專利名稱：一種抗ev71病毒寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程藥物領(lǐng)域，具體地說是一種固相合成的寡核苷酸的序列、結(jié)構(gòu)及其在治療EV71(腸道病毒71型)病毒(Human enterovirus 71)感染相關(guān)疾病中的用途。
背景技術(shù)：
EV 71病毒感染性強(qiáng)且致病率高，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)方面的并發(fā)癥。該病易于傳播，容易發(fā)生流行，預(yù)防控制難度大。20世紀(jì)70年代中期，保加利亞、匈牙利等國家相繼暴發(fā)以中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病為主要臨床特征的EV71型手足口病流行，并導(dǎo)致較高的病死率和致殘率。1997年以來，EV71感染為主的手足口病在馬來西亞、中國臺(tái)灣、新加坡等地大規(guī)模暴發(fā)流行。1998年中國臺(tái)灣發(fā)生迄今最大的一次主要為EV71型手足口病流行，共報(bào)告129106例手足口病或皰疹性咽峽炎病例，其中重癥患1405例，死亡78例。中國內(nèi)地自1981年在 上海始見本病，此后北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北及廣東等十幾個(gè)省市均有EV71型手足口病的發(fā)生和流行。特別值得注意的是近年來本病流行有蔓延增多趨勢。2008年3月10日至5月31日短短時(shí)間內(nèi)安徽阜陽共報(bào)告手足口病7470例，共發(fā)現(xiàn)111例重癥病例，其中死亡23例，病死率0. 31 %。目前EV71病毒感染無特殊治療藥物，故臨床上對無并發(fā)癥患者之治療只能采取支持性療法，而對有并發(fā)癥的患者也只能對癥治療，采取一些降顱壓、降溫、輔助抗病毒等的治療。因此，研究特異性高、毒副作用小的新型抗EV71病毒感染的藥物對治療與預(yù)防EV71病毒感染及其相關(guān)性疾病具有重要現(xiàn)實(shí)意義。核酸類藥物是一類全新的基因靶向創(chuàng)新藥物，長期以來一直是國際研究的熱點(diǎn)，特別是近幾年小核酸的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步將核酸藥物的研究推向一個(gè)前所未有的發(fā)展高潮。反義寡核苷酸是一類經(jīng)過人工合成的寡核苷酸片段，長度多為15 30個(gè)核苷酸。通過堿基互補(bǔ)的原理，干擾相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，或者整個(gè)基因組的復(fù)制，其優(yōu)點(diǎn)在于其理論上的高度靶特異性，是一種理想的具有精確選擇性的基因靶向治療藥物。由于反義寡核苷酸作用的高度特異性，因此被認(rèn)為是極具潛力的抗腫瘤和抗病毒新藥。國外已有一些著名制藥企業(yè)已將反義藥物作為其新藥研究開發(fā)的重點(diǎn)方向之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種阻斷EV71病毒復(fù)制、抑制病毒致病的寡核苷酸序列、結(jié)構(gòu)及其藥物。本研究的內(nèi)容是針對EV71病毒保守序列，利用網(wǎng)上服務(wù)器Soligo設(shè)計(jì)了 5條寡核苷酸(表I)，從設(shè)計(jì)的這5條20個(gè)堿基長度的寡核苷酸序列中進(jìn)行初步篩選。結(jié)果顯示靶向EV71的5’非編碼區(qū)保守序列EV5抑制病毒所致細(xì)胞病變作用最佳，EV2次之。在RD細(xì)胞系中評價(jià)結(jié)果顯示EV5可特異且劑量依賴性地抑制EV71病毒的復(fù)制及致細(xì)胞病變作用。在EV71感染小鼠模型評價(jià)結(jié)果顯示EV5在小鼠體內(nèi)能夠顯著的抑制EV71病毒感染死亡率，緩解EV71病毒感染引起的小數(shù)體重增加緩慢以及抑制EV71病毒復(fù)制的作用。
表I寡核苷酸序列及結(jié)構(gòu)特征
序號(hào)長度(nt)序列(5’-3’)
IEVl20GTAGTCGGTTCCGCTGCAGA
2EV220ATTCAGGGGCCGGAGGACTA
3EV320TGCACACCGGATGGCCAATC
4EV420GCCGCATTCAGGGGCCGGAG
5EV520GATTAGCCGCATTCAGGGGC·
根據(jù)本發(fā)明，針對EV715’非編碼區(qū)的寡核苷酸EV5能特異性抑制EV71病毒的感染復(fù)制，有可能成為治療及預(yù)防EV71病毒感染相關(guān)疾病的新型生物工程藥物。根據(jù)本發(fā)明，針對EV715’非編碼區(qū)的寡核苷酸能有效的抑制EV71病毒的復(fù)制并保護(hù)細(xì)胞使其免于EV71病毒感染所致細(xì)胞病變，是一種特異性高、毒副作用小的新型抗EV71病毒的潛在藥物。根據(jù)本發(fā)明，反義寡核苷酸的長度與其細(xì)胞通透性，與靶序列結(jié)合親和性及作用特異性等因素相關(guān)，EV5的長度根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定，本發(fā)明包含了與EV5具有相同序列的任何長度寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，為增強(qiáng)反義寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及組織靶向性等，本發(fā)明包含了 EV5的硫代修飾。根據(jù)本發(fā)明，反義寡核苷酸的長度與其細(xì)胞通透性，與靶序列結(jié)合親和性及作用特異性等因素相關(guān)，EV5的長度根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定，本發(fā)明包含了與EV5具有60%及其以上連續(xù)相同序列的任何長度寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，為了進(jìn)一步驗(yàn)證EV5的特異性效果，本發(fā)明包含了 EV5序列的3’端及5’端的脂肪鏈修飾。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的寡核苷酸可按本領(lǐng)域已知方法配成藥物制劑。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的治療組成，依不同情況包括特定藥物的藥物動(dòng)力學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)、給藥模式、給藥途徑、受者的年齡、體重、肝腎功能狀態(tài)、疾病的性質(zhì)、程度及治療時(shí)限等，以適宜的劑量給藥。本發(fā)明的實(shí)施對嚴(yán)重危害人類健康的EV71病毒感染的治療具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。


圖I五條ASODNs對EV71致CPE的抑制作用圖2五條ASODN抗EV71致CPE的劑量依賴性圖3利巴韋林(Ribavirin)抗EV71致CPE的劑量依賴性圖4EV5對RD細(xì)胞的毒性作用圖5EV5反義寡核苷酸序列的特異性驗(yàn)證圖6EV5長度優(yōu)化的初步篩選結(jié)果圖7EV5長度優(yōu)化的劑量依賴性篩選結(jié)果圖8EV5對EV71病毒mRNA的影響(先加藥后感染)圖9EV5對EV71病毒mRNA的影響(先感染后加藥)
圖10EV5抑制EV71病毒VPl蛋白表達(dá)的影響圖11EV5在小鼠體內(nèi)對EV71病毒感染小鼠存活率的影響圖12EV5在小鼠體內(nèi)對EV71病毒感染小鼠體重的影響
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一本實(shí)施例主要說明針對EV71病毒保守序列的抗EV71病毒寡核苷酸的設(shè)計(jì)、合成和篩選。材料與方法I.反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)和合成檢索GeneBank中的EV71編碼的核酸序列數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行多序列之間的比對，再選擇各個(gè)亞型的保守區(qū)，利用Antisense design對這些基因進(jìn)行設(shè)計(jì)，并應(yīng)用Blast進(jìn)行序列比對剔除與人類其它基因同源性大于70%的寡核苷酸，最終獲得了理論上靶向EV71病毒自身的反義寡核苷酸。采用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺固相合成的方法在ABI3900型自動(dòng)DNA合成儀上進(jìn)行合成，磷酸骨架均為全硫代修飾。合成完畢后濃氨水55°C切割并脫水15小時(shí)后，經(jīng)Micro Pure II反相純化柱(Oligo Prep OP120, SAVANT)純化，紫外定量后真空干燥，-20°C保存?zhèn)溆谩?. RD細(xì)胞、病毒和對照藥物病毒通過感染RD細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增繁殖，然后混勻、分裝并儲(chǔ)存在_70°C備用。使用的病毒株為國際標(biāo)準(zhǔn)株EV71。RD細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM(GIBCO)培養(yǎng)液。病毒感染和細(xì)胞病變測定時(shí)使用含2%胎牛血清的維持液。陽性對照藥物為利巴韋林注射液。3.反義寡核苷酸的篩選RD細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)中，于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，以8000 10000個(gè)細(xì)胞/孔接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，次日75 80%長滿。用DMEM稀釋EV1-5至U M。將長滿75 80% RD細(xì)胞的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)的96孔板換成含2%胎牛血清的維持液備用。分別把EV1-5五條反義寡核苷酸序列以4 M的濃度加入96孔板內(nèi)，每個(gè)序列設(shè)三個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立病毒陽性對照組和RD細(xì)胞陰性對照組。作用60min后，每孔加入100TCID50/0. Iml的EV71的病毒稀釋液3. 3yl，37°C培養(yǎng)2d。利用Cell Counting Kit_8 (DoJinDo 產(chǎn)品)方法在酶標(biāo)儀(BI0-RAD 產(chǎn)品，型號(hào)=Model 680)上測定細(xì)胞病變程度(以0D450表示)，并以如下公式計(jì)算藥物的病毒抑制率[(0D試驗(yàn)-OD病毒)/ (0D細(xì)胞-OD病毒)]X 100。重復(fù)試驗(yàn)二次，計(jì)算平均值以篩選出最佳 的反義寡核苷酸以進(jìn)一步評價(jià)。4. ASODNs及陽性藥利巴韋林抑制EV71病毒致細(xì)胞病變劑量依賴作用將RD細(xì)胞鋪板96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，次日75 80%長滿。將長滿75 80% RD細(xì)胞換成含2%胎牛血清的維持液備用。把EV1-5分別設(shè)立0. 125,0. 25,0. 5、I. 0、2. 0 y M五個(gè)濃度梯度，每個(gè)序列濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立病毒陽性對照組和RD細(xì)胞陰性對照組；同樣的，把利巴韋林注射液分別設(shè)立20、40、100、200、400ii M五個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立病毒陽性對照組和RD細(xì)胞陰性對照組。作用60min后，每孔加入100TCID50/0. Iml的EV71的病毒稀釋液3. 3 iil，37°C培養(yǎng)2d。利用Cell Counting Kit_8 (DoJinDo產(chǎn)品)方法在酶標(biāo)儀上測定細(xì)胞病變程度(以0D450表示)，計(jì)算藥物的細(xì)胞病變抑制率。
結(jié)果I.靶向EV71病毒基因組本身反義寡核苷酸序列的設(shè)計(jì)首先在GeneBank中檢索EV71編碼的核酸序列數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行多序列之間的比對，選擇各個(gè)亞型的保守區(qū)，然后使用Soligo工具設(shè)計(jì)反義寡核苷酸。反義寡核酸的設(shè)計(jì)準(zhǔn)則如下(1)40%彡GC%彡60%； (2)反義寡核苷酸結(jié)合自由能小于或等于-8kcal/mol ;(3)在目標(biāo)序列中不存在GGGG。經(jīng)Blast比對，與人的基因mRNA無同源性，最終獲得了理論上靶向EV71病毒自身的反義寡核苷酸五條并對其合成(表I)。2. ASODNs的初步篩選設(shè)計(jì)的EV1-5五條反義寡核苷酸序列以4 y M的濃度進(jìn)行初篩，然后利用CCK8檢測方法在酶標(biāo)儀上測定各自的吸光度值，結(jié)果如圖I。由圖中可見，EV2和EV5兩條反義序列抗EV71病毒致CPE效果較好，需進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。3. ASODNs及陽性藥利巴韋林抑制EV71病毒致細(xì)胞病變劑量依賴性對上述五條反義序列進(jìn)一步進(jìn)行抗病毒效果的劑量依賴性驗(yàn)證，同時(shí)與陽性藥利巴韋林進(jìn)行比較，以確定反義藥物的抗EV71病毒效果，結(jié)果如圖2,圖3。由圖2可見，對五條反義序列進(jìn)一步進(jìn) 行劑量依賴性篩選，EV2和EV5抗病毒效果仍然較好，他們抑制EV71病毒致CPE的IC5tl分別為2. 10 uM,0. 84 u M0圖3結(jié)果顯示陽性藥利巴韋林在濃度為200 u M時(shí)抗EV71病毒致CPE作用抑制率為38. 32 %，當(dāng)濃度升高至400 u M時(shí)抑制率才達(dá)到50. 69 %，其抑制EV71病毒致CPE的IC5tl為358. 17 u M0由以上結(jié)果可見，EV5，EV2在細(xì)胞水平抑制病毒致CPE作用顯著優(yōu)于利巴韋林。結(jié)論針對EV71病毒保守序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸中，EV2和EV5顯示出顯著的抗EV71病毒致CPE作用，作用顯著強(qiáng)于利巴韋林陽性藥，且EV5的作用優(yōu)于EV2。實(shí)施例二 本實(shí)施例主要說明EV5在細(xì)胞水平抗EV71病毒致CPE及抑制EV71病毒復(fù)制的特異性、劑量依賴性，同時(shí)對EV5的長度進(jìn)行了優(yōu)化。材料和方法I. ODNs的毒性檢測將RD細(xì)胞鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，次日75 80%長滿。將長滿75 80 %的RD細(xì)胞換成含2 %胎牛血清的維持液備用。把EV5分別設(shè)立I、2. 5、5、10、20 ii M五個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)立三個(gè)副孔，并設(shè)立RD細(xì)胞陰性對照組，37°C培養(yǎng)2d。利用CellCounting Kit-8 (DoJinDo產(chǎn)品)方法在酶標(biāo)儀上測定細(xì)胞病變程度(以0D450表示)，觀察EV5本身對細(xì)胞的影響。2. ODNs的特異性驗(yàn)證首先設(shè)計(jì)合成EV5的正義鏈與隨機(jī)鏈，正義鏈經(jīng)過與EV5的反義寡核苷酸反義序列的堿基互補(bǔ)直接得出，其隨機(jī)鏈?zhǔn)抢肈NA隨機(jī)蛋白等的設(shè)計(jì)軟件SMS2 (The Sequence Manipulation Suite 2)設(shè)計(jì)出來的，并通過與 GeneBank 聯(lián)機(jī) blast序列比對，不會(huì)干擾人類其它正?；虻谋磉_(dá)。然后，將RD細(xì)胞鋪板96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，次日75 80%長滿。將長滿75 80%的RD細(xì)胞換成含2%胎牛血清的維持液備用。把EV5、EV5S (正義)、EV5R(隨機(jī))分別設(shè)立0. 125,0. 25,0. 5、I. 0、2. 0 y M五個(gè)濃度梯度，每個(gè)序列濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立病毒陽性對照組和RD細(xì)胞陰性對照組。作用60min后，每孔加入 100TCID50/0. Iml 的 EV71 的病毒稀釋液 3. 3 y 1，37°C培養(yǎng) 2d。利用 Cell CountingKit-8 (DoJinDo產(chǎn)品)方法在酶標(biāo)儀上測定細(xì)胞病變程度(以0D450表示)，計(jì)算藥物的細(xì)胞病變抑制率，驗(yàn)證EV5反義的特異性。4. EV5的長度優(yōu)化為了考察序列長度對序列抗EV71病毒活性的影響，對EV5序列兩端進(jìn)行了 2個(gè)堿基差的長度加減，合成獲得相應(yīng)的寡核苷酸(表2)。將不同長度的寡核苷酸以2. 0 ii M加入EV71感染RD細(xì)胞，48h后CCK8檢測各序列的抗EV71病毒致細(xì)胞病變的效果。然后，對篩選出的可以較好的抑制EV71病毒致細(xì)胞病變作用的序列分別進(jìn)行劑量依賴性篩選，進(jìn)行比較以篩選出一條最好的序列。表2-2長度優(yōu)化的反義序列
權(quán)利要求
1.與EV71病毒RNA互補(bǔ)的寡核苷酸，其長度是10-30個(gè)堿基。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述寡核苷酸，其特征是所述的寡核苷酸序列結(jié)構(gòu)選自下列之一 Dgtagtcggttccgctgcaga ；2)ATTCAGGGGCCGGAGGACTA；3)TGCACACCGGATGGCCAATC；4)GCCGCATTCAGGGGCCGGAG；5)GATTAGCCGCATTCAGGGGC。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的寡核苷酸，其特征是所述的寡核苷酸序列結(jié)構(gòu)選自下列之1)ATTCAGGGGCCGGAGGACTA；2)GATTAGCCGCATTCAGGGGC。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的寡核苷酸，其特征是所述的寡核苷酸序列結(jié)構(gòu)如下 GATTAGCCGCATTCAGGGGC。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的寡核苷酸，其特征為所述的寡核苷酸包含了與TACAAGTTTTTTAGGGGGCA具有60%及其以上連續(xù)相同序列的任何長度寡核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的寡核苷酸，其特征是該反義寡核苷酸經(jīng)過不同化學(xué)修飾。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述寡核苷酸，其化學(xué)修飾為硫代修飾、脂肪鏈修飾。
8.權(quán)利要求1-7中所述的任一寡核苷酸或其組合在制備治療和預(yù)防EV71病毒感染及其相關(guān)性疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種反義寡核苷酸藥物的結(jié)構(gòu)和用途。具體說是人工固相合成的寡核苷酸，用于腸道病毒71型(EV71)感染引起的相關(guān)疾病的治療。它是根據(jù)EV71病毒基因組保守序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，通過固相合成、切割和純化合成上述寡核苷酸產(chǎn)物，產(chǎn)物也可與脂質(zhì)體、融合肽制成復(fù)合物。該寡核苷酸及其復(fù)合物抑制EV71病毒在細(xì)胞模型和小鼠體內(nèi)的復(fù)制，是治療EV71感染及其相關(guān)疾病的新型生物工程類藥物。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102776187SQ20121018709
公開日2012年11月14日 申請日期2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月8日
發(fā)明者伯曉晨, 劉娟, 李康, 楊靜, 王升啟, 韓明明 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所