專利名稱：蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明與蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性有關(guān)。
背景技術(shù)：
在単一小瓶?jī)?nèi)混合懸浮抗原的做法很具吸引力[1，2，3]，但由于不同成分混合后產(chǎn)生相互作用而導(dǎo)致問(wèn)題，液體制劑尤其如此[4]。出現(xiàn)的問(wèn)題包括抗原干擾、抗原競(jìng)爭(zhēng)、抗原降解、抗原決定部位抑制和輔劑兼容性?；旌蟿┑馁|(zhì)量控制也比較困難。
不過(guò)，混合抗原并不一定有害。例如在產(chǎn)生免疫制劑中混合白喉、破傷風(fēng)和百日咳(英文簡(jiǎn)稱DTP)的抗原(使用整細(xì)胞(Pw)或無(wú)細(xì)胞(Pa)百日咳抗原)的做法已行之多年，實(shí)際上，在DTP進(jìn)ー步加入結(jié)合B型流感嗜血桿菌(H. influenzae) (Hib)囊狀多糖能加強(qiáng)對(duì)Hib成分產(chǎn)生的抗體反應(yīng)。[5]。混合抗原來(lái)預(yù)防麻疹、流行性腮腺炎和風(fēng)疹(英文簡(jiǎn)稱MMR)也是常見的。不過(guò)，產(chǎn)生免疫的藥品，例如DTP、Hib，滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒(IPV)B型肝炎病毒(HBV)等都有效能測(cè)驗(yàn)問(wèn)題的報(bào)告[6]。曾有報(bào)告指出關(guān)于選擇混合A型和B型肝炎病毒抗原[7]和Hib混合劑[8，9]的免疫助劑問(wèn)題。例如，氫氧化鋁是DTP抗原常用的免疫助齊U，但Hib囊狀多糖抗原在液體制劑中會(huì)被此鹽水解[6，10]。已知ー種五價(jià)Hib+DTPw+HBV液體免疫配方的HBV成分的免疫反應(yīng)由于混合制造而降低[11，12]，導(dǎo)致這一情況的可能原因是Hib和DTP成分協(xié)同抑制抗-HBV反應(yīng)。反之，未有報(bào)告指出ー種混合Hib+DTPa+polio+HBV的六價(jià)液體制劑配方的免疫性受不良的影響。這種六價(jià)產(chǎn)品HEXAVACTM在歐洲已獲核準(zhǔn)在人體使用。本發(fā)明的目標(biāo)是改善(例如穩(wěn)定性)液體混合疫苗和制造。尤其是改進(jìn)包括HBV抗原在內(nèi)的混合產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供制造抗原混合物的エ序，步驟如下(a)在酸性環(huán)境下使用磷化鋁液混合B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg) ； (b)以任何順序加入白喉抗原、破傷風(fēng)抗原和百日咳抗原至液體內(nèi)；并(c)加入Hib-結(jié)合抗原至液體內(nèi)。當(dāng)吸附至磷化鋁免疫助劑時(shí)，HBsAg的免疫性最佳，但當(dāng)吸附至氫氧化鋁或磷化鋁吋，Hib結(jié)合物會(huì)水解。本發(fā)明的エ序的優(yōu)點(diǎn)是制造ー種HBsAg被吸附至磷化鋁，而Hib-結(jié)合物卻不為磷化鋁所吸附的液體制劑。本エ序提供高HBsAg吸附能力和整體穩(wěn)定性。此外，本發(fā)明更提供ー種包含磷化鋁、HbsAg、白喉抗原、破傷風(fēng)抗原、百日咳抗原和Hib-結(jié)合抗原，其中HBsAg被吸附至磷化鋁免疫助劑而Hib-結(jié)合抗原卻不為鋁免疫助劑所吸附。
混合抗原的順序エ序步驟(a)至(C)應(yīng)以特定的順序進(jìn)行，即HBsAg比DTP抗原先加入磷化鋁液內(nèi)，Hib-結(jié)合物則在加入DTP抗原后才加入。在步驟(b)，比較好的順序是先加白喉抗原，然后加破傷風(fēng)和百日咳抗原，但不一定要這樣做。這樣可支持白喉抗原吸附至鋁免疫助劑。破傷風(fēng)和百日咳抗原可在步驟(b)內(nèi)以任何順序加入。加入每ー種抗原后，最好混合(例如攪拌)液體至少10分鐘(例如約30分鐘)。pH和溫度
本發(fā)明エ序的步驟(a)中，磷化鋁和HBsAg是在液狀中混合。這ー步驟使HBsAg吸附至磷化鋁免疫助劑?；旌蠒r(shí)，如果pH過(guò)低，HBsAg會(huì)變性。如果pH太高，HBsAg將不會(huì)吸附至磷化鋁。加入每ー種抗原后，エ序可能涉及調(diào)整pH的步驟。在步驟(a)加入HBsAg后，如必要，可調(diào)整pH至原來(lái)或與原來(lái)相似的pH。在步驟(b)加入個(gè)別的DTP后，可調(diào)整pH。步驟(b)后，并在步驟(c)加入Hib-結(jié)合抗原前，最好先調(diào)整pH大約至中性。在步驟(C)加入Hib-結(jié)合抗原后,最好調(diào)整pH以便更適合病人使用。pH最好在
7.O以下以預(yù)防白喉類毒素轉(zhuǎn)化成有毒狀態(tài)。因此，pH最好保持在6. 2和6. 9之間。本發(fā)明的エ序最好在15°C和30°C之間進(jìn)行(例如在19°C和27°C，或在23±4°C )。磷化鋁本發(fā)明的エ序基礎(chǔ)是在液狀混合抗原和磷化鋁。一般都稱這樣的液狀磷化鋁為“溶液”，但從嚴(yán)格的物理化學(xué)角度來(lái)說(shuō)，此鹽在水中不溶化，并形成懸浮液。磷化鋁最好使用液狀，以便加入HbsAg，井隨后加入其它抗原。加入抗原混合物前，最好先稀釋磷化鋁至要求的濃度，確保有一個(gè)均勻的溶液。加入HBsAg前Al3+的濃度通常在O和10mg/ml之間磷化鋁液體可以含緩沖劑，但并非必要。磷化鋁液最好經(jīng)過(guò)消毒。磷化鋁不能采用過(guò)濾消毒，最好采用高壓消毒法。磷化鋁液最好是無(wú)發(fā)熱質(zhì)。磷化鋁液也可含氯化鈉。B型肝炎病毒表面抗原HBsAg的制劑已有充分的文書說(shuō)明。多種形式的抗原已有說(shuō)明(例如包括全部或部分pre-S序列 ，參考14的L*抗原 ，參考15所述的preSl-preS2_S縮多氨酸或參考16所述的類似物；參考17和18所述的‘逃跑突變體’，例如含Gly145 — Arg突變的HBsAg)。上述任何ー種都可以在本發(fā)明使用。HBsAg可從血清或像酵母菌CHO細(xì)胞的真核壓榨系統(tǒng)中壓出[19]。最好是從酵母圃出οHBsAg通常是微粒狀。最好從酵母菌榨出時(shí)就已成微粒狀。HBsAg可以滅活,例如使用甲醒溶液處理。白喉抗原白喉抗原最好是白喉類毒素。白喉類毒素的制劑已有充分的文書說(shuō)明[例如參考20的第3章 '參考21的第9章]?？墒褂萌魏芜m合的白喉類毒素。
破傷風(fēng)抗原破傷風(fēng)抗原最好是破傷風(fēng)類毒素。破傷風(fēng)類毒素的制劑已有充分的文書說(shuō)明[例如參考20的第4章 '參考20的第18章]?？墒褂萌魏芜m合的破傷風(fēng)類毒素。百日咳抗原本發(fā)明使用的百日咳抗原可以是細(xì)胞(例如整個(gè)細(xì)胞)或非細(xì)胞抗原。兩種抗原的制劑都有充分的文書說(shuō)明[例如見參考201的第14章；也見參考22]。使用無(wú)細(xì)胞抗原時(shí)最好使用百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，最好與附屬肌動(dòng)蛋白(又稱為PRN或69kDa抗原)混合，并可選擇性加入凝集原(又稱菌毛)2和
3[23]。每ー疫苗劑量所含百日咳抗原的一般水平為=IOyg ΡΤ、5 μ g FHAJyg PRN、5yg混合菌毛。PT是ー種有毒的蛋白質(zhì)，當(dāng)在百日咳抗原中存在時(shí)，最好加以解毒。解毒的方法可使用化學(xué)和/或基因法。最好的解毒突變體是9K/129G雙突變體[24]，以下簡(jiǎn)稱‘rPT’。Hib-結(jié)合抗原一般的多糖結(jié)合物，尤其是B型流感嗜血桿菌(Hib)的制劑已有充分的文書說(shuō)明[例如參考25to 33等]。本發(fā)明可使用任何適合的Hib結(jié)合物。結(jié)合物的糖部分可以是多糖(例如全長(zhǎng)PRP)，但最好使用水解多糖(例如使用酸水解)形成低聚糖(例如從 I至 5kDa的MW)。如果進(jìn)行水解，水解物可根據(jù)大小分類，以便排除低聚糖，這種糖太短，不能產(chǎn)生免疫功能。按大小分開的低聚糖是最好的糖類抗原。結(jié)合物的載體部分通常是ー種蛋白質(zhì)。最好的載體蛋白質(zhì)是細(xì)菌毒素或類毒素，例如白喉或破傷風(fēng)類毒素。這些都是常用的結(jié)合疫苗。尤其最常用的是CRM197白喉類毒素[34,35,36]。其它適合的載體蛋白質(zhì)包括腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白質(zhì)[37]、合成縮氨酸[38，39]、熱震蛋白質(zhì)[40，41]、百日咳蛋白質(zhì)[42，43]、流感嗜血桿菌的D蛋白質(zhì)[44]、細(xì)胞活素[45]、淋巴因子[45]、荷爾蒙[45]、生長(zhǎng)激素[45]、艱難梭狀芽胞桿菌毒素A或B[46]等。也可以使用混合載體蛋白質(zhì)?？墒褂萌魏芜m當(dāng)?shù)募せ罨瘜W(xué)和/或連接化學(xué)結(jié)合Hib糖。通常，在結(jié)合前，糖會(huì)先被激活或功能化。激活程序可能涉及，例如cyanylating試劑，如CDAP(例如l-cyano-4-aimethylamino pyridinium tetraf Iuoroborate [47,48]).其廣匕適當(dāng)?shù)募夹g(shù)使用碳化ニ亞胺、hydrazides、激活酯、降冰片烷、P-硝基苯甲酸、N-羥基丁ニ醢亞胺、S-NHS、EDC、TSTU ;也請(qǐng)見參考49的簡(jiǎn)介)。連接可通過(guò)使用任何已知的程序制造的連接組，例如參考50和51所述的程序。一種連接法涉及多糖的還原胺化，偶合所得氨基組與己ニ酸連接組的一端，然后偶合一個(gè)蛋白質(zhì)至己ニ酸連接組的另一端[52，53，54]。其它的連接物包括B-丙醢胺基[55]、こ胺硝基苯酯[56]、鹵代醢鹵[57]、配糖鍵[58]、6_氨基己酸[59]、ADH[60]、C4至C12部分[61]等。除了使用連接物以外，可使用直接連接。直接連接至蛋白質(zhì)的步驟可能包括氧化多糖，然后與蛋白質(zhì)還原胺化，如參考62和63所述。最好的結(jié)合法是通過(guò)己ニ酸琥珀雙酯共價(jià)連接Hib糖至CRM197 [64，65]。本發(fā)明配方的特征本發(fā)明的エ序的配方包含抗原，其中一些吸附在磷化鋁免疫助劑。這些配方最好、是產(chǎn)生免疫的配方。本發(fā)明的配方有預(yù)防性(即預(yù)防感染)或治療性(即能治療所感染后的疾病)功能。配方最好是液體制劑(即非凍干配方)。這通常表示配方為液狀，例如懸浮液。本發(fā)明的成分最好經(jīng)過(guò)殺菌消毒。磷化鋁和完整細(xì)胞的百日咳抗原都不能使用過(guò)濾消毒，因此，本發(fā)明的成分最好使用高壓消毒法和/或在制造時(shí)使用經(jīng)過(guò)消毒的成分。本發(fā)明的成分最好無(wú)發(fā)熱質(zhì)。本發(fā)明的成分的pH是6. O和7. O之間。成分最好緩沖至這一 pH。本發(fā)明成分的Al3+濃度通常在O. I和2. Omg/ml之間。成分可含氯化鈉。配方內(nèi)的氯化鈉含量最好在O. I至100mg/ml之間。
HBsAg的含量通常是5和50 μ g/ml之間。最理想的含量是10和30mg/ml之間。白喉類毒素的含量通常是5和50Lf/ml之間。最理想的含量是7. 5和30Lf/ml之間。破傷風(fēng)類毒素的含量通常是I和20Lf/ml之間。最理想的含量是2和9Lf/ml之間。細(xì)胞百日咳抗原的百日咳抗原通常是5和500U/ml之間。最理想的含量是10和400U/ml 之間。Hib-結(jié)合抗原的含量通常是I和50 μ g/ml之間。最理想的含量是10和30mg/ml 之間。配方內(nèi)可能含防腐藥，例如硫柳汞。防腐藥最好是低含量(例如容積的O. 01% )。這可從外源加入，或是混合進(jìn)配方內(nèi)的主體抗原(例如在百日咳或HbsAg抗原內(nèi)存在的防腐藥)。不過(guò)，最好避免使用含水銀的防腐藥。其它適合人體使用的成分在參考66內(nèi)說(shuō)明。本發(fā)明的成分最好是盡量不含氫氧化鋁。本發(fā)明配方內(nèi)含的抗原達(dá)‘有效地產(chǎn)生免疫的分量’，即該分量在人體使用吋，無(wú)論是單一劑量或系列劑量的一部分，都能有效地治療或預(yù)防疾病。這ー分量視接受治療者的健康和身體狀況、年齡、接受治療者的分類(例如非人類靈長(zhǎng)、靈長(zhǎng)等)、受治療者免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所希望得到的保護(hù)程度、配方的程序、醫(yī)生對(duì)病況的診斷和其它相關(guān)因素有所改動(dòng)。預(yù)期分量范圍廣泛，并由常規(guī)試驗(yàn)確定。治療劑量可使用單ー劑量或多劑量(例如包括加強(qiáng)劑量)。本配方可與其它免疫調(diào)節(jié)劑并用。通常，本發(fā)明的配方為注射制劑。本配方通常不經(jīng)腸胃，直接注射體內(nèi)(例如注射至皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或組織的間隙)。此外，本配方也可以在損傷的部位使用。一旦制成，本發(fā)明的配方可直接給受治療者使用。受治療者可以是動(dòng)物；尤其是人類受治療者。疫苗尤其適合為兒童和青少年進(jìn)行免疫注射。已知標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物和試管模型和評(píng)估HBV、Hib和DTP產(chǎn)品的效カ的相關(guān)保護(hù)?？乖皆诒景l(fā)明的配方中，HBsAg吸附至磷化鋁。吸附的步驟最好是大部分完成，例如配方內(nèi)的總HbsAg重量至少有80 %已吸附(例如至少85 %、90 %、95 %、98 %、99 %或更多)。白喉類毒素通常吸附至磷化鋁。吸附的步驟最好是部分完成，例如配方內(nèi)的總白喉類毒素重量約有30-80%已吸附(例如約40%-70%、約50%-60%等)。如果儲(chǔ)存在約37°C，白喉類毒素的吸附會(huì)隨時(shí)間增加。破傷風(fēng)類毒素通常吸附至磷化鋁。吸附的步驟最好是部分完成，例如配方內(nèi)的總破傷風(fēng)類毒素重量40%以下已吸附(例如30%以下、20%以下、10%以下等)。破傷風(fēng)類毒素的吸附水平可能約為0%。Hib-結(jié)合物不吸附至鋁免疫助劑。治療法使用本發(fā)明的配方可提高患者的免疫反應(yīng)。 本發(fā)明提供的配方可作藥劑使用(例如作為ー種產(chǎn)生免疫的配方)。此外，本發(fā)明也提供配方制造藥劑來(lái)治療和/或預(yù)防疾病。這些方法或用法可保護(hù)免受HBV、白喉?xiàng)U菌、破傷風(fēng)桿菌、百日咳桿菌和/或b型流感嗜血桿菌的感染。這些病菌可導(dǎo)致肝炎、白喉、破傷風(fēng)、百日咳和/或細(xì)菌腦膜炎。此方法或用法能更好地提供保護(hù)不感染這些疾病。流感嗜血桿菌引起的其它疾病包括中耳炎、支氣管炎、肺炎、蜂窩織炎和心包炎。患者最好是人類?；颊咦詈檬莾和?。此方法在已接受疫苗的患者中可提高加強(qiáng)反應(yīng)。配方的單位劑量通常是O. 5ml。此外，本發(fā)明也提供ー個(gè)含有本發(fā)明配方的輸送設(shè)備(例如ー個(gè)針筒，或免針注射器)。設(shè)備最好是含有單ー劑量。配方的進(jìn)ー步成分本發(fā)明的成分最好是五價(jià)成分(I)HBsAg ； (2) Hib ； (3)白喉；(4)破傷風(fēng)；(5)百日咳。不過(guò),本發(fā)明并不排除加入其它抗原的可能性(例如產(chǎn)生六價(jià)、七價(jià)、八價(jià)、九價(jià)、十價(jià)或以上的配方)。例如，配方可包含下列一或多種抗原-腦膜炎奈瑟球菌血清群B的蛋白抗原，例如參考67至73，-腦膜炎奈瑟球菌血清群B的外膜泡(OMV)制劑，例如參考74，75，76，77等所述。-腦膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，如參考78所述，來(lái)自血清群C的低聚糖[也見參考79]或參考80的低聚糖。-來(lái)自肺炎鏈球菌的糖抗原[例如81，82，83]。-來(lái)自A型肝炎病毒的抗原，例如滅活病毒[例如84，85]。-脊髓灰質(zhì)炎抗原[例如86，87]例如OPV或最好是IPV。配方可能包含以上一或多種抗原。定義“包含”的意思是“包括”和“組成”例如ー個(gè)“包含” X的配方可単獨(dú)由X組成或可包括一些其它成分例如X+Y?！凹s”與數(shù)值X的關(guān)系表示，例如x±10%。繪圖簡(jiǎn)介圖I顯示本發(fā)明配方HBsAg穩(wěn)定性的惠斯頓印跡法結(jié)果。圖2顯示本發(fā)明配方白喉類毒素的免疫擴(kuò)散結(jié)果。圖3顯示本發(fā)明配方破傷風(fēng)類毒素的免疫擴(kuò)散結(jié)果。
圖4顯示本發(fā)明配方pH隨時(shí)間的變化。實(shí)行發(fā)明的模式液體制劑基本制劑法(I)加入酵母壓榨的HBsAg至磷化鋁液；(2)加入D然后T然后P抗原；⑶調(diào)整PH和(4)加入Hib-CRM197結(jié)合物。以下是進(jìn)ー步詳情-先用磷化鋁免疫助劑-加入HBsAg 液(pH 7. O 在 PBS)至最后濃度 20 μ g/ml-調(diào)整pH-攪拌30±5分鐘(讓HBsAg吸附至免疫助劑)-加入白喉類毒素至最后濃度15Lf/ml-攪拌30分鐘-加入破傷風(fēng)類毒素至最后濃度6.5Lf/ml-攪拌30分鐘-加入細(xì)胞百日咳抗原至最后濃度300U/ml-攪拌30分鐘-如必要，調(diào)整pH-加入CRM197_Hib結(jié)合物至最后濃度20μ g/ml-攪拌15分鐘配方的最后抗原成分主要如下
權(quán)利要求
1.一種制造抗原配方懸浮液的方法，該方法包括 (a)在酸性環(huán)境下使用磷化鋁液混合B型肝炎病毒表面抗原HBsAg； (b)以任何順序加入白喉抗原、破傷風(fēng)抗原和百日咳抗原至液體內(nèi)；并 (c)加入Hib-結(jié)合抗原至液體內(nèi)。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中白喉抗原比破傷風(fēng)和百日咳抗原先加入。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中加入了每ー種抗原后都調(diào)整pH。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其中在步驟(c)后pH調(diào)整至6.O至7. O之間。
5.如權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其中該方法在15°C和30°C之間進(jìn)行。
6.—種配方，其特征在于，它用權(quán)利要求1-5任一所述的方法制得。
7.ー種液狀配方，它包含下列成分磷化鋁、B型肝炎病毒表面抗原HBsAg、白喉抗原、破傷風(fēng)抗原、百日咳抗原和Hib-結(jié)合抗原,其中B型肝炎病毒表面抗原HBsAg被吸附至磷化鋁而Hib-結(jié)合抗原卻不為磷化鋁所吸附。
8.如權(quán)利要求6或7所述的配方，其特征在于，它是一種產(chǎn)生免疫的配方。
9.一種提高患者免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給予病人權(quán)利要求6-8任一所述的配方。
10.ー種藥物，其特征在于，它含有權(quán)利要求6-8任一所述的配方。
11.權(quán)利要求6-8任一所述的配方在制備用于治療和/或預(yù)防B型肝炎、白喉?xiàng)U菌、破傷風(fēng)桿菌、百日咳桿菌和/或b型流感嗜血桿菌的藥物中的用途。
12.—種輸注裝置,其特征在于,它含有權(quán)利要求6-8任一所述的配方。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性。本發(fā)明提供了一種制造抗原組合物懸浮液的方法，該方法包括(a)在酸性環(huán)境下使用磷酸鋁液混合B型肝炎病毒表面抗原HBsAg；(b)以任何順序加入白喉抗原、破傷風(fēng)抗原和百日咳抗原至液體內(nèi)；并(c)加入Hib-結(jié)合抗原至液體內(nèi)。本發(fā)明還提供了用該方法制得的組合物及其應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P31/12GK102716477SQ20121015719
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2003年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月8日
發(fā)明者M·肯托尼 申請(qǐng)人:諾華疫苗和診斷有限責(zé)任公司