm以內(nèi)，進(jìn)ー步優(yōu)選3nm以內(nèi)。所述難溶性藥物為脂溶性而水不溶性的藥物，優(yōu)選紫杉醇、0_(氯こ酰氨甲?；?煙曲霉素醇、尼莫地平、齊墩果酸、丹參酮II A或其混合物，特別優(yōu)選紫杉醇、0-(氯こ酰氨甲?；?煙曲霉素醇或其混合物。 所述殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球具有多孔結(jié)結(jié)構(gòu)，孔徑為40nm以內(nèi)，優(yōu)選30nm以內(nèi)，進(jìn)ー步優(yōu)選20nm以內(nèi)。所述殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球，其粒徑均一，平均粒徑為20-1500nm,優(yōu)選為50-350nm。其中粒徑及粒徑分布由具有粒徑分析功能的Zeta電位儀ZetaPlus(BrooKhavenInstruments Cooperation, USA)測(cè)得。所述殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球，其粒徑多分散指數(shù)〈O. 2，優(yōu)選〈O. I。殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球粒徑均一提高了藥物的包埋率，實(shí)現(xiàn)了良好的批次重復(fù)性，有利于臨床報(bào)批和生物利用度。殼聚糖是ー種生物降解性高分子材料，其來(lái)源廣泛、安全、可靠，有良好的生物相容性，成為藥物緩釋載體的首選材料；殼聚糖作為藥物緩釋載體在減少給藥次數(shù)，降低藥物毒副作用，提高藥物療效等方面具有重要作用。本發(fā)明采用在基質(zhì)中添加殼聚糖衍生物(如季銨化殼聚糖)，制備成兼具多孔結(jié)構(gòu)和良好生物粘附性的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球。所述殼聚糖和殼聚糖衍生物的粘均分子量為5000-980000，優(yōu)選為10000-100000。所述殼聚糖與殼聚糖衍生物的質(zhì)量比為10:0-1:10，優(yōu)選為5:1-1:5。殼聚糖及其衍生物質(zhì)量比為10:0表示不含有殼聚糖衍生物。所述殼聚糖衍生物優(yōu)選選季銨化殼聚糖、羧化殼聚糖、巰基化殼聚糖或其混合物，特別優(yōu)選季銨化殼聚糖。所述殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球表面可通過電荷或活性基團(tuán)進(jìn)ー步裝載其他藥物，包括帶相反電性的藥物以及能與活性基團(tuán)偶聯(lián)的藥物，特別適用于基因藥物的裝載或靶向分子的偶聯(lián)。本發(fā)明另一方面提供了ー種裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球的制備方法。一種制備上述裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球的方法，包括以下步驟(I)溶解有難溶性藥物的與水不互溶的溶液作為內(nèi)油相I (O丨)；(2)含有水相乳化劑且溶解有殼聚糖或殼聚糖及其衍生物的混合物的酸性水溶液作為水相(W)；
(3)含有油溶性乳化劑且與水互不相溶的油性物質(zhì)作為外油相II (O11);(4)將油相I與水相混合得到O /W型初乳液；(5)將上述制得的O /W型初乳液與外油相II混合得到O /WzO11型預(yù)復(fù)乳液；(6)將上述預(yù)復(fù)乳液通過微孔膜，得到粒徑均一的復(fù)乳液；(7)向復(fù)乳液中加入交聯(lián)劑，使乳滴交聯(lián)固化得到裝載難溶性藥物的殼聚糖-売聚糖衍生物納米球。步驟(I)中所述的內(nèi)油相的有機(jī)溶劑具有揮發(fā)性，優(yōu)選為ニ氯甲烷、三氯甲烷、ニ
氯こ烷、こ酸こ酷。所述難溶性藥物的濃度為5-200mg/mL,優(yōu)選lO-lOOmg/mL。 所述殼聚糖或殼聚糖及其衍生物濃度可根據(jù)需要配置，通常情況下，其濃度優(yōu)選O. 5-2. 0wt%o步驟(2)中所述的水相乳化劑為水溶性乳化剤，選自吐溫-20、吐溫40、吐溫-60、Triton-X405,Brij ' 35中的ー種或兩種以上。步驟(3)中所述油性物質(zhì)選自液體石蠟、石油醚、橄欖油、棉子油、豆油、葵花子油、其它燒類碳?xì)浠衔镏械末`種或兩種以上。步驟(3)中所述油溶性乳化劑其親水親油平衡值HLB可以在3-6之間，選自失水山梨醇倍半油酸酷、甘油醚的聚合物、聚氧こ烯氫化蓖麻油、失水山梨醇三油酸酷、失水山梨醇單油酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、親油-親水嵌段共聚物、P0-500、P0-310中的ー種或兩種以上?；谕庥拖嗟馁|(zhì)量，所述油溶性乳化劑的濃度為20wt%以下，優(yōu)選O. 5-10wt%o步驟(4)中所述的初乳液需要油相(O1)與水相混合經(jīng)乳化得到，優(yōu)選經(jīng)高速均質(zhì)乳化或超聲乳化得到。所述油相(O1)與水相(W)的體積比為1:1-1:25，優(yōu)選1:3-1:20。步驟(5)中所述預(yù)復(fù)乳液通過乳化得到，優(yōu)選通過均質(zhì)乳化或超聲乳化制得。所述初乳液與外油相(O11)的體積比為1:1-1:70，優(yōu)選1:3-1:60。步驟(6)中所述預(yù)復(fù)乳液優(yōu)選在壓力作用下通過微孔膜。步驟(6)中所述壓カ為基本恒定的壓力，所述基本恒定的壓カ范圍為O. 5_40MPa，優(yōu)選 O. 5-5. OMPa,進(jìn)ー步優(yōu)選 O. 5-2. 5MPa。所述基本恒定的壓カ是指壓カ的波動(dòng)不超過10%，優(yōu)選不超過5%，更優(yōu)選不超過1%。壓カ與所用膜孔徑、內(nèi)外油相粘度和水相中殼聚糖含量有夫。例如所述基本恒定的壓カ范圍為O. 5-5. OMPa0還例如以孔徑為O. 5微米的膜、殼聚糖的醋酸水溶液濃度為O. 5%制備納微球，內(nèi)油相水相外油相(V/V/V)=l:5:200時(shí)，所用壓カ可以為2. OMPa ;在25°C下，以孔徑為O. 8微米的膜、其他條件相同時(shí)，所用壓カ可以為I. 5MPa，乳化過程均在瞬間完成。步驟(6)中所述微孔膜為表面親水或疏水中的ー種。所述微孔膜為表面親水或疏水中的ー種。一般來(lái)說，微孔膜孔徑較小時(shí)，所需操作壓カ較大，微孔膜的表面親、疏水性對(duì)所制備得到的殼聚糖納微球粒徑和粒徑均一性影響不大；當(dāng)微孔膜孔徑較大時(shí)，所需操作壓カ較小時(shí)，疏水性微孔膜較親水性微孔膜所制備得到的殼聚糖納微球粒徑小且粒徑均一性好。所述孔徑均一的微孔膜的表面疏水性可以通過本領(lǐng)域中已知的方法實(shí)現(xiàn)。所述微孔膜孔徑均一，微孔膜的孔徑范圍為O. 1-10. O μ m,優(yōu)選O. 2-9. O μ m ;所述預(yù)復(fù)乳液通過過膜的次數(shù)為一次以上，即通過同一微孔膜至少一次得到所述0/W/0型乳液，優(yōu)選為2-5次。例如，所述預(yù)復(fù)乳液可以連續(xù)或間歇地在相同壓カ條件下通過兩個(gè)或更多個(gè)孔徑均一的微孔膜，這些孔徑均一的微孔膜可具有相同或不同的孔徑。通過選擇具有合適孔徑的微孔膜，將預(yù)復(fù)乳液通過所述孔徑均一的微孔膜一次或多次后，所得乳液中的水相液滴 的粒徑分布多分散指數(shù)值會(huì)逐漸變小，因此在步驟(7)中交聯(lián)固化后即可得到本發(fā)明的平均粒徑為約幾十納米至約幾千納米的載難溶性藥物紫杉醇的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球。所述步驟(7)中交聯(lián)劑選自戊ニ醛、甲醛中的ー種或多種。所述乳滴交聯(lián)分為兩個(gè)階段，第一階段，乳液在低溫下固化，固化溫度為5-30°C，優(yōu)選為10-25°C，固化時(shí)間為O. 1-4. O小時(shí)，優(yōu)選O. 5-3. 5小時(shí)。該階段保證納米球已初步成型，有效地避免了因內(nèi)油相揮發(fā)過快，而導(dǎo)致的破乳、藥物包埋率降低甚至失敗的結(jié)果。第ニ階段，乳液緩慢加熱至較高溫度固化，固化溫度為35-70°C，優(yōu)選為40-65°C，加熱速率為O. 5°C /min-6°C /min,優(yōu)選 1°C /min_5°C /min,固化時(shí)間為 4-14 小時(shí)，優(yōu)選 5-12 小時(shí)。該階段控制納米晶的形成，隨著溫度的升高，內(nèi)油相逐漸揮發(fā)，納米晶緩慢原位結(jié)晶出來(lái)。由于第一階段的固化限制了紫杉醇的結(jié)晶空間，從而控制了藥物析出晶體的形狀和大小。另夕卜，后期的加熱加快了乳液滴的固化速率，避免了乳滴之間發(fā)生聚并，從而大大提高了納米球?qū)κ杷运幬锏难b載率，同時(shí)也可以改善最終納米球的分散性。步驟(7)中所述O i /WzO11型乳液中可以通過加入化學(xué)交聯(lián)劑飽和的甲苯溶液固化得到裝載難溶性藥物的殼聚糖及其衍生物納米球。所述步驟(7)制得的裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球，需用水洗滌后凍干保存。所述裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球，其作為ロ服制劑的應(yīng)用，ロ服生物利用度高達(dá)5-15%。該產(chǎn)品具有良好的細(xì)胞和黏附、細(xì)胞內(nèi)吞及粘膜通透特性。與傳統(tǒng)的注射制劑相比，該產(chǎn)品經(jīng)ロ服后對(duì)相應(yīng)的疾病展示出良好的治療效果及較低的毒副作用。除非特別說明，在本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)具有以下含義。在本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“殼聚糖”是指現(xiàn)有技術(shù)中命名為“殼聚糖”(Chitosan，縮寫CS)的產(chǎn)品，包括天然殼聚糖、改性殼聚糖及其衍生物。例如，從蝦殼、蟹殼等海產(chǎn)品廢棄物中提取的天然多糖，是由葡糖胺和N-こ?；咸前?N-acetyl-D-glucosamine)共聚物組成的多糖，是甲殼素(Chitin)脫こ?；漠a(chǎn)物。在本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“殼聚糖載藥納米球”是指包埋了難溶性藥物的殼聚糖納米球。在本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“均勻乳液”或“均一乳液”是指粒徑均一的0/W/0型復(fù)乳液。在本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“粒徑”是指由具有粒徑分析功能的Zeta電位儀ZetaPlus(Brookhaven Instruments Cooperation, USA)測(cè)得的體積平均粒徑。在本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“膜孔徑”是指微孔膜的體積平均孔徑。
本發(fā)明裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球采用殼聚糖和殼聚糖衍生物納米球作為難溶性藥物的載體，提供一種低毒高效的ロ服納米給藥系統(tǒng)。殼聚糖-殼聚糖其衍生物納米球是ー種良好親水性載體，由殼聚糖陽(yáng)離子衍生物制備的納米球是ー種良好的ロ服制劑載體，也可聯(lián)合裝載其他藥物或進(jìn)行功能化修飾。優(yōu)點(diǎn)是(I)利用復(fù)乳、兩階段的殼聚糖分步交聯(lián)技術(shù)，使難溶性藥物以納米晶的形式均勻分散在納米球中，實(shí)現(xiàn)高的裝載率，同時(shí)也提高了難溶性藥物的溶解度。(2)利用膜乳化技術(shù)制備粒徑均一的納米球，實(shí)現(xiàn)好的批次重復(fù)性，有利于臨床報(bào)批和高的生物利用度。(3)利用殼聚糖或殼聚糖衍生物的親水性，實(shí)現(xiàn)難溶性藥物較快穩(wěn)定釋放。(4)利用殼聚糖衍生物的陽(yáng)離子或活性基團(tuán)，可進(jìn)行正電荷功能化修飾，増加其經(jīng)ロ服后在胃腸道的吸收，并結(jié)合納米球的尺寸效應(yīng)使其可被吞噬細(xì)胞吞噬或穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而達(dá)到治療疾病的目的。(5 )由于具有良好的細(xì)胞和黏附、細(xì)胞內(nèi)吞及膜通透特性，該產(chǎn)品的ロ服生物利用度高達(dá)5-15%。相對(duì)于傳統(tǒng)的注射制劑相比，該產(chǎn)品經(jīng)ロ服后對(duì)相應(yīng)的疾病展示出良好的治療效果及較低的毒副作用。加之殼聚糖-殼聚糖衍生物天然的親水性及納米球本身在EPR效應(yīng)的作用下被動(dòng)靶向腫瘤的優(yōu)勢(shì)，増加其在腫瘤部位的富集，減少對(duì)正常細(xì)胞的殺傷作用從而展示出較低的毒副作用，有著潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值(6)利用該納米球表面留有的電荷或活性基團(tuán)可以聯(lián)合裝載其他藥物或偶聯(lián)靶向配體。其他藥物如基因藥物SiRNA，抗癌藥物阿霉素。靶向配體如RGD肽。(7)不穩(wěn)定易降解的藥物與殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球結(jié)合后有較好的穩(wěn)定性不易被降解，可提高導(dǎo)入細(xì)胞的效率和導(dǎo)入細(xì)胞后的功效。


圖I是制備裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖納米球的原理及流程示意圖。圖2是制備用于形成殼聚糖-売聚糖衍生物納米球的均一乳液的裝置及原理示意圖。A-裝置圖；B-原理3是實(shí)施例I制備的裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球的掃描電鏡及透射電鏡照片。A-掃描電鏡圖片；B-透射電鏡圖片圖4是實(shí)施例7中制備的聯(lián)合裝載紫杉醇及SiRNA的掃描電鏡和透射電鏡照片。A-掃描電鏡圖片；B-透射電鏡圖片圖5是比較實(shí)施例I中恒溫固定法制備的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球透射照片。圖6是實(shí)施例I和實(shí)施例6中制備的裝載難溶性藥物紫杉醇的殼聚糖-季銨化殼聚糖納米球(HTCC-NP:PTX)及殼聚糖納米球(CS-NP = PTX)的釋放曲線和釋藥10天后納米球的透射電鏡照片。A-納米球的釋放曲線；B-釋放10天后納米球的透射電鏡圖片圖7體內(nèi)外評(píng)價(jià)小腸對(duì)實(shí)施例I和實(shí)施例6制備的殼聚糖-季銨化殼聚糖及殼聚糖納米球透膜效果。A-透膜速率曲線；B-透膜途徑共聚焦結(jié)果；C-體內(nèi)小腸粘附與吸收檢測(cè)結(jié)果圖8體外評(píng)價(jià)實(shí)施例I和實(shí)施例6中所制備的殼聚糖-季銨化殼聚糖及殼聚糖納米球?qū)δ[瘤細(xì)胞的粘附效果圖。
圖9是腫瘤細(xì)胞LLC對(duì)實(shí)施例I和實(shí)施例6中所制備的殼聚糖-季銨化殼聚糖及殼聚糖納米球吞噬效果的考察。A-腫瘤細(xì)胞對(duì)納米球內(nèi)吞速率曲線；B-共聚焦檢測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)納米球內(nèi)吞量圖10體外評(píng)價(jià)實(shí)施例I和實(shí)施例6中所制備的空白或裝載難溶性藥物紫杉醇的殼聚糖-季銨化殼聚糖及殼聚糖納米球?qū)Π┘?xì)胞的毒性。A-空白納米球與商業(yè)化注射劑溶劑細(xì)胞毒性結(jié)果；B-載藥納米球與商業(yè)化注射制劑Taxol 細(xì)胞毒性結(jié)果圖11體內(nèi)評(píng)價(jià)實(shí)施例I和實(shí)施例6中所制備的裝載難溶性藥物紫杉醇的殼聚糖-季銨化殼聚糖及殼聚糖納米球經(jīng)ロ服給藥后的組織分布。A-載藥納米球與商業(yè)化注射制劑給藥后藥物分布結(jié)果；B-小動(dòng)物活 體成像檢測(cè)HTCC-NP:PTX被動(dòng)靶向效果圖12是實(shí)施例I和實(shí)施例6中所制備的裝載難溶性藥物紫杉醇的殼聚糖-季銨化殼聚糖及殼聚糖納米球經(jīng)ロ服給藥后對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制的評(píng)價(jià)。A-載藥納米球與商業(yè)化注射制劑給藥后的抑瘤結(jié)果；B-載藥納米球與商業(yè)化注射制劑給藥后小鼠生存率結(jié)果；C-載藥納米球與商業(yè)化注射制劑給藥后小鼠腫瘤情況及腫瘤細(xì)胞核凋亡結(jié)果圖13是實(shí)施例I和實(shí)施例6中所制備的裝載難溶性藥物紫杉醇的殼聚糖-季銨化殼聚糖及殼聚糖納米球經(jīng)ロ服給藥后對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒副作用的考察。A-載藥納米球與商業(yè)化注射制劑致敏結(jié)果；B-載藥納米球與商業(yè)化注射制劑給藥后小鼠血液毒性結(jié)果圖14是實(shí)施例7中所制備的聯(lián)合裝載難溶性抗腫瘤化療藥物及基因藥物的的殼聚糖-季銨化殼聚糖納米球細(xì)胞毒性的考察。圖15是實(shí)施例7中所制備的聯(lián)合裝載難溶性抗腫瘤化療藥物及基因藥物的的殼聚糖-季銨化殼聚糖納米球經(jīng)ロ服后抑瘤效果的考察。
具體實(shí)施例方式如果沒有特別指明，本發(fā)明中所有濃度單位均為wt%。本發(fā)明說明書附圖中所述標(biāo)記如下I-難溶性藥物2-內(nèi)油相3-殼聚糖-殼聚糖衍生物4-酸性水溶液5-內(nèi)油相(O1) 6-水相(W) 7-初乳液(0i/W) 8_外油相(O11)9-預(yù)復(fù)乳液(O I/W/0n) 10-微孔膜Iト復(fù)乳液12-放氣閥13-放氣閥14-壓カ表15-氮?dú)馊肟?16-容器17-乳液18-氮?dú)?9-分散相20-連續(xù)相21-預(yù)乳液22-均一乳液為便于理解本發(fā)明，本發(fā)明列舉實(shí)施例如下。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體限制，本領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容作出ー些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。實(shí)施例為更好地說明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的典型但非限制性的實(shí)施例如下裝載難溶性藥物的殼聚糖及其衍生物納米球的制備按圖I所示的步驟制備，具體步驟如下( I) Oj/ff/On型復(fù)乳液的制備
稱取一定量的難溶性藥物粉末溶解于揮發(fā)性且與水不互溶的有機(jī)溶劑中作為內(nèi)油相(O1)備用；再將一定量的殼聚糖(CS)或殼聚糖衍生物或其混合物、水相乳化劑以及其它添加劑加入到一定量的醋酸或檸檬酸等酸性水溶液中，并在磁力攪拌條件下充分溶解作為水相(W)備用；將ー種以上的油溶性乳化劑溶于油性液體作為外油相(O11)備用。首先將內(nèi)油相(O1)和水相(W)混合后，通過均質(zhì)乳化或超聲方法制備(VW型初乳液；將初乳液與外油相(O11)通過均質(zhì)乳化制備預(yù)復(fù)乳液，然后將此預(yù)乳液在一定壓カ下反復(fù)壓過表面親水或疏水的微孔膜，得到粒徑均一的(ViWA)11型乳液；該過程在圖2A所示的裝置中完成。內(nèi)油相為溶解有難溶性藥物的ニ氯甲烷、三氯甲烷、ニ氯こ烷、こ酸こ酯或其混合物的溶液，難溶性藥物包括紫杉醇、0-(氯こ酰氨甲?；?煙曲霉素醇、尼莫地平 、齊墩果酸、丹參酮II A及其混合物，難溶性藥物的濃度范圍優(yōu)選為lO-lOOmg/mL。殼聚糖及其衍生物的濃度可根據(jù)需要配制，通常情況下，其濃度優(yōu)選為O. 5-2. 0wt%。水相乳化劑包括Tween-60、Tween-20、Triton X-405及Br〗 j 35。外油相為在常溫下呈液體、且與水不互溶的油性物質(zhì)，可選擇使用液體石蠟和石油醚、橄欖油、棉子油、豆油、葵花子油、其它烷類碳?xì)浠衔锏龋部墒褂闷浠旌衔?。一般所選擇的油相沸點(diǎn)要比較高，揮發(fā)性較弱。油性乳化劑要溶解于所使用的油相中，可使用失水山梨醇倍半油酸酯(Arlacel83)、甘油醚的聚合物(如P0-500、P0-310)、聚氧こ烯氫化蓖麻油、失水山梨醇三油酸酯(司班85)、失水山梨醇單油酸酯(司班80)、失水山梨醇三硬脂酸酯(司班65)、親油-親水嵌段共聚物等。油相中乳化劑的濃度為O. 5-10wt%,內(nèi)油相水相外油相=1:3:30-1:10:600 (體積比)。(2) Oj/ff/On型復(fù)乳液的固化、洗滌向上述步驟(I)所得到的復(fù)乳液中緩慢滴加交聯(lián)劑或沉淀劑，對(duì)乳滴進(jìn)行固化。固化過程分兩個(gè)階段進(jìn)行，第一階段，將乳液在低溫下固化一段時(shí)間。第二階段緩慢加熱至較
高溫度固化。實(shí)施例I :裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球(HTCC-NP:PTX)的制備本實(shí)施選取紫杉醇為難溶性藥物模型，季銨化殼聚糖為殼聚糖衍生物模型。首先將孔徑為0. 5μπι的親水性膜置于液體石蠟與石油醚(體積比4:1)的混合油相中浸泡過夜或利用超聲波清洗機(jī)超聲I小時(shí)使膜孔充分被油相濕潤(rùn)。準(zhǔn)確稱取一定量的難溶性藥物紫杉醇粉末溶解于ニ氯甲烷中，濃度為60mg/mL，作為內(nèi)油相備用。稱取一定量的殼聚糖與季銨化殼聚糖的混合物(質(zhì)量比為1:2)溶于1%醋酸水溶液中，得到殼聚糖-季銨化殼聚糖的醋酸水溶液，其濃度為I. 0wt%,同時(shí)添加8%的水相乳化劑Bri, 35。室溫下磁力攪拌2小時(shí)使乳化劑充分溶解，最后將此溶液在2000rpm下離心除去不溶性雜質(zhì)，保留上清液作為水相備用。將油溶性乳化劑P0-310加入到IOOmL的液體石蠟和石油醚的混合物中，其濃度為 10wt%，攪拌至完全溶解作為外油相。將ImL上述紫杉醇ニ氯甲烷溶液與水相殼聚糖-季銨化殼聚糖的醋酸水溶液(1:3，V/V)混合并用超聲乳化5分鐘，形成初乳液。再將初乳液與配制好的外油相混合，在均質(zhì)乳化器在24000rpm下乳化I分鐘，形成預(yù)復(fù)乳液。然后，將所得預(yù)復(fù)乳液迅速倒入如圖2所示的膜乳化裝置中，在2. OMPa的氮?dú)鈮毫ο拢蛊淇焖偻ㄟ^孔徑均一的微孔膜，得到粒徑比較均一的0/W/0型復(fù)乳液，將所得復(fù)乳液作為預(yù)復(fù)乳液在
2.5MPa的氮?dú)鈮毫ο略俅瓮ㄟ^SPG微孔膜，反復(fù)乳化3次，最終得到粒徑均一的0/W/0型復(fù)乳液。SPG膜為Shirasu Porous Glass membrane的簡(jiǎn)稱,是一種多孔玻璃膜。SPG膜乳化法的特征是用極少量的表面活性劑就可得到良好的乳化物。乳化完畢后，向乳液中加入一定量戊ニ醛飽和的甲苯溶液。首先在室溫(25°C)下交聯(lián)固化I小時(shí)，并緩慢加熱(程序升溫，1°C/min)至50°C。再恒溫交聯(lián)反應(yīng)10小時(shí)，交聯(lián)反應(yīng)的攪拌速率為500rpm。交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，在HOOOrpm下離心，傾去上清液將殼聚糖-季銨化殼聚糖載藥納米球從油相中分離出來(lái)，依次用石油醚和蒸餾水洗滌，并將其保存在蒸餾水中。納米球的平均粒徑和粒徑分布采用具有粒徑分析功能的Zeta電位分析儀ZetaPlus測(cè)量，在水中納米球的平均直徑為130. 3納米，多分散指數(shù)為O. 034。納米球的掃描電鏡照片及透射電鏡照片如圖3所示。
以紫杉醇為難溶性藥物模型，殼聚糖-季銨化殼聚糖為ロ服納米載體材料模型，證明殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球能有效的裝載難溶性藥物、提高藥物的溶解度和ロ服生物利用度，并構(gòu)建Lewis肺癌作為腫瘤模型進(jìn)ー步驗(yàn)證該ロ服制劑的抑瘤效果。該產(chǎn)品可以克服現(xiàn)有紫杉醇載體毒性高、親水性差、血內(nèi)清除率高、藥物生物利用度低且釋藥速率難以控制、不具備臨床應(yīng)用價(jià)值等方面的不足。難溶性藥物納米晶能以原位結(jié)晶的方式均勻分布于納米球中，紫杉醇納米晶在10納米以內(nèi)。通過計(jì)算該納米球的載藥率為37. 8%。實(shí)施例2 :裝載不同難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球的制備選取羧化殼聚糖為殼聚糖衍生物模型。首先將孔徑為I. O μ m的親水性膜置于豆油與葵花子油按體積比2:1的混合油相中浸泡過夜或利用超聲波清洗器超聲I小時(shí)使膜孔充分被油相濕潤(rùn)。分別準(zhǔn)確稱取一定量的0-(氯こ酰氨甲?；?煙曲霉素醇、尼莫地平、齊墩果酸、丹參酮II A粉末溶解于內(nèi)油相三氯甲烷中，濃度分別為10mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、80mg/mL，作為內(nèi)油相備用。稱取一定量的殼聚糖-羧化殼聚糖(質(zhì)量比為10:1)溶于1%檸檬酸水溶液中，得到殼聚糖-羧化殼聚糖水溶液，其濃度為2. 0wt%,同時(shí)添加5%的水相乳化劑Tween-20。室溫下磁力攪拌2小時(shí)使乳化劑充分溶解，最后將此溶液在5000rpm下離心除去不溶性雜質(zhì)，保留上清液作為水相備用。將油溶性乳化劑P0-500加入到IOOmL的液體石蠟和石油醚的混合物中，其濃度為10wt%，攪拌至完全溶解作為外油相。將ImL的上述四種三氯甲烷溶液與水相(I 10，V/V)混合并用超聲乳化10分鐘，形成初乳液。再將初乳液與配制好的外油相混合，在均質(zhì)乳化器在30000rpm下乳化I分鐘，形成預(yù)復(fù)乳液。然后，將所得預(yù)復(fù)乳液迅速倒入如圖2所示的膜乳化裝置中，在2. OMPa的氮?dú)鈮毫ο?，使其快速通過孔徑均一的微孔膜，得到粒徑比較均一的0/W/0型復(fù)乳液，將所得復(fù)乳液作為預(yù)復(fù)乳液在2. OMPa的氮?dú)鈮毫ο略俅瓮ㄟ^微孔膜，反復(fù)乳化3次，最終得到粒徑均一的0/W/0型復(fù)乳液。乳化完畢后，向乳液中加入一定量甲醛飽和的甲苯溶液。首先在較低溫度(10°C)下交聯(lián)固化I小吋，并緩慢加熱(程序升溫，I0C /min)至50°C。再恒溫交聯(lián)反應(yīng)5小吋，交聯(lián)反應(yīng)的攪拌速率為500rpm。交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，在HOOOrpm下離心，傾去上清液將殼聚糖-羧化殼聚糖載藥納米球從油相中分離出來(lái)，依次用石油醚和蒸餾水洗滌，并將其保存在蒸餾水中。掃描電鏡照片及透射電鏡照片與實(shí)施例I中的結(jié)果相似，結(jié)果表明這四種難溶性藥物同紫杉醇ー樣，均能被成功包埋于殼聚糖納米球中，難溶性藥物納米晶也都能以原位結(jié)晶的方式均勻分布于納米球中。納米球的平均粒徑分別為470. 2,489. 4,462. 7,475. 6納米，多分散指數(shù)分別為O. 042,0. 054,0. 042,0. 071。納米球的載藥率分別為10. 3%,27. 8%、39. 6%,49. 7%。實(shí)施例3 :裝載難溶性藥物的不同孔徑的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球的制備本實(shí)施例選取紫杉醇為難溶性藥物模型，巰基化殼聚糖作為殼聚糖衍生物模型。首先將孔徑為3. Ομπι的親水性膜置于液體石蠟與棉子油(體積比1:2)的混合油相中浸泡過夜或超聲3小時(shí)使膜孔充分被油相濕潤(rùn)。準(zhǔn)確稱取一定量的難溶性藥物紫杉醇粉末溶解于內(nèi)油相ニ氯甲烷中，濃度為80mg/mL，作為內(nèi)油相備用。稱取一定量的殼聚糖與季銨化殼聚糖的混合物溶于1%醋酸水溶液中，殼聚糖與巰基化殼聚糖的質(zhì)量比分別定為10:1，I: I和1:10，得到三種不同的殼聚糖-巰基化殼聚糖的醋酸水溶液，其濃度均為2. 0wt%,同時(shí)添加8%的水相乳化劑Tween-60。磁力攪拌2小時(shí)使乳化劑充分溶解，最后將此溶液在2000rpm下離心除去不溶性雜質(zhì)，保留上清液作為水相備用。將油溶性乳化劑司班80加入到IOOmL的液體石蠟和棉子油的混合物中，其濃度為10wt%，攪拌至完全溶解作為外油相。將ImL的上述紫杉醇ニ氯甲烷溶液與水相(1:3，V/V)混合并用超聲乳化5分鐘，形成初乳液。再將初乳液與配制好的外油相混合，在均質(zhì)乳化器在24000rpm下乳化I分鐘，形成預(yù)復(fù)乳液。然后，將所 得預(yù)復(fù)乳液迅速倒入如圖2所示的膜乳化裝置中，在2. OMPa的氮?dú)鈮毫ο?，使其快速通過孔徑均一的微孔膜，得到粒徑比較均一的0/W/0型復(fù)乳液，將所得復(fù)乳液作為預(yù)復(fù)乳液在O. SMPa的氮?dú)鈮毫ο略俅瓮ㄟ^SPG微孔膜，反復(fù)乳化5次，最終得到粒徑均一的0/W/0型復(fù)乳液。乳化完畢后，向乳液中加入一定量戊ニ醛飽和的甲苯溶液。首先在室溫(15°C )下交聯(lián)固化O. 5小吋，并緩慢加熱(程序升溫，3°C /min)至55°C。再恒溫交聯(lián)反應(yīng)10小吋，交聯(lián)反應(yīng)的攪拌速率為300rpm。交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，在8000rpm下離心，傾去上清液將殼聚糖-巰基化殼聚糖載藥納米球從油相中分離出來(lái)，依次用石油醚和こ醇洗滌，并將其保存在こ醇中。然后利用臨界點(diǎn)干燥儀對(duì)制得的納米球進(jìn)行干燥，干燥后的納米球的平均孔徑采用BET全自動(dòng)比表面和孔隙度分析儀測(cè)量。測(cè)得的納米球的平均孔徑分別為6. 78nm、13. 96nm和19. 57nm。結(jié)果表明通過可以改變基質(zhì)中殼聚糖與季銨化殼聚糖的比例制備不同孔徑的殼聚糖-売聚糖衍生物納米球。透射電鏡與掃面電鏡與實(shí)施例I結(jié)果相似，表明殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球成功包埋難溶性藥物紫杉醇。該納米球的平均粒徑分別為524. 2,531. 7,529. 6納米，對(duì)紫杉醇的載藥率分別為45. 2%,43. 7%,41. 5%。實(shí)施例4 :裝載難溶性藥物的不同粒徑的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球產(chǎn)品的制備本實(shí)施選取尼莫地平為難溶性藥物模型，季銨化殼聚糖為衍生物模型。首先將孔徑分別為O. 2、1.4、5. 2和9. ομπι的親水性膜置于葵花子油與石油醚(體積比4:1)的混合油相中浸泡過夜或利用超聲波清洗器超聲I小時(shí)使膜孔充分被油相濕潤(rùn)。準(zhǔn)確稱取一定量的難溶性藥物尼莫地平粉末溶解于內(nèi)油相ニ氯甲烷中，濃度為50mg/mL，作為內(nèi)油相備用。稱取一定量的殼聚糖與季銨化殼聚糖(質(zhì)量比3:1)溶于1%醋酸水溶液中，得到濃度為O. 5wt%水溶液，同時(shí)添加8%的水相乳化劑Triton X-405。室溫下磁力攪拌3小時(shí)使乳化劑充分溶解，最后將此溶液在2000rpm下離心除去不溶性雜質(zhì)，保留上清液作為水相備用。將油溶性乳化劑司班80加入到IOOmL的葵花子油和石油醚的混合物中，其濃度為10wt%，攪拌至完全溶解作為外油相。將ImL的上述尼莫地平ニ氯甲烷溶液與水相(1:3，V/V)混合并用超聲乳化5分鐘，形成初乳液。再將初乳液與配制好的外油相混合，在均質(zhì)乳化器在24000rpm下乳化I分鐘，形成預(yù)復(fù)乳液。然后，將所得預(yù)復(fù)乳液迅速倒入如圖2所示的膜乳化裝置中，操作壓カ根據(jù)膜孔徑的不同而不同，分別在2. 5、I. 0,0. 5,0. 2MPa的氮?dú)鈮毫ο?，使其快速通過不同孔徑的微孔膜，得到粒徑比較均一的0/W/0型復(fù)乳液，將所得復(fù)乳液作為預(yù)復(fù)乳液在相同的氮?dú)鈮毫ο略俅瓮ㄟ^微孔膜，反復(fù)乳化3次，最終得到粒徑均一的0/W/0型復(fù)乳液。乳化完畢后，向乳液中加入一定量甲醛飽和的甲苯溶液。首先在室溫(25°C)下交聯(lián)固化I小時(shí)，并緩慢加熱(程序升溫，升溫速率為5°c /min)至50°C。再恒溫交聯(lián)反應(yīng)5小吋，交聯(lián)反應(yīng)的攪拌速率為500rpm。交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，在HOOOrpm下離心，傾去上清液將殼聚糖-売聚糖衍生物載藥納米球從油相中分離出來(lái)，依次用石油醚和水洗滌，并將其保存在水中。然后利用利用zeta電位及粒徑分析儀測(cè)得的納米球的平均粒徑大小分別為25. O、 340. 5和1946. 8納米，多分散指數(shù)分別為O. 089,0. 056和O. 092。結(jié)果表明可以通過改變膜孔徑及相應(yīng)的操作壓カ制得尺寸均一、可控的裝載難溶性藥物尼莫地平的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球產(chǎn)品。透射電鏡與掃描電鏡結(jié)果與實(shí)施例I中結(jié)果相似，說明尼莫地平能夠成功包埋于納米球中，尼莫地平晶體大小分別在2nm、5nm和8nm以下。納米球?qū)δ崮仄降妮d藥率分別為31. 2%,37. 1%、39· 7%。實(shí)施例5 :不同分子量的殼聚糖-殼聚糖衍生物制備裝載難溶性藥物的納米球產(chǎn)品本實(shí)施例選取O-(氯こ酰氨甲?；?煙曲霉素醇為難溶性藥物模型，不同分子量的殼聚糖與季銨化殼聚糖作為載體材料。首先將孔徑分別為O. 7 μ m的親水性膜置于橄欖油與棉子油(體積比1:1)的混合油相中浸泡過夜或利用超聲波清洗器超聲I小時(shí)使膜孔充分被油相濕潤(rùn)。準(zhǔn)確稱取一定量的難溶性藥物0-(氯こ酰氨甲?；?煙曲霉素醇粉末溶解于內(nèi)油相こ酸こ酯中，濃度為50mg/mL,作為內(nèi)油相備用。分別稱取不同粘均分子量(5000,50000，200000，980000)的殼聚糖及相應(yīng)的季銨化殼聚糖(質(zhì)量比2:1)溶于1%醋酸水溶液中，得到不同粘均分子量的殼聚糖-季銨化殼聚糖醋酸水溶液，其濃度為I. 0wt%,同時(shí)添加8%的水相乳化劑Bri j 35。室溫下磁力攪拌4小時(shí)使乳化劑充分溶解，最后將此溶液在2000rpm下離心除去不溶性雜質(zhì)，保留上清液作為水相備用。將油溶性乳化劑聚氧こ烯氫化蓖麻油加入到IOOmL的橄欖油與棉子油(體積比1:1)的混合油相，其濃度為10wt%，攪拌至完全溶解作為外油相。將ImL的上述0-(氯こ酰氨甲?；?煙曲霉素醇こ酸こ酯溶液與水相(1: 5，V/V)混合并用超聲乳化5分鐘，形成初乳液。再將初乳液與配制好的外油相混合，在均質(zhì)乳化器在24000rpm下乳化I分鐘，形成預(yù)復(fù)乳液。然后，將所得預(yù)復(fù)乳液迅速倒入如圖2所示的膜乳化裝置中，操作壓カ根據(jù)膜孔徑的不同而不同，在2. OMPa的氮?dú)鈮毫ο?，使其快速通過孔徑均一的微孔膜，得到粒徑比較均一的0/W/0型復(fù)乳液，將所得復(fù)乳液作為預(yù)復(fù)乳液在I. 6MPa的氮?dú)鈮毫ο略俅瓮ㄟ^SPG微孔膜，反復(fù)乳化4次，最終得到粒徑均一的0/W/0型復(fù)乳液。乳化完畢后，向乳液中加入一定量戊ニ醛飽和的甲苯溶液。首先在20°C下交聯(lián)固化I小時(shí)，并緩慢加熱(程序升溫，I0C /min)至50°C。再恒溫交聯(lián)反應(yīng)10小時(shí)，交聯(lián)反應(yīng)的攪拌速率為500rpm。交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后,在14000rpm下離心,傾去上清液將殼聚糖-殼聚糖衍生物載藥納米球從油相中分離出來(lái)，依次用こ醇和水迅速洗滌，并將其保存在水中。然后利用zeta電位及粒徑分析儀測(cè)定各組納米球的粒徑。測(cè)得的納米球的平均粒徑大小分別為137. 3，125. O、100. 5和90. 8納米，多分散指數(shù)分別為O. 037,0. 029、O. 054和O. 043。結(jié)果表明不同分子量的殼聚糖及其衍生物均可作為裝載難溶性藥物的納米球載體材料。各種納米球?qū)﹄y溶性藥物0-(氯こ酰氨甲?；?煙曲霉素醇的載藥率分別為 27. 9%、31· 2%, 35. 7%, 39. 4%。實(shí)施例6 :裝載難溶性藥物殼聚糖納米球產(chǎn)品(CS-NP = PTX)的制備本實(shí)施例選取紫杉醇為難溶性藥物模型，殼聚糖本身為載體材料。將孔徑為O. 5μπι的親水性膜置于橄欖油與棉子油(體積比1:1)的混合油相中浸泡過夜或利用超聲波清洗器超聲3小時(shí)使膜孔充分被油相濕潤(rùn)。準(zhǔn)確稱取一定量的紫杉醇粉末溶解于內(nèi)油相ニ氯甲烷中，濃度為50mg/mL，作為內(nèi)油相備用。稱取一定量的殼聚糖溶于2%檸檬酸水溶液中，得到殼聚糖檸檬酸水溶液，其濃度為2. Owt%,同時(shí)添加8%的水相乳化劑Triton X-405。室溫下磁力攪拌2小時(shí)使乳化劑充分溶解，最后將此溶液在2000rpm下離心除去不溶性雜質(zhì)，保留上清液作為水相備用。將油溶性乳化劑司班-80加入到IOOmL的橄欖油與棉子油(I: I)的混合油相，其濃度為10wt%，攪拌至完全溶解作為外油相。將ImL的上述紫杉醇ニ氯甲烷溶液與水相殼聚糖醋酸水溶液(I 10，V/V)混合并用超聲乳化5分鐘，形成初乳液。再將初乳液與配制好的外油相混合(體積比1:60)，在均質(zhì)乳化器在24000rpm下乳化I分鐘，形成預(yù)復(fù)乳液。然后，將所得預(yù)復(fù)乳液迅速倒入如圖2所示的膜乳化裝置中，在2. OMPa的氮?dú)鈮毫ο?，使其快速通過孔徑均一的微孔膜，得到粒徑比較均一的0/W/0型復(fù)乳液，將所得復(fù)乳液作為預(yù)復(fù)乳液在2. OMPa的氮?dú)鈮毫ο略俅瓮ㄟ^SPG微孔膜，反復(fù)乳化3次，最終得到粒徑均一的0/W/0型復(fù)乳液。乳化完畢后，向乳液中加入一定量戊ニ醛飽和的甲苯溶液。首先在室溫(25°C)下交聯(lián)固化I小時(shí)，并緩慢加熱(程序升溫，3°C/min)至50°C。再恒溫交聯(lián)反應(yīng)10小時(shí)，交聯(lián)反應(yīng)的攪拌速率為500rpm。交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，在14000rpm下離心，傾去上清液將殼聚糖載藥納米球從油相中分離出來(lái)，依次用石油醚和蒸餾水洗滌，并將其保存在蒸餾水中。納米球的平均粒徑和粒徑分布采用具有粒徑分析功能的Zeta電位分 析儀ZetaPlus測(cè)量，在水中納米球的平均直徑為125. O納米，多分散指數(shù)為O. 029。掃描電鏡照片及透射電鏡照片與實(shí)施例I中的結(jié)果相似，結(jié)果表明所制備的殼聚糖納米球粒徑均一，紫杉醇納米晶以原位結(jié)晶的方式均勻分布于納米球中。殼聚糖納米球?qū)ψ仙即嫉妮d藥率為36. 7%ο實(shí)施例7 :聯(lián)合裝載難溶性藥物及其他藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球產(chǎn)品的制備本實(shí)施例選取丹參酮II A為難溶性藥物模型，季銨化殼聚糖為殼聚糖衍生物模型，選取SiRNA為其他藥物模型。首先將孔徑分別為I. Ομπι的親水性膜置于液體石蠟與橄欖油(體積比4:1)的混合油相中浸泡過夜或利用超聲波清洗器超聲I小時(shí)使膜孔充分被油相濕潤(rùn)。準(zhǔn)確稱取一定量的難溶性藥物丹參酮II A粉末溶解于內(nèi)油相ニ氯甲烷中，濃度為80mg/mL，作為內(nèi)油相備用。稱取一定量的殼聚糖與季銨化殼聚糖(質(zhì)量比1:5)的混合物溶于1%醋酸水溶液中，得到殼聚糖與季銨化殼聚糖的混合溶液，其濃度為2. 0wt%,同時(shí)添加10%的水相乳化劑Bri j 35。室溫下磁力攪拌2小時(shí)使乳化劑充分溶解，最后將此溶液在2000rpm下離心除去不溶性雜質(zhì)，保留上清液作為水相備用。將油溶性乳化劑P0-310加入到IOOmL的液體石蠟和橄欖油的混合物中，其濃度為10wt%，攪拌至完全溶解作為外油相。將ImL的上述丹參酮II A ニ氯甲烷溶液與水相(1:3，V/V)混合并用超聲乳化5分鐘，形成初乳液。再將初乳液與配制好的外油相混合，在均質(zhì)乳化器在24000rpm下乳化I分鐘，形成預(yù)復(fù)乳液。然后，將所得預(yù)復(fù)乳液迅速倒入如圖2所示的膜乳化裝置中，操作壓カ根據(jù)膜孔徑的不同而不同，在2. OMPa的氮?dú)鈮毫ο?，使其快速通過孔徑均一的微孔膜，得到粒徑比較均一的0/W/0型復(fù)乳液，將所得復(fù)乳液作為預(yù)復(fù)乳液在2. OMPa的氮?dú)鈮毫ο略俅瓮ㄟ^微孔膜，反復(fù)乳化3次，最終得到粒徑均一的0/W/0型復(fù)乳液。乳化完畢后，向乳液中加入一定量戊ニ醛飽和的甲苯溶液。首先在15°C下交聯(lián)固化I小時(shí)，并緩慢加熱(程序升溫，5°C /min)至50°C。再恒溫交聯(lián)反應(yīng)8小時(shí)，交聯(lián)反應(yīng)的攪拌速率為500rpm。交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，在14000rpm下離心，傾去上清液將殼聚糖載藥納米球從油相中分離出來(lái)，依次用石油醚和水洗滌。然后將得到的納米球重新懸浮于溶解有siRNA的水溶液中，利用靜電吸附將SiRNA負(fù)載到裝載難溶性藥物的殼聚糖-季銨化殼聚糖納米球表面，經(jīng)水洗滌后重新包裹ー層帶正電的季銨化殼聚糖。游離在水溶液中的siRNA用微量核酸檢測(cè)儀測(cè)定，高達(dá)96%的siRNA被成功負(fù)載于殼聚糖-季銨化殼聚糖納米球表面。掃描和透射電鏡如圖4所示，難溶性藥物納米晶體大小為IOnm以內(nèi)，能均勻分散在納米球中。結(jié)果表明殼聚糖及其衍生物納米球可以聯(lián)合裝載難溶性藥物及其他藥物，經(jīng)測(cè)定該納米球?qū)﹄y溶性藥物丹參酮II A的載藥率為42. 7%。平均粒徑為342. 8納米，多分散指數(shù)為O. 057。實(shí)施例8 :不同內(nèi)油相制備裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球本實(shí)施例選取紫杉醇為難溶性藥物模型，殼聚糖與巰基化殼聚糖作為載體材料。首先將孔徑分別為O. 5 μ m的親水性膜置于橄欖油與棉子油(3:1)的混合油相中浸泡過夜或利用超聲波清洗器超聲2小時(shí)使膜孔充分被油相濕潤(rùn)。分別稱取四份相同量的難溶性藥物紫杉醇粉末溶解于不同的內(nèi)油相中(ニ氯甲烷、三氯甲烷、ニ氯こ烷和こ酸こ酷)中，濃度均為20mg/mL，作為內(nèi)油相備用。稱取一定量的殼聚糖_巰基化殼聚糖(質(zhì)量比4:1)溶于2%檸檬酸水溶液中，得到殼聚糖-巰基化殼聚糖的醋酸水溶液，其濃度為I. 0wt%,同時(shí)添加8%的水相乳化劑Bri, 35。室溫下磁力攪拌2小時(shí)使乳化劑充分溶解，最后將此溶液在2000rpm下離心除去不溶性雜質(zhì)，保留上清液作為水相備用。將油溶性乳化劑P0-500加入到IOOmL的液體石蠟和石油醚的混合物中，其濃度為10wt%，攪拌至完全溶解作為外油相。將ImL的上述紫杉醇溶液與水相(1:3，V/V)混合并用超聲乳化5分鐘，形成初乳液。再將初乳液與配制好的外油相混合，在均質(zhì)乳化器在24000rpm下乳化I分鐘，形成預(yù)復(fù)乳液。然后，將所得預(yù)復(fù)乳液迅速倒入如圖2所示的膜乳化裝置中，操作壓カ根據(jù)膜孔徑的不同而不同，在2. OMPa的氮?dú)鈮毫ο?，使其快速通過孔徑均一的微孔膜，得到粒徑比較均一的0/W/0型復(fù)乳液，將所得復(fù)乳液作為預(yù)復(fù)乳液在2. OMPa的氮?dú)鈮毫ο略俅瓮ㄟ^微孔膜，反復(fù)乳化3次，最終得到粒徑均一的0/W/0型復(fù)乳液。乳化完畢后，向乳液中加入一定量戊ニ醛飽和的甲苯溶液。首先在室溫(25°C)下交聯(lián)固化I小時(shí)，并緩慢加熱(程序升溫，1°C /min)至50°C。再恒溫交聯(lián)反應(yīng)10小時(shí)，交聯(lián)反應(yīng)的攪拌速率為500rpm。交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，在HOOOrpm下離心，傾去上清液將殼聚糖載藥納米球從油相中分離出來(lái)，依次用石油醚和水洗滌。然后利用zeta電位及粒徑分析儀測(cè)定制得的四種裝載難溶性藥物的殼聚糖-巰基化殼聚糖納米球粒徑。結(jié)果分別為125. 0nm、132. 5nm、120. lnm、129. 2nm，粒徑分布指數(shù)為0.042、0.037、0.079、0.029。掃描電鏡與透射電鏡結(jié)果與實(shí)施例I中結(jié)果相似。四種納米球?qū)﹄y溶性藥物紫杉醇的載藥率分別為17. 8%、18· 3%,20. 4%。以上結(jié)果表明，選用不同的內(nèi)油相均可以成功制得裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球產(chǎn)品。實(shí)施例9 :選用不同水相乳化劑制備裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球產(chǎn)品本實(shí)施例選取齊墩果酸為難溶性藥物模型，殼聚糖與巰基化殼聚糖作為載體材料。首先將孔徑分別為O. 5μπι的親水性膜置于液體石蠟與石油醚(體積比4:1)的混合油 相中浸泡過夜或利用超聲波清洗器超聲I小時(shí)使膜孔充分被油相濕潤(rùn)。稱取一定量的難溶性藥物齊墩果酸粉末溶解于內(nèi)油相ニ氯こ烷中，濃度均為80mg/mL，作為內(nèi)油相備用。稱取一定量的殼聚糖溶于1%檸檬酸水溶液中，得到殼聚糖的檸檬酸水溶液，其濃度為1.0wt%，同時(shí)添加8%的不同水相乳化劑(吐溫-20，吐溫-40，吐溫-60，Triton-X405, Bri j 35)。室溫下磁力攪拌2小時(shí)使乳化劑充分溶解，最后將此溶液在2000rpm下離心除去不溶性雜質(zhì),保留上清液作為水相備用。將油溶性乳化劑司班65加入到IOOmL的液體石蠟和石油醚的混合物中，其濃度為10wt%，攪拌至完全溶解作為外油相。將ImL的上述齊墩果酸溶液與水相(1:10，V/V)混合并用超聲乳化5分鐘，形成初乳液。再將初乳液與配制好的外油相混合，在均質(zhì)乳化器在20000rpm下乳化I分鐘，形成預(yù)復(fù)乳液。然后，將所得預(yù)復(fù)乳液迅速倒入如圖2所示的膜乳化裝置中，操作壓カ根據(jù)膜孔徑的不同而不同，在2. OMPa的氮?dú)鈮毫ο?，使其快速通過孔徑均一的微孔膜，得到粒徑比較均一的0/W/0型復(fù)乳液，將所得復(fù)乳液作為預(yù)復(fù)乳液在2. OMPa的氮?dú)鈮毫ο略俅瓮ㄟ^SPG微孔膜，反復(fù)乳化4次，最終得到粒徑 均一的0/W/0型復(fù)乳液。乳化完畢后，向乳液中加入一定量戊ニ醛飽和的甲苯溶液。首先在20°C下交聯(lián)固化3小時(shí)，并緩慢加熱(程序升溫，4°C /min)至50°C。再恒溫交聯(lián)反應(yīng)12小時(shí)，交聯(lián)反應(yīng)的攪拌速率為500rpm。交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，在12000rpm下離心，傾去上清液將殼聚糖-羧化殼聚糖載藥納米球從油相中分離出來(lái)，依次用石油醚和水洗滌。然后利用掃描電鏡與透射電鏡對(duì)制得的四種裝載難溶性藥物的納米球進(jìn)行觀察，結(jié)果與實(shí)施例I中結(jié)果相似。四種納米球的平均粒徑分別為150. 3nm、132. 7nm、142. 9nm，粒徑多分散指數(shù)分別為
O.032、O. 053、O. 062，納米球?qū)λ幬锏妮d藥率分別為37. 3%,39. 5%,42. 7%。結(jié)果表明，選用不同的水相乳化劑均可以成功制得裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球產(chǎn)品。比較實(shí)施例I :恒溫固化法制備裝載難溶性藥物的殼聚糖納米球產(chǎn)品本實(shí)施例選取齊墩果酸為難溶性藥物模型，殼聚糖作為載體材料。首先將孔徑分別為1.4μπι的親水性膜置于液體石蠟與石油醚(體積比4:1)的混合油相中浸泡過夜或利用超聲波清洗器或超聲I小時(shí)使膜孔充分被油相濕潤(rùn)。稱取一定量的難溶性藥物齊墩果酸粉末溶解于內(nèi)油相ニ氯甲烷中，濃度均為20mg/mL，作為內(nèi)油相備用。稱取一定量的殼聚糖溶于1%醋酸水溶液中，得到殼聚糖的醋酸水溶液，其濃度為I. 0wt%,同時(shí)添加8%的水相乳化劑BH j 35。室溫下磁力攪拌2小時(shí)使乳化劑充分溶解，最后將此溶液在2000rpm下離心除去不溶性雜質(zhì)，保留上清液作為水相備用。將油溶性乳化劑Arlacel83加入到IOOmL的液體石蠟和石油醚的混合物中，其濃度為10wt%，攪拌至完全溶解作為外油相。將ImL的上述齊墩果酸溶液與水相(1:3，V/V)混合并用超聲乳化5分鐘，形成初乳液。再將初乳液與配制好的外油相混合，在均質(zhì)乳化器在24000rpm下乳化I分鐘，形成預(yù)復(fù)乳液。然后，將所得預(yù)復(fù)乳液迅速倒入如圖2所示的膜乳化裝置中，操作壓カ根據(jù)膜孔徑的不同而不同，在2. OMPa的氮?dú)鈮毫ο拢蛊淇焖偻ㄟ^孔徑均一的微孔膜，得到粒徑比較均一的0/W/0型復(fù)乳液，將所得復(fù)乳液作為預(yù)復(fù)乳液在2. OMPa的氮?dú)鈮毫ο略俅瓮ㄟ^微孔膜，反復(fù)乳化3次，最終得到粒徑均一的0/W/0型復(fù)乳液。乳化完畢后，將乳液分為4批，加入一定量戊ニ醛飽和的甲苯溶液并恒溫固化，固化溫度分別為15°C、25°C、40°C、60°C，恒溫交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間均為12小時(shí)，交聯(lián)反應(yīng)的攪拌速率為500rpm。再交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，在HOOOrpm下離心，傾去上清液將殼聚糖載藥納米球從油相中分離出來(lái)，依次用石油醚和水洗滌。然后利用透射電鏡對(duì)制得的四種裝載難溶性藥物的納米球進(jìn)行觀察，結(jié)果均如圖5所示，沒有明顯的難溶性藥物晶體分散在納米球中，表明恒溫固化法不能將難溶性藥物成功包埋于殼聚糖納米球中。經(jīng)測(cè)定四種恒溫固化下納米球?qū)﹄y溶性藥物的載藥率分別為2. 17%,3. 18%,3. 47%、
3.79。
實(shí)施例10 :裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球釋藥行為的表征
取實(shí)施例I和實(shí)施例6制備的HTCC-NP:PTX和CS-NP:PTX考察其釋藥行為。將上述兩種載藥納米球分散于IOmL含O. l%Tween-80的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)中，配制成lmg/mL的懸池液。將其置于37°C, 120r/min的垂直混合儀上混合。在不同的時(shí)間點(diǎn)通過離心置換釋放液，并利用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定釋放液中的PTX含量，另外，對(duì)釋放10天后納米球的降解情況作了考察，相應(yīng)的結(jié)果如圖6所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，殼聚糖衍生物納米球(HTCC-NP)釋放藥物的速率明顯快于殼聚糖納米球(CS-NP)。因此，可以通過調(diào)節(jié)基質(zhì)中殼聚糖與其衍生物的比例來(lái)控制藥物的釋放速率。實(shí)施例11 :殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球生物粘附及透粘膜效果檢測(cè)I) Caco-2單層黏膜細(xì)胞模型的建立將Caco-2細(xì)胞置于常規(guī)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，以DMEM為培養(yǎng)液，其中含有4. 5g/L D-葡萄糖、L-谷氨酞胺，不含丙酮酸鈉和碳酸氫鈉。井向培養(yǎng)基中加入1%非必需氨基酸、1%青霉素-鏈霉素、10%胎牛血清，培養(yǎng)基最終pH值為7. 2。細(xì)胞在37°C、5%C02氣流下培養(yǎng)。細(xì)胞增殖程度達(dá)到80%_90%時(shí)，加入預(yù)熱過的O. 25%胰蛋白酶_0. 02%EDTA混合消化液潤(rùn)洗一次，然后倒掉消化液，再加入消化液，在37°C下消化2-3min，吸去消化液，カロ入適量培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞按50000個(gè)/mL，接種到Transwell膜AP側(cè)，接種后每?jī)商鞊Q液一次，一周后每日換液，培養(yǎng)至21天后，用跨膜電阻儀測(cè)量跨膜電阻，當(dāng)且僅當(dāng)電阻值高于800Ω · cm2的模型方可進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。2 ) CS-NP與HTCC-NP的透粘膜效果表征按照實(shí)施例I和實(shí)施例6制備HTCC-NP:PTX和CS-NP:PTX的方法，無(wú)需加內(nèi)油相，直接將水相與外油相混合后經(jīng)親水性膜制備得到粒徑均一的納米乳液滴，乳液經(jīng)進(jìn)一歩固化既得空白的殼聚糖納米球(CS-NP)及空白的殼聚糖-季銨化殼聚糖納米球(HTCC-NP)。Caco-2單層細(xì)胞模型成功建立后，吸除上層培養(yǎng)液。在上層加入含有一定濃度(I. Omg/mL)的 CS-NP 或 HTCC-NP O. 5mL,下層加入 DMEM 培養(yǎng)液 I. 5mL。于 37°C、5%C02 下孵育。在不同的時(shí)間點(diǎn)吸取下層培養(yǎng)液O. 5mL，并加入新鮮培養(yǎng)液O. 5mL。用酶標(biāo)儀測(cè)定吸取培養(yǎng)液的熒光值(激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為450nm和540nm)。根據(jù)納米球熒光值與體積之間關(guān)系，計(jì)算出納米球的個(gè)數(shù)，進(jìn)而計(jì)算出透過Caco-2單層細(xì)胞模型的納米球的百分比，結(jié)果如圖7A所示。結(jié)果顯示，具有正電荷的季銨殼聚糖納米球ロ服制劑具有良好的透粘膜能力。另外，將上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的細(xì)胞單層模型用Alexa Fluor 635phalloidin標(biāo)記細(xì)胞膜，通過共聚焦顯微鏡觀察其在切面處的圖像，結(jié)果如圖7B所示。結(jié)果證實(shí)，帶有正電 荷的殼聚糖-季銨殼聚糖納米球ロ服制劑可以打開粘膜細(xì)胞間通道，進(jìn)ー步提高了其透粘膜能力。3 ) CS-NP與HTCC-NP的粘附效果表征利用實(shí)施例11中步驟I)中的方法，將Caco-2接種于24孔板中，每隔一天更換ー次培養(yǎng)液，一周后每天更換一次。培養(yǎng)21天，Caco-2細(xì)胞長(zhǎng)成單層膜后用于納米球粘附效果評(píng)價(jià)。具體如下，吸除上層培養(yǎng)液，在每個(gè)孔加入含有一定濃度(I. Omg/mL)的CS-NP或HTCC-NPI. OmL。于4°C下孵育2h后洗除上層，并利用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)采集各個(gè)孔的熒光值，同時(shí)采集加入每個(gè)孔納米球總熒光值。根據(jù)熒光值換算出粘附于Caco-2細(xì)胞單層膜表面的納米球的百分?jǐn)?shù)，結(jié)果如圖8所示，帶有正電荷的殼聚糖-季銨殼聚糖納米球ロ服制劑HTCC-NP對(duì)Caco-2對(duì)小腸模型具有良好的粘附效果，HTCC-NP在作為難溶性藥物ロ服制劑載體方面具有好的應(yīng)用前景。實(shí)施例12 :腫瘤細(xì)胞對(duì)CS-NP或HTCC-NP內(nèi)吞速率的檢測(cè)I)腫瘤細(xì)胞模型以Lewis lung carcinoma (LLC)細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型，用含100IU/mL青霉素和100IU/mL鏈霉素及10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基為培養(yǎng)液，于37°C，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；細(xì)胞貼壁大于80%時(shí)進(jìn)行傳代。 2)腫瘤細(xì)胞對(duì)CS-NP或HTCC-NP內(nèi)吞的檢測(cè)LLC細(xì)胞按I X 105/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)24h后將培養(yǎng)液更換為含有一定濃度(100 μ g/mL)的CS-NP或HTCC-NP培養(yǎng)液，37°C下孵育，孵育不同時(shí)間后，吸除上層培養(yǎng)液，用PBS洗掉未被吞噬的殼聚糖納米球。隨后洗脫細(xì)胞，垂懸固定后用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度值，根據(jù)熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出細(xì)胞隨時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)納米球吞噬速率的變化，結(jié)果如圖9所示，腫瘤細(xì)胞LLC對(duì)帶有正電荷的殼聚糖-季銨殼聚糖納米球ロ服制劑(HTCC-NP)內(nèi)吞速率較CS-NP快，展示出其作為難溶性藥物ロ服制劑載體的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。將LLC細(xì)胞按I X 105/孔接種于24孔板中，24h后將培養(yǎng)液更換為含有一定濃度(100 μ g/mL) CS-NPiPTX或HTCC_NP:PTX的培養(yǎng)液，37°C下孵育24h。用PBS洗掉未被吞噬的載藥納米球，細(xì)胞進(jìn)一歩洗脫后，用こ腈萃取24h提取細(xì)胞內(nèi)的藥物。最后用HPLC測(cè)定細(xì)胞內(nèi)藥物含量，結(jié)果顯示與HTCC-NP:PTX共同孵育的細(xì)胞內(nèi)PTX含量是CS-NP = PTX的四倍。LLC細(xì)胞按I X 105/cm2接種于Petri皿中，24h后將培養(yǎng)液更換為含有一定濃度的CS-NP或HTCC-NP培養(yǎng)液(100 μ g/mL), 37°C下孵育24h。細(xì)胞經(jīng)洗滌，固定后染色。細(xì)胞膜用AleXafnuor 635phalloidin染色，細(xì)胞核用DAPI標(biāo)記。最后用激光共聚焦觀察細(xì)胞對(duì)納米球的內(nèi)吞情況，結(jié)果如圖9所示，腫瘤細(xì)胞對(duì)HTCC-NP內(nèi)吞量明顯高于CS-NP，說明陽(yáng)離子化的殼聚糖-季銨化殼聚糖納米球更容易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。實(shí)施例13 :空白及載藥納米球?qū)δ[瘤生長(zhǎng)抑制及體內(nèi)分布的檢測(cè)(I)LLC細(xì)胞按5X 104個(gè)/孔接種于96孔板中，37°C下孵育24h后，將實(shí)施例I和6中制得CS-NP、HTCC-NP、CS-NP:PTX和HTCC_NP:PTX稀釋成不同濃度，添加至平行孔中。48h后，用MTT測(cè)定不同給藥濃度對(duì)細(xì)胞殺傷毒性的影響，結(jié)果如圖10所示，空白球?qū)?xì)胞無(wú)明顯的殺傷毒性，展示出該ロ服制劑載體良好生物相容性，而HTCC-NP: PTX對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯的殺傷毒性，說明帶有正電荷的季銨化殼聚糖納米球更容易進(jìn)入并殺死腫瘤細(xì)胞。(2) CS-NP和HTCC-NP粘附及吸收體內(nèi)表征選擇C57BL/6小鼠進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，首先將CS-NP和HTCC-NP通過灌胃方式給藥三次。每隔6h給藥一次，每次給藥劑量為SOOyLGOmg/mL)。最后一次給藥后禁食6h，然后處死小鼠并摘取小鼠的小腸。小腸依次經(jīng)過洗滌、固定、包埋、切片、脫蠟、染色(DAPI染細(xì)胞核)和封片后用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖7C所示，陽(yáng)離子化的HTCC-NP對(duì)小腸的粘附效果較好，進(jìn)ー步提高了藥物的ロ服生物利用度。(3) CS-NP:PTX 及 HTCC-NP:PTX ロ服后藥物分布檢測(cè)I)腫瘤模型小鼠的建立
將100 μ L (I X 107個(gè)/mL)的LLC細(xì)胞接種于C57BL/6小鼠的左腋下，20-25天后腫瘤生長(zhǎng)至直徑約為15mm。2)藥物分布測(cè)定
將制得的CS-NP = PTX 及 HTCC_NP:PTX (10mg/kg PTX)ロ服給藥 24h 后，處死小鼠，摘取小鼠的胃、心、肝、脾、肺、腎及腫瘤組織。再用研磨機(jī)研磨各組織成勻漿。用ニ氯甲烷萃取各組織中的藥物PTX。ニ氯甲烷層揮發(fā)后，采用HPLC測(cè)定各個(gè)組織中的藥物含量。以臨床制劑Taxol 為對(duì)照組，通過尾靜脈注射給藥，給藥量劑量按lmg/kg的PTX給藥。結(jié)果顯示如圖IlA所示，殼聚糖-季銨化殼聚糖納米球給藥組小鼠腫瘤部位藥物濃度明顯高于其他給藥組，間接證明該ロ服制劑的在EPR效應(yīng)的作用下靶向腫瘤部位。通過加和計(jì)算各個(gè)組織中的總藥物含量得，求的兩種載藥納米球的ロ服生物利用度，CS-NPiPTX和HTCC_NP:PTX分別為5. 12%和14. 7%。用近紅外熒光Cy7標(biāo)記ロ服納米載體，給藥3、24小時(shí)后，用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)對(duì)納米球在體內(nèi)的分布進(jìn)行觀察。從小動(dòng)物活體成像的結(jié)果(圖11B)可以看出，ロ服納米載體能夠被動(dòng)靶向腫瘤部位，展示出其良好的應(yīng)用前景。實(shí)施例14 CS-NP: PTX及HTCC-NP: PTX經(jīng)ロ服后抑瘤效果觀察(I)按照實(shí)施例13中的方法構(gòu)建荷瘤小鼠模型共40只，隨機(jī)分為四組，PBS、Taxol , CS-NP:PTX 組和 HTCC-NP:PTX 組。PBS 按 100 μ L/ 只灌胃給藥，Taxol 按 lmg/kgPTX 經(jīng)尾靜脈給藥，CS-NPiPTX 及 HTCC_NP:PTX 按 10mg/kg PTX ロ服給藥。(2)相對(duì)腫瘤生長(zhǎng)速率觀察選取接種后第10天為治療期第O天，每天給藥后用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)(a)和寬(b)，并根據(jù)公式V=aXb2/2計(jì)算腫瘤體積。腫瘤生長(zhǎng)速率=第η天實(shí)際腫瘤體積/第O天實(shí)際腫瘤體積。并以時(shí)間(天)為橫坐標(biāo)，腫瘤生長(zhǎng)速率為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖12Α所示，HTCC-NP:PTX經(jīng)ロ服給藥后展示出明顯的抑瘤效果，在停止給藥后(第15天)，HTCC-NP:PTX還能夠展示出良好的抑瘤效果，說明納米球的緩釋效果，而Taxol*給藥組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)明顯加速。(3)荷瘤小鼠體重變化觀察從治療的第O天開始,姆次對(duì)荷瘤小鼠給藥后稱量各組小鼠體重。小鼠體重增長(zhǎng)速率=第η天實(shí)際小鼠平均體重/第O天實(shí)際小鼠平均體重。并以時(shí)間(天)為橫坐標(biāo)，小鼠體重生長(zhǎng)速率為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果顯示HTCC-NP:PTX經(jīng)ロ服給藥后小鼠體重波動(dòng)較小，未體現(xiàn)出明顯的毒副作用。(4)小鼠生存曲線的繪制量取每組小鼠腫瘤體積時(shí)，當(dāng)小鼠腫瘤體積達(dá)到3000mm3時(shí)視為死亡，計(jì)算出小鼠在第η天的死亡率，然后以(I-死亡率)為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖12B所示，ロ服用HTCC-NP:PTX能夠有效地延長(zhǎng)小鼠生命周期。(5)各治療組在最后一次給藥后30min尾靜脈取血100 μ L，用小鼠ELISA試劑盒測(cè)IgE水平。IgE是檢測(cè)I型變態(tài)反應(yīng)最重要的參數(shù)之一，隨著變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生IgE水平會(huì)顯著提高，結(jié)果如圖13所示，與臨床注射制劑相比，HTCC-NP:PTX經(jīng)ロ服給藥后，小鼠的IgE水平未出現(xiàn)明顯的升高，說明該ロ服制劑無(wú)明顯的毒副作用。(6)給藥納米球血液毒性考察各治療組連續(xù)給藥15天，末次給藥24h后，取各組小鼠全血(20 μ L/只)，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀測(cè)其紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板的數(shù)量變化，結(jié)果如圖13所示，htcc-np:ptx經(jīng)ロ服給藥后，小鼠白細(xì)胞數(shù)量未出現(xiàn)明顯的降低，說明該ロ服制劑無(wú)較明顯的血液毒性，其作為ロ服制劑具有的臨床應(yīng)用價(jià)值。實(shí)施例15 :聯(lián)合裝載有難溶性藥物及帶負(fù)電的其他藥物的的殼聚糖及其衍生物納米球復(fù)合物產(chǎn)品(HNP:PTX/siRNA+)作為ロ服制劑的應(yīng)用本實(shí)施例選取實(shí)施例7中制備的聯(lián)合裝載有難溶性藥物及其他藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球復(fù)合物產(chǎn)品作為ロ服制劑模型，其中選取紫杉醇為難溶性藥物模型，同時(shí)選擇siRNA作為其他藥物模型。制得裝載有紫杉醇及siRNA的季銨化殼聚糖納米球復(fù)合物產(chǎn)品(HNP:PTX/siRNA+)。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA序列
正義鏈CAGAUCAAGAGCAGUACTCt反義鏈GACUACUGCUCUUGAUCUGtt；2# 正義鏈UAUGUCAGACUCCUCAGGUtt反義鏈ACCUGAGGAGUCUGACAUAtt。(2)HNP:PTX/siRNA+復(fù)合物的表征將HP:PTX/siRNA+復(fù)合物分散在去離子水溶液中，得到濃度約為I. 0-2. Omg/L的溶液。納米球復(fù)合物的平均粒徑和粒徑分布采用具有粒徑分析功能的Zeta電位分析儀ZetaPlus測(cè)量。掃描電鏡照片及透射電鏡照片如圖4所示，與實(shí)施例I中的結(jié)果類似。結(jié)果表明所制備的裝載有難溶性藥物紫杉醇的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球粒徑均一。紫杉醇納米晶以原位析晶的方式均勻分布于納米球中。(3)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶HNP:PTX/siRNA+復(fù)合物抑制腫瘤生長(zhǎng)LLC細(xì)胞按5X104個(gè)/孔接種于96孔板中，37 °C下孵育24h。將單獨(dú)的mTERTsiRNA, MocksiRNA:HNP、mTERTsiRNA:HNPjP mTERTsiRNA:HNP:PTX 復(fù)合物稀釋成不同濃度，添加至平行孔中。48h后用MTT測(cè)定不同給藥濃度對(duì)細(xì)胞殺傷毒性的影響，結(jié)果如圖14所示，在24小時(shí)內(nèi)，對(duì)照組細(xì)胞、siRNA單獨(dú)處理及MocksiRNA = HNP對(duì)細(xì)胞沒有明顯的殺傷效果。而加入端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶mTERTsiRNA:HNP:PTX復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受到抑制。(4)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶HNP:PTX/s iRNA+復(fù)合物經(jīng)ロ服后抑瘤效果的觀察I)構(gòu)建小鼠腫瘤模型按照實(shí)施例13中的方法構(gòu)建荷瘤小鼠模型共50只，隨機(jī)分為五組，PBS、mTERTsiRNA、MocksiRNA:HNP、mTERTsiRNA:HNP、和 mTERTsiRNA:HNP:PTX。PBS 按 100 μ L/只灌胃給藥，Taxol 按lmg/kg PTX經(jīng)尾靜脈給藥，mTERTsiRNA按ΙΟηΜ/kg的濃度灌胃給藥100μL，MocksiRNA:HNP、mTERTsiRNA:HNP、和mTERTsiRNA:HNP:PTX按 10nM/kg siRNA ロ服給藥。2)相對(duì)腫瘤生長(zhǎng)速率觀察選取接種后第10天為第O天，每天給藥后量取腫瘤的長(zhǎng)(a)和寬(b)，并計(jì)算腫瘤體積V=aXb2/2。腫瘤生長(zhǎng)速率=第η天實(shí)際腫瘤體積/第O天實(shí)際腫瘤體積。并以時(shí)間(天)為橫坐標(biāo)，腫瘤生長(zhǎng)速率為縱坐標(biāo)作圖。結(jié)果如圖15所示，聯(lián)合裝載有難溶性藥物PTX及siRNA復(fù)合物納米球產(chǎn)品經(jīng)ロ服后的抑瘤效果最佳。申請(qǐng)人:聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來(lái)說明本發(fā)明的詳細(xì)エ藝設(shè)備和エ藝流程，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)エ藝設(shè)備和エ藝流程，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)エ藝設(shè)備和エ藝流程才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍 之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.ー種裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球，其特征在于，所述納米球?qū)﹄y溶性藥物的載藥率為10-50% ;所述難溶性藥物納米晶均勻分布在殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球中，所述藥物能夠穩(wěn)定快速釋放，釋放速率可控。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球，其特征在于，所述難溶性藥物以原位結(jié)晶的方式均勻分布在殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球中； 優(yōu)選地，所述難溶性藥物納米晶的粒徑為15nm以內(nèi)，優(yōu)選IOnm以內(nèi)，進(jìn)ー步優(yōu)選3nm以內(nèi)； 優(yōu)選地，所述難溶性藥物為脂溶性而水不溶性的藥物，優(yōu)選紫杉醇、0-(氯こ酰氨甲?；?煙曲霉素醇、尼莫地平、齊墩果酸、丹參酮II A或其混合物，特別優(yōu)選紫杉醇、0-(氯こ酰氨甲?；?煙曲霉素醇或其混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的殼聚糖-売聚糖衍生物納米球，其特征在于，所述納米球具有多孔結(jié)結(jié)構(gòu)，孔徑為40nm以內(nèi)，優(yōu)選30nm以內(nèi)，進(jìn)ー步優(yōu)選20nm以內(nèi)； 優(yōu)選地，所述殼聚糖-殼聚糖納米球，其粒徑均一，平均粒徑為20-1500nm，優(yōu)選為50_350nm ； 優(yōu)選地，所述殼聚糖-殼聚糖納米球，其粒徑多分散指數(shù)〈O. 2，優(yōu)選〈O. I。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球，其特征在于，所述殼聚糖和殼聚糖衍生物的粘均分子量為5000-980000，優(yōu)選為10000-100000 ； 優(yōu)選地，所述殼聚糖與殼聚糖衍生物的質(zhì)量比為10:0-1:10，優(yōu)選為5:1-1:5 ; 優(yōu)選地，所述殼聚糖衍生物優(yōu)選季銨化殼聚糖、羧化殼聚糖、巰基化殼聚糖或其混合物，特別優(yōu)選季銨化殼聚糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的殼聚糖-売聚糖衍生物納米球，其特征在于，所述納米球表面可通過電荷或活性基團(tuán)進(jìn)ー步裝載其他藥物，包括帶相反電性的藥物以及能與活性基團(tuán)偶聯(lián)的藥物，特別適用于基因藥物的裝載或靶向分子的偶聯(lián)。
6.ー種制備權(quán)利要求1-5任ー項(xiàng)裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 (1)溶解有難溶性藥物的與水不互溶的溶液作為內(nèi)油相I(O P ; (2)含有水相乳化劑且溶解有殼聚糖或殼聚糖及其衍生物的混合物的酸性水溶液作為水相(W)； (3)含有油溶性乳化劑且與水互不相溶的油性物質(zhì)作為外油相II(O11)； (4)將油相I與水相混合得到O /W型初乳液； (5)將上述制得的O /W型初乳液與外油相II混合得到O /W/0 π型預(yù)復(fù)乳液； (6)將上述預(yù)復(fù)乳液通過微孔膜，得到粒徑均一的復(fù)乳液； (7)向復(fù)乳液中加入交聯(lián)劑，使乳滴交聯(lián)固化得到裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在干，步驟(I)中所述的內(nèi)油相的有機(jī)溶劑具有揮發(fā)性，優(yōu)選為ニ氯甲烷、三氯甲烷、ニ氯こ烷、こ酸こ酯； 優(yōu)選地，所述難溶性藥物的濃度為5-200mg/mL，優(yōu)選lO-lOOmg/mL ； 優(yōu)選地，步驟(2)中所述的水相乳化劑為水溶性乳化剤，選自吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、Triton-X405、Brij 35中的ー種或兩種以上；優(yōu)選地，步驟(3)中所述油性物質(zhì)選自液體石蠟、石油醚、橄欖油、棉子油、豆油、葵花子油、其它烷類碳?xì)浠衔镏械末`種或兩種以上； 優(yōu)選地，步驟(3)中所述油溶性乳化劑其親水親油平衡值HLB可以在3-6之間，選自失水山梨醇倍半油酸酷、甘油醚的聚合物、聚氧こ烯氫化蓖麻油、失水山梨醇三油酸酷、失水山梨醇單油酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、親油-親水嵌段共聚物、P0-500、P0-310中的一種或兩種以上； 優(yōu)選地，基于外油相的質(zhì)量，所述油溶性乳化劑的濃度為20wt%以下，優(yōu)選O. 5-10wt% ；優(yōu)選地，步驟(4)中所述的初乳液需要油相(O1)與水相混合經(jīng)乳化得到，優(yōu)選經(jīng)高速均質(zhì)乳化或超聲乳化得到； 優(yōu)選地，所述油相(O1)與水相(W)的體積比為1:1-1:25，優(yōu)選1:3-1:20 ； 優(yōu)選地，步驟(5)中所述預(yù)復(fù)乳液通過乳化得到，優(yōu)選通過均質(zhì)乳化或超聲乳化制得； 優(yōu)選地，所述初乳液與外油相(O11)的體積比為1:1-1:70，優(yōu)選1:3-1:60。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于步驟(6)中所述預(yù)復(fù)乳液優(yōu)選在壓カ作用下通過微孔膜； 優(yōu)選地，步驟(6)中所述壓カ為基本恒定的壓力，所述基本恒定的壓カ范圍為O. 5-40MPa,優(yōu)選 O. 5-5. OMPa,進(jìn)ー步優(yōu)選 O. 5-2. 5MPa ； 優(yōu)選地，所述基本恒定的壓カ是指壓カ的波動(dòng)不超過10%，優(yōu)選不超過5%，更優(yōu)選不超過1% ； 優(yōu)選地，步驟(6)中所述微孔膜為表面親水或疏水中的ー種； 優(yōu)選地，所述微孔膜孔徑均一，微孔膜的孔徑范圍為O. 1-10. O μ m，優(yōu)選O. 2-9. O μ m ; 優(yōu)選地，所述預(yù)復(fù)乳液通過過膜的次數(shù)為一次以上，優(yōu)選為2-5次。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟(7)中交聯(lián)劑選自戊ニ醛、甲醛中的一種或其混合物； 優(yōu)選地，所述乳滴交聯(lián)分為兩個(gè)階段，第一階段，乳液在低溫下固化，固化溫度為5-30°C，優(yōu)選為10-25°C,固化時(shí)間為O. 1-4. O小時(shí)，優(yōu)選O. 5-3. 5小時(shí)；第ニ階段，乳液緩慢加熱至較高溫度固化，固化溫度為35-70°C，優(yōu)選為40-65°C，加熱速率為O. 5 °C /min-6°C /min,優(yōu)選1°C /min_5°C /min,固化時(shí)間為4-14小時(shí)，優(yōu)選5-12小時(shí)； 優(yōu)選地，步驟(7)中所述O1/WzO11型乳液中可以通過加入化學(xué)交聯(lián)劑飽和的甲苯溶液，固化得到裝載難溶性藥物的殼聚糖及其衍生物納米球； 優(yōu)選地，步驟(7)制得的裝載難溶性藥物的殼聚糖及其衍生物納米球，用水洗滌后凍干保存。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球作為ロ服制劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球產(chǎn)品。該產(chǎn)品具有多孔且孔徑可控的結(jié)構(gòu)，從而控制藥物較快、穩(wěn)定地釋放。作為口服制劑，由于其表面具有大量的正電荷，大大增加了在小腸部位的粘附性和膜通透性，提高了藥物的口服生物利用度。同時(shí)，該產(chǎn)品還可以聯(lián)合裝載帶有負(fù)電性的藥物或偶聯(lián)靶向配體，達(dá)到協(xié)同給藥或靶向給藥的目的。另外，該產(chǎn)品不但增加了患者的耐受，而且有較低的毒副作用。本發(fā)明還提供了一種制備裝載難溶性藥物的殼聚糖-殼聚糖衍生物納米球產(chǎn)品的方法，該方法制備的產(chǎn)品粒徑均一。該方法適用于水不溶而脂溶性藥物，能夠控制難溶性藥物納米晶以原位結(jié)晶方式均勻分布于納米球中，提高了對(duì)藥物的載藥率。
文檔編號(hào)A61K9/19GK102641245SQ201210154138
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月2日
發(fā)明者呂丕平, 周煒清, 王連艷, 蘇志國(guó), 馬光輝, 魏煒 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所