酵母來源葡聚糖在制備治療乙肝病毒感染的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及酵母來源葡聚糖在制備治療乙肝病毒感染的藥物中的應(yīng)用，尤其是在制備降低或消除乙型肝炎病毒慢性感染患者血清表面抗原的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，所述的酵母來源的葡聚糖可以調(diào)節(jié)小鼠脾臟細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)，上調(diào)IL-12、IL-1、TNF表達(dá)，下調(diào)抑制性細(xì)胞因子IL-10表達(dá)；能促進(jìn)HBV?C57BL/6J-TgN轉(zhuǎn)基因小鼠mDC的成熟，上調(diào)mDC表面協(xié)同刺激分子CD80、CD86表；能夠明顯增強(qiáng)HBV感染患者外周血來源PBMC?IFN-γ的生成。所述的酵母來源葡聚糖可以制備治療乙肝病毒感染的藥物，尤其是制備降低或消除乙型肝炎病毒慢性感染患者血清表面抗原的藥物，以及作為免疫增強(qiáng)劑輔助HBV感染的治療。
【專利說明】酵母來源葡聚糖在制備治療乙肝病毒感染的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及葡聚糖新的藥用用途，具體涉及酵母來源葡聚糖在制備治療乙肝病毒感染的藥物中的應(yīng)用，尤其是在制備降低或消除乙型肝炎病毒慢性感染患者血清表面抗原的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有技術(shù)公開了酵母來源的葡聚糖(glucan)具有二重螺旋的超微結(jié)構(gòu)，通過與人類單核細(xì)胞(monocyte)、巨卩遼細(xì)胞(macrophage)、中性粒細(xì)胞(neutrophilegranulocyte)、樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)、自然殺傷細(xì)胞(natural killercell, NK cell)等免疫細(xì)胞膜表面的CR3、LacCer、Dectin-l、TLR2等受體結(jié)合發(fā)揮識(shí)別、吞噬等生理作用，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，分泌TNF-α、白介素和干擾素等多種細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞間的相互作用，加速和放大宿主免疫反應(yīng)。
[0003]研究顯示，葡聚糖具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用，它在解除腫瘤毒素對(duì)機(jī)體免疫抑制的同時(shí)，能快速激活機(jī)體自身的免疫監(jiān)視和識(shí)別機(jī)制，發(fā)現(xiàn)和區(qū)分潛在的腫瘤細(xì)胞，使吞噬細(xì)胞直接殺滅腫瘤細(xì)胞。Macrogard、PGG> Glomrellan等葡聚糖類的抗腫瘤藥已先后研發(fā)并應(yīng)用于臨床治療。同時(shí)，有報(bào)道公開，葡聚糖還作為免疫增強(qiáng)劑與抗腫瘤單克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。
[0004]除此之外，葡聚糖還具有增強(qiáng)機(jī)體抗輻射能力，對(duì)化學(xué)療法起到協(xié)同增強(qiáng)的效果，可以作為治療輻射損傷佐劑，以及，葡聚糖還具有有效抑制血清中膽固醇的升高，降低膽固醇和血脂的作用。但尚未見有葡聚糖在治療病毒感染領(lǐng)域的應(yīng)用的報(bào)道。
[0005]據(jù)報(bào)道，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染引起的慢性乙型肝炎已成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病。全球約有3.5億慢性乙型肝炎患者，中國攜帶乙型肝炎病毒人數(shù)約8%左右，乙肝病毒攜帶者已超過1.2億人，發(fā)病人數(shù)超過3000萬人，慢性乙型肝炎患者病程還會(huì)進(jìn)一步發(fā)展成為肝硬化和肝癌。實(shí)踐顯示，盡管大規(guī)模的計(jì)劃內(nèi)疫苗接種已大大降低新生兒感染乙型肝炎病毒的風(fēng)險(xiǎn)，但是對(duì)已經(jīng)感染乙型肝炎病毒的人群而言，仍然缺乏十分有效的藥物以清除病毒。目前臨床上使用α干擾素和核苷酸類似物抑制乙型肝炎病毒復(fù)制，但其中僅有不到30%的患者對(duì)干擾素治療有較好的應(yīng)答。而且，長期的干擾素治療有較強(qiáng)的副作用，也給患者及其家庭帶了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而核苷類似物治療則容易產(chǎn)生病毒的耐藥性。研究認(rèn)為，慢性乙肝病人相較急性乙肝病人，其不能有效清除HBV的原因與其機(jī)體免疫系統(tǒng)耐受有關(guān)。為此，尋找到一種可有效提高機(jī)體免疫水平，進(jìn)而打破機(jī)體免疫耐受、激活特異性針對(duì)HBV的天然免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答的方法具重要的臨床意義。本申請(qǐng)擬研究葡聚糖對(duì)HBV感染的免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步提供酵母來源葡聚糖在制備治療乙肝病毒感染的藥物中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供葡聚糖新的藥用用途，具體涉及酵母來源葡聚糖在制備治療乙肝病毒感染的藥物中的應(yīng)用，尤其是在制備降低或消除乙型肝炎病毒慢性感染患者血清表面抗原的藥物中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明采用酵母來源的葡聚糖在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞和臨床HBV感染患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中測試了酵母來源的葡聚糖的免疫調(diào)節(jié)作用，分別獲得所述葡聚糖調(diào)節(jié)小鼠脾臟細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)、上調(diào)mDC表面⑶80表達(dá)、調(diào)mDC表面⑶86表達(dá)以及對(duì)mDC的形態(tài)改變的影響和葡聚糖誘生HBV患者PBMC IFN- Y生成的影響結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所述的酵母來源葡聚糖可以調(diào)節(jié)小鼠脾臟細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)，上調(diào)IL-12、IL-U TNF表達(dá)，下調(diào)抑制性細(xì)胞因子IL-10表達(dá)；所述的酵母來源的葡聚糖能促進(jìn)HBVC57BL/6J-TgN轉(zhuǎn)基因小鼠mDC的成熟，上調(diào)mDC表面協(xié)同刺激分子CD80、CD86表達(dá)，提示葡聚糖可以促進(jìn)mDC成熟，且葡聚糖這種上調(diào)作用對(duì)DC的活化呈劑量依賴方式；所述的酵母來源的葡聚糖(250 μ g/ml，刺激10天)能夠明顯增強(qiáng)HBV感染患者外周血來源PBMC IFN-Y的生成。
[0008]本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，所述的酵母來源的葡聚糖可以與機(jī)體免疫細(xì)胞受體結(jié)合，迅速激活DC細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞，并促進(jìn)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌TNF- α、白介素和IFN等具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子；
[0009]本發(fā)明所述的酵母來源葡聚糖可以制備治療乙肝病毒感染的藥物，尤其是制備降低或消除乙型肝炎病毒慢性感染患者血清表面抗原的藥物。
[0010]本發(fā)明所述的酵母來源的葡聚糖還可作為免疫增強(qiáng)劑輔助HBV感染的治療。
[0011]為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的酵母來源葡聚糖在制備治療乙肝病毒感染的藥物中的應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是本發(fā)明的葡聚糖調(diào)節(jié)小鼠脾臟細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)。
[0013]圖2Α是本發(fā)明的葡聚糖上調(diào)mDC表面⑶80表達(dá)；
[0014]2B是本發(fā)明的葡聚糖上調(diào)mDC表面⑶86表達(dá)；
[0015]2C是本發(fā)明的顯微鏡下葡聚糖作用下，mDC的形態(tài)改變。
[0016]圖3是本發(fā)明的葡聚糖誘生HBV患者PBMC IFN- Y生成。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1
[0018](一 )細(xì)胞培養(yǎng)、臨床標(biāo)本干預(yù)和指標(biāo)檢測方案
[0019]分離HBVC57BL/6J_TgN轉(zhuǎn)基因小鼠(該小鼠從美國Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)，含有HBVS，PreSland PreS2基因，可在小鼠血清表達(dá)HBsAg)單個(gè)脾細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司，加10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素和400 μ g/ml G418)在5%C02飽和水蒸氣環(huán)境下37°C恒溫培養(yǎng)。酵母來源葡聚糖250 μ g/ml刺激48h，定量PCR檢測細(xì)胞因子表達(dá)。
[0020]按常規(guī)方法分離HBVC57BL/6J-TgN轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓以100ng/mlIL_4和IOOng/ml GM-CSF誘導(dǎo)分化DC 8天，DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司，加10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素和400 μ g/ml G418)在5%C02飽和水蒸氣環(huán)境下37°C恒溫培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以1*106/孔密度鋪12孔板，酵母來源葡聚糖取250ng/ml glucan+2 μ g/ml HBsAg(CHO 細(xì)胞來源,華北制藥集團(tuán)提供)、500ng/ml glucan+2 μ g/ml HBsAg (CHO 來源)、I μ g/ml glucan+2 μ g/ml HBsAg (CHO 來源)、250 μ g/ml glucan+2 μ g/ml HBsAg (CHO 來源)4個(gè)濃度梯度，對(duì)照組僅給2 μ g/ml HBsAg培養(yǎng)基；每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔；刺激48h后收集細(xì)胞檢測mDC表面協(xié)同刺激分子⑶11C、⑶80、⑶86表達(dá)。
[0021]取離體的臨床HBV感染患者外周血分離PBMC，以1*106/孔密度鋪12孔板加HBVoverlap肽、HBV overlap肽+葡聚糖,正常對(duì)照組僅給空白培養(yǎng)基；每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔；刺激10天。
[0022]( 二)試驗(yàn)結(jié)果
[0023]I，本發(fā)明酵母來源葡聚糖(250 μ g/ml，刺激48hr )可以調(diào)節(jié)小鼠脾臟細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)，上調(diào)IL-12、IL-UTNF表達(dá)，下調(diào)抑制性細(xì)胞因子IL-10表達(dá)(如圖1所示)。
[0024]2，本發(fā)明酵母來源的葡聚糖能促進(jìn)HBV C57BL/6J_TgN轉(zhuǎn)基因小鼠mDC的成熟，上調(diào)mDC表面協(xié)同刺激分子CD80、CD86表達(dá)，提示葡聚糖可以促進(jìn)mDC成熟，且葡聚糖的上調(diào)作用對(duì)DC的活化呈劑量依賴方式(如圖2A、2B所示)。
[0025]3，本發(fā)明的酵母來源的 葡聚糖(250 μ g/ml，刺激10天)能明顯增強(qiáng)HBV感染患者外周血來源PBMC IFN- Y的生成(如圖3所示)。
【權(quán)利要求】
1.酵母來源葡聚糖在制備治療乙肝病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
2.酵母來源葡聚糖在制備降低或消除乙型肝炎病毒血清表面抗原的藥物中的應(yīng)用。
3.按權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的血清表面抗原是慢性感染患者的血清表面抗原。
4.按權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的酵母來源葡聚糖上調(diào)IL-12、IL-1、TNF表達(dá)，下調(diào)抑制性細(xì)胞因子IL-1O表達(dá)。
5.按權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的酵母來源葡聚糖促進(jìn)HBVC57BL/6J-TgN轉(zhuǎn)基因小鼠mDC的成熟，上調(diào)mDC表面協(xié)同刺激分子CD80、CD86表達(dá)。
6.按權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的酵母來源的葡聚糖增強(qiáng)HBV感染患者外周血來源PBMC IFN-Y的生成。
7.酵母來源葡聚糖在制備`治療乙肝病毒感染的免疫增強(qiáng)劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P37/04GK103479663SQ201210189690
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2012年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月11日
【發(fā)明者】袁正宏, 羽曉瑜, 周曉輝, 任廣旭 申請(qǐng)人:上海市公共衛(wèi)生臨床中心