專利名稱：基于聚酰胺胺樹狀大分子載體的基因轉(zhuǎn)染方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬高分子納米載體靶向基因轉(zhuǎn)染領(lǐng)域，特別是涉及ー種基于聚酰胺胺樹狀大分子載體的基因轉(zhuǎn)染方法。
背景技術(shù)：
目前，細(xì)胞的表達(dá)調(diào)控日益受到重視，其中基因轉(zhuǎn)染是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)調(diào)控的一種重要手段。用于基因轉(zhuǎn)染的載體分為病毒載體和非病毒載體。病毒載體雖然具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但因其本身存在免疫原性、高毒性 及不能大規(guī)模生產(chǎn)等缺點(diǎn)而受到限制。非病毒載體，尤其是聚酰胺胺樹狀大分子(PAMAM)，由于其低毒、高效、可以大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)而日益受到重視。在特定部位(如肝組織)的表達(dá)調(diào)控中，許多基因載體由于無法靶向到特定組織，會(huì)降低細(xì)胞表達(dá)調(diào)控的效率，甚至?xí)鸩槐匾穆闊?jù)報(bào)道，PAMAM樹狀大分子經(jīng)修飾后不僅可以提高轉(zhuǎn)染效率還可以提高其轉(zhuǎn)染特異性。[SantosJL. , Pandita D,Rodrigues J, et al., Receptor-mediated gene delivery using PAMAMdendrimers conjugated with peptides recognized by mesenchymal stem cells. MolPharmaceutics, 2010, 7，763-774.]。近年來,發(fā)展ー種具有肝癌細(xì)胞祀向功能的納米載體，實(shí)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的靶向表達(dá)調(diào)控，已成為研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。肝癌細(xì)胞膜表面特異性表達(dá)的去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoproteinreceptor, ASGPR)能夠?qū)Ｒ?丨生識(shí)別分子末端帶有的半乳糖殘基并與之結(jié)合。Guo R.等[buo R, Yao Y,しheng G, et al. , synthesis of glycoconjugated poly (amindoamine)dendrimers for targeting human liver cancer cells, RSC Advances, 2012，2，99—102.」報(bào)道了乳糖酸修飾的聚酰胺胺樹狀大分子對(duì)肝癌細(xì)胞具有很好的靶向作用。聚酰胺胺(PAMAM)樹狀大分子是ー種高度支化的單分散大分子，它具有良好的水溶性，在使用劑量下沒有細(xì)胞毒性和免疫原性。PAMAM樹狀大分子表面有大量可控功能基團(tuán)，可以化學(xué)連接或物理吸附ー些靶向基團(tuán)、抗體或藥物分子等。乳糖酸(La)是ー種含有半乳糖殘基的小分子，能夠修飾在納米載體或高分子材料的表面以提高其對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向能力。因此，將乳糖酸修飾在PAMAM樹狀大分子表面，有望制備ー種具有肝癌細(xì)胞靶向功能的基因載體，實(shí)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的靶向表達(dá)調(diào)控。檢索國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)和專利結(jié)果表明以乳糖酸修飾的聚酰胺胺樹狀大分子為靶向載體，用于肝癌祀向基因轉(zhuǎn)染的方法，尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于聚酰胺胺樹狀大分子載體的基因轉(zhuǎn)染方法，該基因轉(zhuǎn)染方法具有轉(zhuǎn)染條件溫和，易于操作，轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的一種基于聚酰胺胺樹狀大分子載體的基因轉(zhuǎn)染方法，包括(I)聚酰胺胺樹狀大分子(PAMAM)表面的乳糖酸修飾將乳糖酸La溶于磷酸鹽緩沖液中，加入1-(3-ニ甲基氨基丙基)-3-こ基碳化ニ亞胺鹽酸鹽EDC和N-羥基硫代琥珀酰亞胺NHS，強(qiáng)磁力攪拌反應(yīng)1-5小時(shí)，得到活化好的乳糖酸溶液；將第五代聚酰胺-胺樹狀大分子G5. NH2CSigma公司)溶于蒸餾水中，得到G5. NH2溶液，然后將上述活化好的乳糖酸溶液加入G5. NH2溶液中，室溫中磁力攪拌反應(yīng)1-5天；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物透析，最后進(jìn)行冷凍干燥，得到反應(yīng)產(chǎn)物G5. NH2-La ；(2)乳糖酸修飾的聚酰胺胺樹狀大分子(G5. NH2-La)與質(zhì)粒復(fù)合物的制備將步驟(I)得到的G5. NH2-La用無菌水稀釋，得到G5. NH2-La的無菌水稀釋液；用無菌水將pDNA稀釋，得到pDNA的無菌水稀釋液，然后將所述的G5. NH2-La的無菌水稀釋液與PDNA的無菌水稀釋液混合均勻，再于37°C孵育20-30分鐘，得到G5. NH2-La與質(zhì)粒的復(fù)合物 G5. NH2-La/pDNA ；(3)乳糖酸修飾的聚酰胺胺樹狀大分子質(zhì)粒復(fù)合物的細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將HepG2細(xì)胞(肝癌細(xì)胞)鋪于6_96孔培養(yǎng)板中，采用不含F(xiàn)BS的MEM培養(yǎng)基(含Earle’s混合鹽、2mM谷氨酰胺、O. ImM非必須氨基酸、100U/mL青霉素、100 μ g/mL鏈霉素)，于37°C、5%C02 (培養(yǎng)箱中CO2的體積濃度)培養(yǎng)20-30小時(shí)，然后均勻滴加入G5. NH2-La/PDNA復(fù)合物溶液，搖勻，37°C培養(yǎng)2-5小時(shí)后更換為含10% (質(zhì)量濃度)FBS的MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)20-30小時(shí)，即可。步驟(I)中所述的磷酸鹽緩沖液的pH值為6. O。步驟(I)中所述的乳糖酸與磷酸鹽緩沖液的用量比為15. 7mg :2mL。步驟(I)中所述的EDC、NHS和乳糖酸羧基的摩爾比約為5:5:1。步驟(I)中所述的G5. NH2溶液中G5. NH2的濃度為10. 4mg/mL。步驟(I)中所述的乳糖酸與G5. NH2的摩爾比為7:1 15:1。步驟(I)中所述的透析為轉(zhuǎn)移至截留分子量為14000的透析袋中，在蒸餾水(2LX6,每天3次)中透析2天。步驟(2)中所述的pDNA的無菌水稀釋液中pDNA的濃度為O. 02-0. 10g/L。步驟(2)中所得到的G5. NH2-La/pDNA中G5. NH2的伯氨基與pDNA骨架上磷酸基團(tuán)摩爾比(N/P)為 O. 25-5:1。步驟(3)中所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)染后表達(dá)時(shí)間為24 48小時(shí)。本發(fā)明以乳糖酸修飾的端基為氨基的第5代聚酰胺胺(PAMAM)樹狀大分子為基因轉(zhuǎn)染載體，以肝癌細(xì)胞H印G2作為靶細(xì)胞，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。本發(fā)明通過核磁共振(NMR)對(duì)樹狀大分子表面基團(tuán)的類型以及數(shù)量進(jìn)行了表征。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、原子力顯微鏡(AFM)^Ka力學(xué)粒徑以及表面電勢(shì)對(duì)基因轉(zhuǎn)染載體與PDNA形成復(fù)合物的能力進(jìn)行表征。此外，用熒光素酶標(biāo)記的質(zhì)粒(Luc)和綠色熒光蛋白標(biāo)記的質(zhì)粒(EGFP)對(duì)基因轉(zhuǎn)染載體的基因轉(zhuǎn)染能力進(jìn)行測(cè)定。和對(duì)照的未經(jīng)乳糖酸修飾的G5. NH2載體的轉(zhuǎn)染效果相比，本發(fā)明制備的基因載體能夠顯著地提高對(duì)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染能力，因此本發(fā)明制備的具有肝癌靶向功能的聚酰胺胺樹狀大分子能夠作為基因載體用于對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向基因輸送。核磁共振(NMR)、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、原子力顯微鏡(AFM)、水動(dòng)力學(xué)粒徑與表面電勢(shì)、熒光素酶基因與綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分別如下(I)1H NMR 測(cè)試結(jié)果1H NMR圖譜用于表征乳糖酸對(duì)樹狀大分子表面的修飾。參見說明書附圖I:
3.40-4. IOppm范圍內(nèi)的質(zhì)子峰對(duì)應(yīng)于乳糖酸分子，對(duì)相應(yīng)的化學(xué)位移峰進(jìn)行積分，表明每個(gè)樹狀大分子表面修飾了 10. 4個(gè)乳糖酸分子。由此可證明乳糖酸已成功修飾在樹狀大分子表面，得到了設(shè)計(jì)合成的G5. NH2-La靶向載體。(2)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，G5. NH2-La和G5. NH2均與DNA具有很好的復(fù)合能力。參見說明書附圖2。結(jié)果表明G5. NH2-La和G5. NH2均可以在較低N/P (N/P=l)下與DNA很好復(fù)合，將DNA阻滯，進(jìn)而為DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞提供了可能。(3) AFM測(cè)試結(jié)果AFM對(duì)樹狀大分子/質(zhì)粒復(fù)合物樣品的表面形貌進(jìn)行了測(cè)試，參見說明書附圖3。
結(jié)果表明復(fù)合物均呈球形，表明G5. NH2-La與G5. NH2均能復(fù)合質(zhì)粒DNA，使將基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞成為可能。此外，G5. NH2/DNA復(fù)合物的粒徑比G5. NH2-La/DNA復(fù)合物的粒徑大，表明G5. NH2-La對(duì)DNA有更高的壓縮能力。(4)水動(dòng)力學(xué)粒徑與表面電勢(shì)測(cè)試結(jié)果測(cè)試結(jié)果如說明書附圖4所示。結(jié)果表明，G5. NH2/DNA復(fù)合物和G5. NH2_La/DNA復(fù)合物的大小在合適轉(zhuǎn)染的尺寸范圍內(nèi)。由于乳糖酸的引入，相同N/P下，G5. NH2-La/DNA復(fù)合物的電勢(shì)較G5. NH2/DNA復(fù)合物的電勢(shì)低，但仍在適合轉(zhuǎn)染的電勢(shì)范圍內(nèi)。(5)熒光素酶基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以熒光素酶標(biāo)記的質(zhì)粒并以具有較強(qiáng)ASGPR表達(dá)的人肝癌細(xì)胞H印G2細(xì)胞為模型細(xì)胞來檢驗(yàn)兩種材料G5. NH2與G5. NH2-La對(duì)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果。參見說明書附圖5。測(cè)試結(jié)果顯示兩種材料的轉(zhuǎn)染效率均與N/P有夫，且在相同N/P下，G5. NH2-La的轉(zhuǎn)染效率明顯高于G5. NH2的轉(zhuǎn)染效率。在Ν/Ρ=2· 5時(shí)，G5. NH2-La的轉(zhuǎn)染效率最高。表明G5. NH2-La對(duì)H印G2細(xì)胞具有更好的靶向轉(zhuǎn)染效果。(6)增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以綠色熒光蛋白標(biāo)記的質(zhì)粒并以具有較強(qiáng)ASGPR表達(dá)的人肝癌細(xì)胞H印G2為模型細(xì)胞進(jìn)一步來檢驗(yàn)兩種材料G5. NH2與G5. NH2-La對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向轉(zhuǎn)染效果。參見說明書附圖6。對(duì)于具有較強(qiáng)ASGPR表達(dá)的H印G2細(xì)胞，修飾了乳糖酸的材料G5. NH2-La可以更好地將EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞具有較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)表達(dá)；而未修飾乳糖酸的材料G5. NH2對(duì)EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效率較低，細(xì)胞幾乎沒有明顯的熒光信號(hào)。這ー結(jié)果證明只有乳糖酸修飾的G5. NH2-La對(duì)肝癌細(xì)胞具有特異性的靶向效果，未修飾的材料對(duì)肝癌細(xì)胞沒有革巴向效果。有益效果(I)本方法制備的功能化聚酰胺胺樹狀大分子對(duì)肝癌細(xì)胞具有靶向作用，可用于基因分子的靶向輸送。(2)本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)染方法具有轉(zhuǎn)染條件溫和，易于操作，轉(zhuǎn)染效率高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，在肝癌細(xì)胞的靶向表達(dá)調(diào)控等方面具有很好的應(yīng)用前景。


圖I為本發(fā)明制備的G5. NH2-La的核磁共振氫譜圖；圖2為本發(fā)明制備的G5. NH2/DNA復(fù)合物(a)和G5. NH2_La/DNA復(fù)合物(b)的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)電泳圖譜；
圖3為本發(fā)明制備的G5. NH2/pDNA復(fù)合物AFM圖譜(a)和G5. NH2_La/pDNA復(fù)合物AFM 圖譜(b)；圖4為本發(fā)明制備的G5. NH2-La與pDNA形成復(fù)合物的粒徑(a)和電勢(shì)圖譜(b)；G5. NH2/pDNA復(fù)合物為對(duì)照組。圖5為G5. NH2與G5. NH2-La兩種材料在不同N/P下對(duì)H印G2細(xì)胞的熒光素酶基因轉(zhuǎn)染效率比較圖；圖6為G5. NH2 (a, b)與G5. NH2-La (c，d)兩種材料對(duì)H印G2細(xì)胞的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染的明場(chǎng)照片(a，c)及熒光照片(b，d)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例I稱取乳糖酸(La)15. 7mg，溶于2mL磷酸鹽緩沖液中(ρΗ=6· O)。加入乳糖酸羧基摩爾數(shù)五倍當(dāng)量的EDC (O. 30M，0. 726mL)、NHS (O. 25Μ，0· 892mL)，強(qiáng)磁力攪拌反應(yīng)3小時(shí)。稱取第五代聚酰胺胺樹狀大分子(G5. NH2)41. 5mg，溶于4mL蒸餾水中，配制成濃度為10. 4mg/mL的溶液。按照La/G5. NH2摩爾比為11/1，將活化好的乳糖酸溶液加入G5. NH2溶液中，室溫中磁力攪拌，反應(yīng)3天。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至截留分子量為14000的透析袋中，在蒸餾水(2LX6，每天3次)中透析2天。然后進(jìn)行冷凍干燥處理，得到G5. NH2-La反應(yīng)產(chǎn)物。對(duì)得到的產(chǎn)品G5. NH2-La進(jìn)行核磁表征，結(jié)果見

書I。在3. 40-4. IOppm范圍內(nèi)的質(zhì)子峰對(duì)應(yīng)于乳糖酸分子，對(duì)相應(yīng)的質(zhì)子峰進(jìn)行積分計(jì)算可知，樹狀大分子表面修飾了 10. 4個(gè)乳糖酸分子。因此，乳糖酸已成功修飾在樹狀大分子表面，得到了設(shè)計(jì)合成的G5. NH2-La靶向載體。實(shí)施例2根據(jù)實(shí)施例I的方法制備的G5. NH2-La以及第五代端基為氨基的聚酰胺胺樹狀大分子G5. NH2與pDNA進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)。配制8孔的含溴化乙錠(O. I μ g/mL)的瓊脂糖凝膠(I. 0%w/v),室溫放置待瓊脂糖凝膠凝固。Wlyg DNA為例，分別按照不同N/P (O. 25，0.5,1,2, 3，4，5)配制載體/DNA復(fù)合物，并以裸DNA為對(duì)照。取實(shí)施例I得到的G5. NH2-La,用無菌水稀釋至50 μ L，然后用無菌水將Iyg DNA稀釋至50 μ L，然后混合均勻，終體積為100 μ L，37°C孵育30分鐘。然后將對(duì)應(yīng)的載體/DNA復(fù)合物分別加到瓊脂糖凝膠的孔中，電壓80V，時(shí)間35min。使用凝膠成像儀(UVP，USA)對(duì)DNA在凝膠中的遷移進(jìn)行分析。結(jié)果如

書2所示。結(jié)果表明，G5. NH2-La和G5. NH2均可以在較低N/P (N/P=l)下與DNA很好復(fù)合，將DNA阻滯，進(jìn)而為DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞提供了可能。實(shí)施例3根據(jù)實(shí)施例I的方法制備的G5. NH2-La以及G5. NH2與I μ g DNA (N/P=2. 5)復(fù)合后，取5μ L復(fù)合后的溶液滴至合適大小的云母片中，空氣干燥。用原子力顯微鏡(VeecoInstruments)對(duì)復(fù)合物的表面形貌進(jìn)行了觀察，結(jié)果如

書3所示。結(jié)果表明，復(fù)合物均呈球形，表明G5. NH2-La與G5. NH2均能復(fù)合質(zhì)粒DNA，使將基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞成為可能。此外，G5. NH2/DNA復(fù)合物的粒徑比G5. NH2-La/DNA復(fù)合物的粒徑大，表明G5. NH2-La對(duì)DNA的壓縮效果更好。實(shí)施例4根據(jù)實(shí)施例I的方法制備的G5. NH2-La以及G5. NH2與5 μ g DNA (N/P=l，2. 5,5)復(fù)合后，分別用去離子水調(diào)節(jié)體積為lmL。采用馬爾文激光粒度儀(Malvern，UK，633nm激發(fā)光)對(duì)其粒徑和表面電勢(shì)進(jìn)行了表征，結(jié)果如

書4所示。結(jié)果表明，隨著N/P的增力口，所有復(fù)合物的尺寸均減少。相同N/P下，G5. NH2-La/DNA復(fù)合物尺寸較G5. NH2/DNA復(fù)合物的尺寸小。另外隨著N/P的增加，G5. NH2-La/DNA復(fù)合物與G5. NH2/DNA復(fù)合物的表面電勢(shì)均有所增加。由于乳糖酸的引入，相同N/P下，G5. NH2-La/DNA復(fù)合物的電勢(shì)較G5. NH2/DNA復(fù)合物的電勢(shì)低，但仍在適合轉(zhuǎn)染的電勢(shì)范圍內(nèi)。 實(shí)施例5以熒光素酶標(biāo)記的質(zhì)粒并以具有較強(qiáng)ASGPR表達(dá)的人肝癌細(xì)胞H印G2細(xì)胞為模型細(xì)胞來檢驗(yàn)兩種材料G5. NH2與G5. NH2-La對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向轉(zhuǎn)染效果。將模型細(xì)胞培養(yǎng)于不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液中，加入一定濃度的G5. NH2/DNA與G5. NH2-La/DNA復(fù)合物與細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí)，隨后更換含10%FBS的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。將細(xì)胞裂解測(cè)定熒光素酶活性，結(jié)果見

書5。測(cè)試結(jié)果顯示兩種材料的轉(zhuǎn)染效率均與N/P有關(guān)，且在相同N/P下，G5. NH2-La的轉(zhuǎn)染效率明顯高于G5. NH2的轉(zhuǎn)染效率。在N/P=2. 5時(shí)，G5. NH2-La的轉(zhuǎn)染效率最聞。實(shí)施例6以增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)標(biāo)記的質(zhì)粒并以具有較強(qiáng)ASGPR表達(dá)的人肝癌細(xì)胞H印G2為模型細(xì)胞進(jìn)一步來檢驗(yàn)兩種材料G5. NH2與G5. NH2-La對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向轉(zhuǎn)染效果。IfepG2細(xì)胞(肝癌細(xì)胞)以合適密度鋪于24孔板，于37°C、5% CO2培養(yǎng)24小時(shí)，將IOOyL G5. NH2_La/pDNA復(fù)合物溶液均勻滴加到24孔板中，搖勻，37°C培養(yǎng)4小時(shí)后更換為含10%FBS (胎牛血清)的MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。用倒置熒光顯微鏡觀察，結(jié)果見

書6。對(duì)于具有較強(qiáng)ASGPR表達(dá)的HepG2細(xì)胞，修飾了乳糖酸的材料G5. NH2-La可以更好地將EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞具有較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)表達(dá)；而未修飾乳糖酸的材料G5. NH2對(duì)EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效率較低，細(xì)胞幾乎沒有明顯的熒光信號(hào)。這一結(jié)果證明只有乳糖酸修飾的G5. NH2-La對(duì)肝癌細(xì)胞具有特異性的靶向效果，未修飾的材料對(duì)肝癌細(xì)胞沒有靶向效果。
權(quán)利要求
1.一種基于聚酰胺胺樹狀大分子載體的基因轉(zhuǎn)染方法，包括 (1)將乳糖酸La溶于磷酸鹽緩沖液中，加入I-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，攪拌反應(yīng)1-5小時(shí)，得到活化好的乳糖酸溶液；將第五代聚酰胺-胺樹狀大分子G5. NH2溶于蒸餾水中，得到G5. NH2溶液，然后將上述活化好的乳糖酸溶液加入G5. NH2溶液中，室溫中攪拌反應(yīng)1-5天；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物透析，最后進(jìn)行冷凍干燥，得到反應(yīng)產(chǎn)物G5. NH2-La ； (2)將步驟(I)得到的G5.NH2-La用無菌水稀釋，得到G5. NH2-La的無菌水稀釋液；用無菌水將pDNA稀釋，得到pDNA的無菌水稀釋液，然后將所述的G5. NH2-La的無菌水稀釋液與PDNA的無菌水稀釋液混合均勻，再于37°C孵育20-30分鐘，得到G5. NH2-La與質(zhì)粒的復(fù)合物 G5. NH2-La/pDNA ； (3)將!fepG2細(xì)胞鋪于6-96孔培養(yǎng)板中，采用不含F(xiàn)BS的MEM培養(yǎng)基，于37°C、5%C02培養(yǎng)20-30小時(shí)，然后滴加入G5. NH2-La/pDNA復(fù)合物溶液，搖勻，37°C培養(yǎng)2_5小時(shí)后更換為含10%FBS的MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)20-30小時(shí)，即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于聚酰胺胺樹狀大分子載體的基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于步驟(I)中所述的磷酸鹽緩沖液的PH值為6. O。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于聚酰胺胺樹狀大分子載體的基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于步驟(I)中所述的乳糖酸與磷酸鹽緩沖液的用量比為15. 7mg :2mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于聚酰胺胺樹狀大分子載體的基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于步驟(I)中所述的EDC、NHS和乳糖酸羧基的摩爾比為5:5:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于聚酰胺胺樹狀大分子載體的基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于步驟(I)中所述的G5. NH2溶液中G5. NH2的濃度為10. 4mg/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于聚酰胺胺樹狀大分子載體的基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于步驟(I)中所述的乳糖酸與G5. NH2的摩爾比為7:1 15:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于聚酰胺胺樹狀大分子載體的基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于步驟(I)中所述的透析為轉(zhuǎn)移至截留分子量為14000的透析袋中，在蒸餾水中透析2天。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于聚酰胺胺樹狀大分子載體的基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于步驟(2)中所述的pDNA的無菌水稀釋液中pDNA的濃度為O. 02-0. 10g/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于聚酰胺胺樹狀大分子載體的基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于步驟(2)中所得到的G5. NH2-La/pDNA中G5. NH2的伯氨基與pDNA骨架上磷酸基團(tuán)摩爾比為O. 25-5 lo
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于聚酰胺胺樹狀大分子載體的基因轉(zhuǎn)染方法，包括(1)聚酰胺胺樹狀大分子表面的乳糖酸修飾，得到G5.NH2-La；(2)乳糖酸修飾的聚酰胺胺樹狀大分子載體與質(zhì)粒復(fù)合物的制備，得到G5.NH2-La與質(zhì)粒的復(fù)合物G5.NH2-La/pDNA；(3)乳糖酸修飾的聚酰胺胺樹狀大分子質(zhì)粒復(fù)合物的靶向肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染及表達(dá)。本方法制備的功能化聚酰胺胺樹狀大分子對(duì)肝癌細(xì)胞具有靶向作用；本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)染方法具有轉(zhuǎn)染條件溫和，易于操作，轉(zhuǎn)染效率高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102698290SQ20121018355
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月5日
發(fā)明者劉輝, 史向陽, 姜慧欣 申請(qǐng)人:東華大學(xué)