專利名稱：熒光納米鉆石-阿霉素復(fù)合物的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種載藥納米粒，具體是以熒光納米鉆石為載體，通過條件優(yōu)化，制備熒光納米鉆石-阿霉素復(fù)合物(FND-DOX)及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)化療的抗腫瘤藥物，由于缺乏對腫瘤細(xì)胞的選擇性、即沒有藥物的導(dǎo)向作用，會(huì)不可避免地帶來毒副作用。在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，正常細(xì)胞也被損傷，給患者造成很大傷害，很大程度上影響了患者的生活質(zhì)量和治療效果。因此在臨床上，控制藥物的輸送和藥物釋放是化學(xué)療法亟待解決的問題。針對這一課題，較早應(yīng)用了血清蛋白、血紅蛋白骨膠原、明膠等天然可生物降解的高分子材料。其生物相容性好，但制備困難，質(zhì)量無法控制，因 此人們將目光轉(zhuǎn)向了合成類的可生物降解聚合物，如脂肪族聚酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚原酸酯、聚己內(nèi)酯、聚尿烷、聚氨基酸等，但這些物質(zhì)的制備工藝復(fù)雜。近年，納米技術(shù)和生物技術(shù)日漸成熟，不少科學(xué)家都在探索將納米技術(shù)運(yùn)用在生物醫(yī)學(xué)上，例如以納米顆粒為載體運(yùn)送藥物、以磁性納米粒子作為磁共振成像造影劑或以納米組件當(dāng)作生物傳感器。以爆炸法產(chǎn)生的納米鉆石相對于量子點(diǎn)、碳納米管、富勒烯、磁性納米粒子、金納米、多孔硅納米顆粒具有無毒性且高生物兼容性等優(yōu)點(diǎn)，因此目前對納米鉆石的研究已得到廣泛關(guān)注，并將成為一枝獨(dú)秀。納米鉆石表面一般覆蓋著一層疏水性的基團(tuán)，在強(qiáng)氧化酸性處理下，鉆石表面經(jīng)由氧化而成羧基(COOH)或其他含氧的官能基(例如C=0，C-0-C)，故而產(chǎn)生親水性，并且對核酸、蛋白質(zhì)、藥物等產(chǎn)生強(qiáng)鍵合，因此納米鉆石在生物和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有極大的潛在應(yīng)用價(jià)值。2007年，美國科學(xué)家Dean Ho博士領(lǐng)導(dǎo)的小組使用不發(fā)熒光信號的納米鉆石(2-8nm)在NaCl條件下負(fù)載阿霉素，2011年又在氫氧化鈉濃度為2. 5mM(pH約11. 4)條件下制備了該納米鉆石負(fù)載阿霉素，測得平均粒徑大小約80nm，而在pH > 11. 0條件下，阿霉素結(jié)構(gòu)被破壞，藥效可能會(huì)降低。此外，由于Dean Ho博士領(lǐng)導(dǎo)的小組使用的是不發(fā)光納米鉆石，觀察納米顆粒在體內(nèi)的分布，需用熒光染料做標(biāo)記，但眾所周知，熒光染料光穩(wěn)定性差、具有光漂白現(xiàn)象、難以實(shí)現(xiàn)長時(shí)間跟蹤探究已標(biāo)記的材料在細(xì)胞或在體內(nèi)的活動(dòng)情況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種熒光納米鉆石-阿霉素復(fù)合物的制備方法，該方法制得的復(fù)合物光穩(wěn)定性好，沒有光漂白現(xiàn)象，可以實(shí)現(xiàn)長時(shí)間被跟蹤在細(xì)胞或在體內(nèi)的活動(dòng)情況。本發(fā)明提供的一種熒光納米鉆石-阿霉素復(fù)合物，是以紅色熒光納米鉆石為載體，在pH10. 0條件下，采用物理吸附負(fù)載阿霉素制備而成，其粒徑大小為197± I. 8nm。本發(fā)明提供的一種熒光納米鉆石-阿霉素復(fù)合物的制備方法，步驟如下(I)按每毫克熒光納米鉆石加入0. 5-1毫升的pH10. 0的氫氧化鈉溶液，將載體熒光納米鉆加入氫氧化鈉溶液中，超聲，形成懸濁液；
(2)按熒光納米鉆石與阿霉素重量比100 8-10，取阿霉素溶于蒸餾水中，再用氫氧化鈉溶液調(diào)PH值至10. 0加入上述懸濁液，超聲，搖勻，高速離心，除去上清液，沉淀物冷藏即可。所述的高速離心轉(zhuǎn)速為-S 15000rpm。制得的熒光納米鉆石-阿霉素復(fù)合物可用于抗腫瘤藥物的制備。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明選用的納米鉆石材料具有生物相容性好、無毒性、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、表面易修飾且不影響熒光信號等諸多優(yōu)點(diǎn)，在充當(dāng)載體的同時(shí)，又可充當(dāng)熒光探針；另外將納米鉆石通過物理吸附，負(fù)載傳統(tǒng)化療藥物阿霉素，并通過條件優(yōu)化獲得載藥量多的FND-D0X，其粒徑為197±1.8nm。通過FND-DOX與人肝癌細(xì)胞(IfepG2)作用，結(jié)果顯示FND-DOX具有緩釋藥物特性；能利用腫瘤組織中微血管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)特征，即利用EPR效應(yīng)， 使得腫瘤部位截獲FND-DOX (即具有被動(dòng)靶向性作用)，因此既能降低化療藥物對正常細(xì)胞的毒副作用，又能提高化療藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷力。FND-DOX可在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用。


圖I為用激光共聚焦顯微鏡觀察FND-DOX與體外培養(yǎng)H印G2細(xì)胞的作用，表明FND-DOX具有緩釋藥物特性。圖2為D0X、FND-D0X經(jīng)腹腔注射進(jìn)荷瘤小鼠后比照模型組(不給藥的荷瘤小鼠)的平均生存時(shí)間(圖2A)、平均小鼠體重(圖2B)及平均腫瘤重量(圖2C)的差異。圖3為用激光共聚焦顯微鏡觀察模型組、FND-DOX給藥組在荷瘤小鼠的腫瘤、肝、腎、脾中的分布(圖3A為模型組，圖3B為FND-DOX給藥組)。圖4為采用蘇木精-伊紅(HE)染色發(fā)，用熒光顯微鏡觀察模型組、FND-DOX給藥組和DOX給藥組對荷瘤小鼠的腫瘤、肝、腎、脾的影響(圖4A對腫瘤的影響，4B對肝的影響，圖4C為對腎的影響，圖4D為對脾的影響)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明采用的載體熒光納米鉆石按文獻(xiàn)(H. -C. Chang, ff. Fann, and C. _C.Han, “Luminescent diamond particles,，，United States Patent 8168413)制得。所述的阿霉素是鹽酸多柔比星，分子式為C27H29NO11 *HC1,分子量為579. 99,深圳萬樂藥業(yè)有限公司，規(guī)格按C27H29NO11 HCl計(jì)算為10mg。實(shí)施例I :納米鉆石-阿霉素復(fù)合物的制備稱取熒光納米鉆石2. Omg JnApHlO. 0的NaOH溶液lmL，以100W超聲30min，接著加入pH10. 0、80 ii L 2mg/mL阿霉素，使其質(zhì)量達(dá)到160 y g，以100W超聲lOmin，置于搖勻儀充分搖勻，其轉(zhuǎn)速為18rpm,搖勻時(shí)間為3h。反應(yīng)結(jié)束后,用高速離心機(jī)以15000rpm轉(zhuǎn)速離心，離心時(shí)間為5min。上清液置于5mL離心管，沉淀用pH10. 0的NaOH溶液洗滌2此，上清液放入第一次5mL離心管。運(yùn)用紫外可見光譜等手段檢測阿霉素490nm峰位處的吸光度，計(jì)算DOX的吸附量，經(jīng)計(jì)算獲得每毫克鉆石吸附阿霉素約69微克(69 u g/mg)。實(shí)施例2:稱取熒光納米鉆石2. Omg，加入pH10. 0的NaOH溶液2mL，以100W超聲30min，接著加入pH10.0、90iiL 2mg/mL阿霉素，使其質(zhì)量達(dá)到180 y g，以IOOW超聲lOmin，置于搖勻儀充分搖勻，其轉(zhuǎn)速為18rpm,搖勻時(shí)間為3h。反應(yīng)結(jié)束后,用高速離心機(jī)以15000rpm轉(zhuǎn)速離心，離心時(shí)間為5min。上清液置于5mL離心管，沉淀用pHlO. 0的NaOH溶液洗滌2此，上清液放入第一次5mL離心管。運(yùn)用紫外可見光譜等手段檢測阿霉素490nm峰位處的吸光度，計(jì)算DOX的吸附量，經(jīng)計(jì)算獲得每毫克鉆石吸附阿霉素約70微克(70y g/mg)。實(shí)施例3 稱取熒光納米鉆石2. Omg,加入pHlO. 0的NaOH溶液lmL，以100W超聲30min，接著加入pHlO. OUOOuL 2mg/mL阿霉素，使其質(zhì)量達(dá)到200 y g，以IOOff超聲IOmin,置于搖勻儀充分搖勻，其轉(zhuǎn)速為18rpm，搖勻時(shí)間為3h。反應(yīng)結(jié)束后，用高速離心機(jī)以15000rpm轉(zhuǎn)速離心，離心時(shí)間為5min。上清液置于5mL離心管，沉淀用pHlO. 0的NaOH溶液洗滌2此，上清液放入第一次5mL離心管。運(yùn)用紫外可見光譜等手段檢測阿霉素490nm峰位處的吸光度，計(jì)算DOX的吸附量，經(jīng)計(jì)算獲得每毫克鉆石吸附阿霉素約70微克(70 u g/mg)。實(shí)施例4 稱取熒光納米鉆石20mg JnApHlO. 0的NaOH溶液10mL，以100W超聲30min，接著加入pHlO. O、ImL 2mg/mL阿霉素，使其質(zhì)量達(dá)到2mg，以100W超聲lOmin，置于搖勻儀充分搖勻，其轉(zhuǎn)速為18rpm,搖勻時(shí)間為3h。反應(yīng)結(jié)束后,用高速離心機(jī)以15000rpm轉(zhuǎn)速離心，離心時(shí)間為5min。上清液置于5mL離心管，沉淀用pHlO. 0的NaOH溶液洗滌2此，上清液放入第一次5mL離心管。運(yùn)用紫外可見光譜等手段檢測阿霉素490nm峰位處的吸光度，計(jì)算DOX的吸附量，經(jīng)計(jì)算獲得每毫克鉆石吸附阿霉素約70微克(70y g/mg)。實(shí)施例5 :熒光納米鉆石-阿霉素復(fù)合物(FND-DOX)與體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞的作用，表明FND-DOX具有緩釋藥物特性取對數(shù)生長期的H印G2細(xì)胞以I. 5 X 105/dish的密度接種于含有蓋玻片的35mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)16h后，棄液，PBS洗滌，分別加入DOX (3iig/mL)于37°C孵育lh，取實(shí)施例3制得的 FND-DOX (43 u g/mL FND-3 u g/mL DOX)于 37°C孵育 1，3，5 和 16h 后，冷 PBS 洗滌，4%多聚甲醛室溫固定8min，冷PBS沖洗細(xì)胞三次，取出蓋玻片置于載玻片上，激光共聚焦顯微鏡下觀察(見圖I。DOX :激發(fā)波長為488nm，接受波長500-550nm ；FND :激發(fā)波長為543nm，接受波長630-700nm)。圖I為D0X、FND-DOX作用于H印G2細(xì)胞的激光共聚焦成像圖。從圖中可以看到，DOX與細(xì)胞作用Ih后，細(xì)胞核中看到綠色熒光，表明DOX已全部進(jìn)入細(xì)胞核。而FND-DOX與細(xì)胞孵育Ih后，細(xì)胞中桔黃色熒光(紅色熒光納米鉆石和綠色熒光阿霉素的疊加)少見，隨著時(shí)間的延長，達(dá)到3h后，細(xì)胞質(zhì)中桔黃色熒光增多，5h后，顯示明顯的桔黃色熒光，且有少數(shù)綠色熒光出現(xiàn)，而16h后，細(xì)胞核周圍出現(xiàn)明顯的紅色和綠色熒光信號，表明FND-DOX跨膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，阿霉素緩慢從紅色熒光納米鉆石上解離。充分表明納米鉆石-阿霉素復(fù)合物具有緩釋藥物特性。實(shí)施例6 :納米鉆石-阿霉素復(fù)合物(FND-DOX)對體內(nèi)荷瘤小鼠抗腫瘤效應(yīng)
(I)小鼠移植性肝癌H22的接種(a)取昆明小鼠50只，8-9周齡，雄性，由山西省腫瘤研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(晉)2012-0001。(b)接種量肝癌H22細(xì)胞懸液調(diào)整為5X lOVmL，接種量為0. ImL/鼠，接種于右腋部皮下(每只動(dòng)物的接種量為5X106)。(c)分組模型組、DOX組、FND-DOX組，每組10只小鼠。(d)給藥方法及劑量腹腔注射給藥，模型組不給藥，DOX組給予體重每20克小鼠注射100 Ug DOX (100 u g/20g)，取實(shí)施例4制得的FND-DOX給予體重每20克小鼠注射I. 43mgFND-100 u g D0X。接種后24h給藥一次，以后每7天給藥一次，直到動(dòng)物死亡。(e)觀察方法接種后觀察動(dòng)物，待其自然死亡后，各組隨機(jī)選取2只動(dòng)物解剖，取部分腫瘤組織、肝、腎、脾保存于10%的甲醛溶液中，用作病理觀察。與模型組比較，統(tǒng)計(jì)各組動(dòng)物的平均生存時(shí)間(圖2A)，平均小鼠體重(圖2B)及平均腫瘤重量(圖2C)。結(jié)果表明模型組平均生存時(shí)間為20. 8天，阿霉素給藥后平均生存時(shí)間為24. 3天， FND-DOX給藥后平均生存時(shí)間為36. 3天(圖2A)，經(jīng)計(jì)算FND-DOX給藥后相對模型組可能的生命延長率為75%，而化療藥物阿霉素給藥后可能的生命延長率僅19% ;模型組平均體重為34. 7±4. 8g，F(xiàn)ND-DOX給藥后小鼠平均體重為32. 2±4. 0g，阿霉素給藥后小鼠平均體重為30. 2±1. 8g (圖2B)，由此可計(jì)算獲得FND-DOX給藥后是模型組小鼠平均體重的92. 7%，而阿霉素給藥后是模型組小鼠平均體重87. 0%。模型組平均腫瘤重I. 6±0. 9g, FND-DOX給藥后平均腫瘤重I. 4±0. Ig,阿霉素給藥后平均腫瘤重I. 4±0. 5g (圖2C)，由此可見FND-DOX與DOX分別給藥后，對小鼠平均抑制腫瘤率基本一樣。實(shí)施例7 :納米鉆石-阿霉素復(fù)合物(FND-DOX)在荷瘤小鼠的腫瘤、肝、腎、脾組織的分布及納米鉆石-阿霉素復(fù)合物(FND-DOX)和阿霉素(DOX)對荷瘤小鼠的腫瘤、肝、腎、脾的影響(模型組做對照)。(I)采用常規(guī)切片技術(shù)，將福爾馬林固定的小鼠的腫瘤、肝、腎、脾組織沿最大徑切開腎從腎門處沿最大徑切開脾從脾門處沿最大徑切開肝將每個(gè)肝葉分別沿最大徑切開將切開后的標(biāo)本做組織脫水、浸蠟處理，并用石蠟包埋，切面作包埋面，制成可供組織切片的蠟塊。將蠟塊連續(xù)切片兩張，切片厚4 u m。其中一張組織切片做常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，另一張組織切片在二甲苯、乙醇脫蠟、脫苯后，自然晾干，用甘油/PBS液封片。蘇木精-伊紅(HE)染色切片作常規(guī)病理分析，無染色白片在共聚焦顯微鏡下觀察有發(fā)光納米材料在各組織的分布。(2)納米鉆石-阿霉素復(fù)合物(FND-DOX)在荷瘤小鼠的腫瘤、肝、腎、脾的分布(見圖3)圖3為模型組(不給藥，圖3A)、納米鉆石-阿霉素組(圖3B)在腫瘤、肝、腎、脾的分布，采用激光共共聚焦顯微鏡觀察，以543nm激發(fā)，收集630-700nm范圍的熒光，可觀察到FND-DOX在腫瘤部位具有紅色的小亮點(diǎn)，為納米鉆石的紅色熒光，表明FND-DOX在腫瘤部位有廣泛分布，而在肝、腎、脾部位未見紅色熒光亮點(diǎn)，脾、腎的紅色為紅細(xì)胞顏色(相對粒徑較大，處于微米數(shù)量級)，充分表明能利用腫瘤組織中微血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，即利用EPR效應(yīng)將FND-DOX截留在腫瘤部位，因此FND-DOX具有被動(dòng)靶向作用，在腫瘤部位釋藥起到殺死癌細(xì)胞的作用。
(3)納米鉆石-阿霉素復(fù)合物和阿霉素對腫瘤、肝、腎、脾的影響表I不同藥物組對各組織切片(HE染色)熒光顯微鏡圖片分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種熒光納米鉆石-阿霉素復(fù)合物，其特征是以紅色熒光納米鉆石為載體，在PH10. 0條件下，采用物理吸附負(fù)載阿霉素制備而成，其粒徑大小為197± I. 8nm。
2.如權(quán)利要求I所述的一種熒光納米鉆石-阿霉素復(fù)合物的制備方法，其特征在于，步驟如下 (1)按每毫克熒光納米鉆石加入0.5-1毫升的pH10. 0的氫氧化鈉溶液，將載體熒光納米鉆石加入氫氧化鈉溶液中，超聲，形成懸濁液； (2)按熒光納米鉆石與阿霉素重量比100 8-10，取阿霉素溶于蒸餾水中，再用氫氧化鈉溶液調(diào)PH值至10. 0加入上述懸濁液中，超聲，搖勻，高速離心，除去上清液，沉淀物冷藏即可。
3.如權(quán)利要求2所述的一種熒光納米鉆石-阿霉素復(fù)合物的制備方法，其特征在于，所述的高速離心轉(zhuǎn)速為-S 15000rpm。
4.如權(quán)利要求I所述的一種熒光納米鉆石-阿霉素復(fù)合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng) 用。
全文摘要
本發(fā)明提供的一種熒光納米鉆石-阿霉素復(fù)合物(FND-DOX)，是以紅色熒光納米鉆石為載體，在pH10.0條件下，采用物理吸附負(fù)載阿霉素制備而成，其粒徑大小為197±1.8nm。該復(fù)合物通過與人肝癌細(xì)胞(HepG2)作用，結(jié)果顯示FND-DOX具有緩釋藥物特性；并能利用腫瘤組織中微血管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)特征，即利用EPR效應(yīng)，使得腫瘤部位截獲FND-DOX(即具有被動(dòng)靶向性作用)，因此既能降低化療藥物對正常細(xì)胞的毒副作用，又能提高對腫瘤細(xì)胞的殺傷力。FND-DOX可在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用。
文檔編號A61P35/00GK102716137SQ201210184060
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月6日
發(fā)明者仝姚莉, 李英奇, 蘇剛 申請人:山西大學(xué)