專利名稱：重組沃氏菌天門冬酰胺酶藥物組合物及其制備法和應(yīng)用的制作方法
重組沃氏菌天門冬酰胺酶藥物組合物及其制備法和應(yīng)用本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說是ー種能用于治療癌癥的重組沃氏菌天門冬酰胺酶的藥物組合物及其制備法。天門冬酰胺酶能選擇性地抑制癌細(xì)胞生長，臨床上主要用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphocytic leukemia)和惡性淋巴瘤等癌癥疾病。目前臨床上使用的產(chǎn)品大多數(shù)是大腸桿菌(E. coli)和歐文氏菌(Erwinia carotovora)的天門冬酰胺酶；2011年美國FDA也批準(zhǔn)了另ー種歐氏菌(Erwinia chrysanthemi)的天門冬酰胺酶用于臨床。另外，還可對大腸桿菌的天門冬酰胺酶用聚こニ醇(Polyethylene Glycol, PEG)進(jìn)行修 飾為培門冬酶，以增加其穩(wěn)定性，并降低其致過敏性。其代表產(chǎn)品為Oncaspar (EnzonPharmaceuticals Inc),國內(nèi)由恒瑞醫(yī)藥仿制；以上產(chǎn)品均已使用于臨床。其中大腸桿菌的天門冬酰胺酶和歐氏菌的天門冬酰胺酶已在臨床使用了較長時間，暴露出一定的毒副作用，這些毒副作用大多與酶對底物的專ー性不佳有夫；而且長期使用后，ー些患者會產(chǎn)生抗體，有耐受性的問題；而聚こニ醇修飾的酶價格過于昂貴，同時其酶活性比未修飾前會有所降低，而且在免疫反應(yīng)上與未修飾的大腸桿菌的天門冬酰胺酶有一定的交叉，這限制了該種藥物在臨床上的大面積使用。沃氏菌的天門冬酰胺酶作為ー種新型的天門冬酰胺酶，與已有臨床產(chǎn)品無免疫交叉性，同時對底物天門冬酰胺的專ー性更佳，穩(wěn)定性也較好，因而具有良好的癌癥治療價值。中國專利[申請?zhí)?011062300382900]描述了ー種重組沃氏菌的天門冬酰胺酶的制備法，但表達(dá)水平、使用IPTG (對人有一定的肝毒性)作為表達(dá)誘導(dǎo)物和所用質(zhì)粒的青霉素(特定人群有過敏反應(yīng))抗性尚不能完全滿足作為ー種生物藥物的制備要求，另外也沒有直接闡明其抗癌活性。本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供多種重組沃氏菌天門冬酰胺酶藥物組合物及其制備法和應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明設(shè)計ー種重組沃氏菌的天門冬酰胺酶注射藥物，包括天門冬酰胺酶和相關(guān)輔料甘露醇、甘氨酸；也可不添加輔料，藥物組合物每支含量為
5,0001. U.或10，0001. U.，主要組成為5，0001. U.的重組沃氏菌的天門冬酰胺酶，40mg甘露醇或10，0001. U.的重組沃氏菌的天門冬酰胺酶，80mg甘露醇；或5，0001. U.的重組沃氏菌的天門冬酰胺酶，24. 3mg的甘氨酸，pH為7. O或10，0001. U.重組沃氏菌的天門冬酰胺酶，48. 6mg 甘氨酸，pH 7. O。本發(fā)明還包括另ー種重組沃氏菌的天門冬酰胺酶注射藥物，其特征在于注射液體積為5ml每支，主要組成為主要組成為5，0001. U.或10,0001. U.的重組沃氏菌的天門冬酰胺酶，5mmol/L的L-半胱氨酸,20mmol/L的磷酸緩沖液,O. 7%的氯化鈉。本發(fā)明還包括上述的藥物組合物的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟a.將含沃氏菌的天門冬酰胺酶基因克隆到表達(dá)質(zhì)粒中(如PET30)，該表達(dá)質(zhì)粒的特征為含有卡那霉素抗性基因；表達(dá)的啟動子為T71ac或T7 ;沃氏菌的天門冬酰胺酶基因沒有融合任何標(biāo)簽序列或其他外源性DNA序列；b.將步驟a的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到含DE3基因的大腸桿菌中，大腸桿菌可以是B型如BL21(DE3)或K21型如HMS174 (DE3)，利用卡那霉素的抗性，選擇獲得含有I中所述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的單ー菌落，卡那霉素的濃度為30-50 μ g/ml ；C.步驟b的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌單菌落在含30 μ g/ml的LB培養(yǎng)基中37°C，震蕩培養(yǎng)；再接種于表達(dá)培養(yǎng)基(蛋白胨12g/L ;酵母提取物24g/L ；KH2PO4O. 17mol/L ；K2HP040. 72mol/ L;甘油 4ml/L ;葡萄糖 O. 05% (w/v);乳糖 O. 2% (w/v);硫酸鎂 2mmol/L ;30 μ g/ml 卡那霉素)中37°C培養(yǎng)16-18hr ;該表達(dá)培養(yǎng)基的特征在于含葡萄糖和乳糖的混合物，其比例為葡萄糖乳糖(重量比)=0. 2-0. 3 I，要獲得高水平表達(dá)培養(yǎng)時間為16-18hr ；d.步驟c的菌體離心，破碎，將重組沃氏菌的天門冬酰胺酶從菌體中釋放出，再用陰離子交換柱層析和疏水柱層析純化得到重組沃氏菌天門冬酰胺酶；該產(chǎn)品在SDS-PAGE上呈分子量為35kDa的單一條帶，HPLC測定的純度在90%以上，比活2501. U. /mg以上；e.上述步驟d純化后的重組沃氏菌天門冬酰胺酶，按a中所述比例加入甘露醇或甘氨酸，冷凍干燥，得到注射用重組沃氏菌天門冬酰胺酶。所述的用陰離子交換柱層析和疏水柱層析的ニ步柱層析方法包括以下步驟I)、用陰離子交換柱層析法吸附雜質(zhì)蛋白，收集不被吸附的重組天門酰胺酶，并進(jìn)行超濾濃縮；2)、經(jīng)過上述分離步驟得到的重組天門冬酰胺酶再用疏水色譜層析進(jìn)行精制。所述的藥物組合物可以應(yīng)用于抑制多種癌細(xì)胞生長的抗癌活性，治療相關(guān)的癌癥疾病。本發(fā)明提供了ー種具有明確抗癌活性的重組沃氏菌天門冬酰胺酶藥物組合物；在制備過程中避免了有毒性的IPTG的添加，同時實現(xiàn)高水平地表達(dá)，所用表達(dá)質(zhì)粒的卡那霉素抗性基因也符合生物藥物的制備要求。圖I為純化后重組沃氏菌天門冬酰胺酶HPLC圖譜；圖2為本發(fā)明的含沃氏菌天門冬酰胺酶DNA的表達(dá)載體；圖3為重組沃氏菌天門冬酰胺酶對小鼠和人白血病癌細(xì)胞的抑制増殖作用曲線；圖4為重組沃氏菌天門冬酰胺酶對不同癌細(xì)胞的抑制増殖作用所測定的IC5tl值；結(jié)合附圖
對本發(fā)明做進(jìn)ー步說明，本發(fā)明所用裝置的結(jié)構(gòu)和對本專業(yè)的人來說是非常清楚的。本發(fā)明的裝置和結(jié)構(gòu)包括但不限于下述實施例。實施例一重組沃氏菌天門冬酰胺酶的表達(dá)
含有Ikb的沃氏菌天門冬酰胺酶DNA片段的質(zhì)粒(pJET/WAP)，用Nde I和Sal I消化(37°C，lhr)，切取Ikb的DNA片段，用DNA瓊脂糖回收試劑盒提純目的DNA片段。該提純后的DNA片段插入到表達(dá)質(zhì)粒pET30a的相應(yīng)的Nde I和Sal I之間，用T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中。涂布在含30 μ g/ml的卡那霉素的LB+Agar培養(yǎng)基上；37°C培養(yǎng)12hr，直至有單菌落出現(xiàn)，挑取轉(zhuǎn)化子，在含有30 μ g/ml的卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)4hr ;再在3L表達(dá)培養(yǎng)基(蛋白胨12g/L ;酵母提取物24g/L ；KH2PO4O. 17mol/L ；K2HPO4 O. 72mol/L;甘油 4ml/L ;葡萄糖 O. 05%(w/v);乳糖 O. 2%(w/v)；硫酸鎂2mmol/L ；30 μ g/ml卡那霉素)中擴(kuò)大培養(yǎng)16_18hr。在4°C下,6，OOOg離心20min,棄上清，沉淀重新懸浮 于 Tris-NaCl 緩沖液中(50mM Tris, pH 7. 5，IOOmM NaCl, ImM DTT, ImMEDTA的緩沖液)。實施例ニ重組沃氏菌天門冬酰胺酶的提純?nèi)∩鲜隼龅木w混懸液，用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎，再次離心，取上清液上樣于裝填有I. 2L的DEAE瓊脂糖凝膠樹脂的層析柱上，用50mM Tris, pH 7. 5,50mM NaCl的緩沖液洗脫天門冬酰胺酶。收集含有天門冬酰胺酶的洗脫液，用超濾濃縮。濃縮液再用125ml Phenyl瓊脂糖凝膠疏水柱層析進(jìn)ー步精制,用含IM硫酸銨到OM硫酸銨的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集含有天門冬酰胺酶的組份，超濾濃縮，濃縮液經(jīng)過透析，最終重組天門冬酰胺酶保存于O. IM磷酸緩沖液(pH 8. O)中。用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度,用奈氏法測定酶活性，用HPLC法測定純度，樣品比活應(yīng)不低于2501. U. Mg,純度不低于90%。實施例三注射用重組沃氏菌天門冬酰胺酶的制備取每瓶I萬單位的例ニ中所制備的重組沃氏菌天門冬酰胺酶，加入80mg的甘露醇，用O. 22 μ m的濾膜無菌過濾，加入無菌西林瓶中，冷凍干燥，得注射用重組沃氏菌天門冬酰胺酶。實施例四重組沃氏菌天門冬酰胺酶注射液的制備按每支注射液5000單位的量，取例ニ中所制備的重組沃氏菌的天門冬酰胺酶，カロ入5mmol/L的L-半胱氨酸,20mmol/L的磷酸緩沖液,O. 7%的氯化鈉,定容體積為5ml/姆支。O. 22 μ m的濾膜無菌過濾，灌注得重組沃氏菌的天門冬酰胺酶注射液。實施例五重組沃氏菌天門冬酰胺酶對不同癌細(xì)胞的體外抑制増殖作用在96孔板每孔加入濃度為4 5X IO4個/ml的對數(shù)生長期細(xì)胞懸液100 μ 1，置37 0C，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)。24h后，加入樣品液，10 μ I/孔，設(shè)雙復(fù)孔，37 °C，5%C02作用72h。每孔加入5mg/ml的MTT溶液20 μ 1，作用4h后加入溶解液，100 μ I/孔，置培養(yǎng)箱內(nèi)，溶解后用全波長多功能酶標(biāo)儀測570nm OD值。根據(jù)非線性回歸方法計算半數(shù)抑制濃度IC50。
權(quán)利要求
1.一種重組沃氏菌的天門冬酰胺酶注射藥物，包括天門冬酰胺酶和相關(guān)輔料甘露醇、甘氨酸；其特征在于藥物組合物每支含量為5，0001. U.或10，0001. U.，主要組成為5，0001. U.的重組沃氏菌的天門冬酰胺酶，40mg甘露醇或10，0001. U.重組沃氏菌的天門冬酰胺酶，80mg甘露醇；或5，0001』.的重組沃氏菌的天門冬酰胺酶，24. 3mg的甘氨酸，pH為7.0，或10，0001. U.的重組沃氏菌的天門冬酰胺酶，48. 6mg甘氨酸，pH 7.0。
2.一種重組沃氏菌的天門冬酰胺酶注射藥物，其特征在于注射液體積為5ml每支，主要組成為5，0001. U.或10,0001. U.的重組沃氏菌的天門冬酰胺酶，5mmol/L的L-半胱氨酸，20mmol/L的磷酸緩沖液，0. 7%的氯化鈉。
3.如權(quán)利要求I或2所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟 a.將含沃氏菌的天門冬酰胺酶基因克隆到表達(dá)質(zhì)粒中，該表達(dá)質(zhì)粒的特征為含有卡那霉素抗性基因；表達(dá)的啟動子為Hlac或T7 ;沃氏菌的天門冬酰胺酶基因沒有融合任何標(biāo)簽序列或其他外源性DNA序列； b.將步驟a的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到含DE3基因的大腸桿菌中，大腸桿菌可以是B型或K21型，利用卡那霉素的抗性，選擇獲得含有I中所述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的單一菌落，卡那霉素的濃度為30-50 V- g/ml ； c.步驟b的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌單菌落在含30u g/ml的LB培養(yǎng)基中37 °C，震蕩培養(yǎng)；再接種于表達(dá)培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)16-18hr，所述的表達(dá)培養(yǎng)基由蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/UKH2PO4 0. 17moI/UK2HPO4 0. 72mol/L、甘油 4ml/L、葡萄糖 0. 05%(w/v)、乳糖 0. 2%(w/v)、硫酸鎂2mmol/L、30ii g/ml的卡那霉素組成；該表達(dá)培養(yǎng)基中含葡萄糖和乳糖的混合物，其重量比為葡萄糖乳糖=0.2-0. 3 I ； d.步驟c的菌體離心，破碎，將重組沃氏菌的天門冬酰胺酶從菌體中釋放出，再用陰離子交換柱層析和疏水柱層析純化得到重組沃氏菌天門冬酰胺酶；該產(chǎn)品在SDS-PAGE上呈分子量為35kDa的單一條帶，HPLC測定的純度在90%以上，比活2501. U. /mg以上； e.上述4的純化后的重組沃氏菌天門冬酰胺酶，按a中所述比例加入甘露醇或甘氨酸，冷凍干燥，得到注射用重組沃氏菌天門冬酰胺酶。
4.如權(quán)利要求3所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于所述的用陰離子交換柱層析和疏水柱層析的二步柱層析方法包括以下步驟 I)、用陰離子交換柱層析法吸附雜質(zhì)蛋白，收集不被吸附的重組天門酰胺酶，并進(jìn)行超濾濃縮； 2 )、經(jīng)過上述分離步驟得到的重組天門冬酰胺酶再用疏水色譜層析進(jìn)行精制。
5.如權(quán)利要求I或2所述的藥物組合物的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于抑制多種癌細(xì)胞生長的抗癌活性，治療相關(guān)的癌癥疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說是一種能用于治療癌癥的重組沃氏菌天門冬酰胺酶的藥物組合物及其制備法，主要組成為5,000I.U或10,000I.U.的重組沃氏菌天門冬酰胺酶，分別各自含40mg或80mg甘露醇；或者為5,000I.U.或10,000I.U.的重組沃氏菌天門冬酰胺酶，分別各自含24.3mg或48.6mg甘氨酸，pH 7.0；或5,000I.U./10,000I.U.重組沃氏菌天門冬酰胺酶，5mmol/L的L-半胱氨酸，20mmol/L的磷酸緩沖液，0.7%的氯化鈉，將含沃氏菌的天門冬酰胺酶基因克隆到表達(dá)質(zhì)粒中，然后轉(zhuǎn)染到含DE3基因的大腸桿菌中，本發(fā)明的重組沃氏菌天門冬酰胺酶藥物組合物在制備過程中避免了有毒性的IPTG的添加，同時實現(xiàn)高水平地表達(dá)，所用表達(dá)質(zhì)粒的卡那霉素抗性基因也符合生物藥物的制備要求。
文檔編號A61K38/50GK102657852SQ20121016296
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月22日
發(fā)明者范銘琦 申請人:范銘琦