專利名稱：雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎四聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種用于預(yù)防雞的新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎四種疫病油乳劑疫苗的制備方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞新城疫(newcastle disease, ND)具有很高的發(fā)病率和病死率，世界各地多有發(fā)生，且一旦爆發(fā)將給禽養(yǎng)殖業(yè)帶來毀滅性打擊，是危害養(yǎng)禽業(yè)的ー種主要傳染病。OIE將其列為A類疫病。雞傳染性支氣管炎(Infectious Bronchitis, IB)，該病可導(dǎo)致雛雞、肉雞發(fā)育緩慢，產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋減少和蛋品質(zhì)下降等。OIE將其列為B類疫病。 雞傳染性法氏囊病(Infectiousbursal disease virus, IBD)是由雙 RNA 病毒科中的傳染性法氏囊病病毒引起的ー種特殊疾病，損害幼雞法氏囊。特征是腹瀉、衰竭，法氏囊先發(fā)生顯著炎癥和増大，繼之以萎縮，最后患雞死亡。本病除造成一些雛雞死亡外，還常引起病愈雞免疫抑制，導(dǎo)致免疫接種失敗，増加雛雞對(duì)雞新城疫等許多疾病的易感性。雞病毒性關(guān)節(jié)炎(Avian viral arthritis, AVA)是由禽正呼腸孤病毒(Avianorthoreovirus)雞病毒性關(guān)節(jié)炎病毒(Avian viralarthritis virus, AVAV)引起的主要發(fā)生于肉用雞的ー種傳染病，以侵害脛跖關(guān)節(jié)、趾關(guān)節(jié)及其肌腱為特征，故又稱傳染性腱鞘炎、腱裂綜合癥或腱滑膜炎等。目前本病分布廣泛，世界各地均有發(fā)生。在急性發(fā)病雞群中，特別是種雞群，常因生長(zhǎng)緩慢或停滯、體重減輕，飼養(yǎng)利用率低以及死淘率高等，給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)外現(xiàn)在上市的商品化產(chǎn)品品種很多，但都是很單ー的傳統(tǒng)疫苗，多次使用疫苗尤其是滅活疫苗，不僅增加雞場(chǎng)人力和物カ負(fù)擔(dān)，同時(shí)多次抓雞的注射應(yīng)激，還會(huì)影響生產(chǎn)性能，致使雞群對(duì)疾病的易感性増大。加之近年來毒株的不斷變異，使得雖然推出的多種選擇的疫苗，但仍然出現(xiàn)控制不住疫情發(fā)展的局面。所以迫使我們?cè)谝酝哂胁簧⒍?、抗體滴度高、免疫保護(hù)期長(zhǎng)、受母源抗體影響小等優(yōu)點(diǎn)的油乳劑滅活疫苗的基礎(chǔ)上開發(fā)出更新更好更適合預(yù)防這四種流行性疾病的產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是制備雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎的四種抗原，并進(jìn)行合理復(fù)配制成雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎四種疫病油乳劑疫苗，可以有效預(yù)防雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，同時(shí)也可以大大減少人們的勞動(dòng)強(qiáng)度，降低養(yǎng)禽業(yè)養(yǎng)殖戶的風(fēng)險(xiǎn)，而且保證了公眾健康。該四聯(lián)苗技術(shù)的主要相關(guān)內(nèi)容和所采用的技術(shù)手段(I)選育的新毒株要經(jīng)過血清學(xué)、分子生物學(xué)等試驗(yàn)進(jìn)行大量的臨床病料分析鑒定工作，最后選出效價(jià)高、免疫原性好并能抵御雞傳染性支氣管炎流行毒攻擊的一株較理想的制苗用毒株。(2)在傳統(tǒng)全病毒滅活疫苗的基礎(chǔ)上結(jié)合基因工程亞單位疫苗的復(fù)配，并且保證各単一病毒在聯(lián)苗中均有和單苗一祥的效果。(3)利用美國(guó)進(jìn)ロ的Millipore濃縮機(jī)將抗原經(jīng)過超強(qiáng)濃縮,抗體產(chǎn)生快,效價(jià)高，保護(hù)期長(zhǎng)，降低疫病的發(fā)生及蔓延。(濃縮機(jī)的生產(chǎn)廠家，美國(guó)密理博。型號(hào)為CUP50)。 (4)技術(shù)方案主要包括以下步驟I)生產(chǎn)用菌毒種為L(zhǎng)a Sota株雞新城疫病毒、M41株傳染性支氣管炎病毒、E. coliBL21/pET28a-VP2株表達(dá)IBDV VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌和禽正呼腸孤病毒(Avianorthoreovirus,本發(fā)明又稱雞病毒性關(guān)節(jié)炎病毒)CVCC AV2311株；2)分別按常規(guī)方法用雞胚繁殖La Sota株雞新城疫病毒、M41株(CVCC AV1511)傳染性支氣管炎病毒和CVCC AV2311株病毒性關(guān)節(jié)炎病毒，收獲病毒液后經(jīng)濃縮和滅活エ藝制備成滅活病毒液；用加卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)表達(dá)IBDV VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E. coli BL21/pET28a-VP2株(本發(fā)明或簡(jiǎn)稱為“基因工程菌”)，經(jīng)過破菌、硫酸銨提取和滅菌エ藝制備成表達(dá)的傳染性法氏囊病毒VP2蛋白；3)將以上制備的種滅活抗原混合后按常規(guī)方法制備滅活佐劑疫苗。本發(fā)明的詳細(xì)描述I.疫苗生產(chǎn)用菌毒種的來源(I)雞新城疫病毒La Sota株(CVCC AV1615)和效檢用雞新城疫強(qiáng)毒北京株(CVCCAV1611株)均購(gòu)于北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8號(hào)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心.中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄第二版，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002，pl42-143)；(2)雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)M41 株(編號(hào)為CVCC AV1511)購(gòu)于北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8號(hào)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心.中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄第二版，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002，pl36)；(3)表達(dá) Infectious bursal disease virus (IBDV) VP2 蛋白的大腸桿菌基因エ程菌E. coli BL21/pET28a-VP2株(武漢市武昌珞珈山，武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保管，菌株保藏編號(hào)為CCTCC M204038，本專利權(quán)人所持有的專利號(hào)為ZL200410080065. 8的發(fā)明專利“一種傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗的制備方法和應(yīng)用”；榮俊.IBDVVP2基因重組質(zhì)粒Pbv220表達(dá)條件的優(yōu)化?！秳?dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展》2007年第4期；榮俊.傳染性法氏囊病重組亞單位疫苗免疫效カ及安全性試驗(yàn).《浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)》2007年第D 期；Jun Rong, Taipin Cheng, Xiaona Jiang,et al. Development of recombinantVP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens.Vaccine, 23 (2005) 4844-4851.);傳染性法氏囊病病毒 BC6-85 株(Infectious bursaldisease virus, CVCC AV7株)購(gòu)于北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街18號(hào)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心.中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄第二版，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002，pl35)；(4)禽正呼腸孤病毒(Avian orthoreovirus,本發(fā)明又稱雞病毒性關(guān)節(jié)炎病毒)CVCC AV2311株購(gòu)于北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8號(hào)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心.中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄第二版，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002，pl51)。2.生產(chǎn)用種毒的制備雞新城疫病毒La Sota株生產(chǎn)用毒種制備將毒種用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如IO-4或10-5)，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚，每胚O. Iml0選接種后72 120小時(shí)死亡且病痕明顯的雞胚，分別收獲雞胚液(尿囊液及羊水)，裝于滅菌容器內(nèi)。將檢驗(yàn)無菌、對(duì)1%雞紅細(xì)胞凝集價(jià)不低于1:512(微量法)的雞胚液混合，定量分裝于無菌安瓿中，冷凍保存。注明收獲日期、毒種代次等。雞傳染性支氣管炎病毒M41株生產(chǎn)用毒種制備將毒種用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如IO-2 10-3)，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚，每胚O. Iml0選接種后30 48小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚及48小時(shí)存活的雞胚胚液(尿囊液及羊水)，裝于無菌容器內(nèi)。將檢驗(yàn)無菌、病 毒含量> 106 0EID50/0. 1ml、對(duì)1%雞紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)為陰性的胚液混合，定量分裝于無菌安瓿中，冷凍保存。注明收獲日期、毒種代次等。表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的生產(chǎn)用菌種制備一級(jí)種子繁殖和鑒定將各株凍干菌種分別接種于加卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，35 36°C培養(yǎng)24小吋，然后劃線接種于加卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選取符合標(biāo)準(zhǔn)的典型菌落10個(gè)混合于少量LB培養(yǎng)液中，接種于LB瓊脂斜面若干支、置35 36°C培養(yǎng)20 24小時(shí)，作為ー級(jí)種子。在2 8°C保存，不超過14日；在培養(yǎng)基上傳代，應(yīng)不超過4代。ニ級(jí)種子繁殖取ー級(jí)種子接種于加卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，35 36°C培養(yǎng)20 24小吋。置2 8°C保存，應(yīng)不超過3日。雞病毒性關(guān)節(jié)病毒AV2311株生產(chǎn)用毒種制備將毒種用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如10_3或10_4)，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每胚O. lml。選擇接種后48 72小時(shí)的活胚，分別收獲雞胚液(尿囊液及羊水)，裝于滅菌容器內(nèi)。收獲時(shí)應(yīng)逐個(gè)檢查胚體，應(yīng)有皮下出血、水腫、發(fā)育小等特異性病痕。將檢驗(yàn)無菌的雞胚液混合，定量分裝于安瓿中，冷凍保存。注明收獲日期、毒種代次等。3.制苗用病毒液的制備(I)雞新城疫病毒液的制備接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如10_4或10_5)，接種10 11日齡易感雞胚，每胚O. 1ml，接種后密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻胚。孵育與觀察雞胚接種后，毎日照胚I次，將60小時(shí)前死亡的雞胚棄去。此后，每4 6小時(shí)照胚I次，死亡的胚隨時(shí)取出，至96小吋，無論死亡與否，全部取出，氣室向上，置于2 8°C冷卻12 24小時(shí)。收獲將冷卻的雞胚取出，收獲雞胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml滅菌容器內(nèi)，抽樣測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)。凝集價(jià)低于1:256 (微量法)者應(yīng)棄去。同時(shí)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行無菌檢驗(yàn)(可不移植)，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。收獲的胚液滅活前在2 8°C保存，應(yīng)不超過5日。濃縮將收獲的胚液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機(jī)濃縮，至少濃縮4倍，抽樣測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，凝集價(jià)不低于1:2048 (微量法)時(shí)停止?jié)饪s，按中華人民共和國(guó)獸藥典(中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典ニO — O年版三部.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011，本發(fā)明以下簡(jiǎn)稱為《中國(guó)獸藥典》)規(guī)定的方法進(jìn)行無菌檢驗(yàn)(可不移植)，應(yīng)無菌生長(zhǎng)，并留樣備測(cè)毒價(jià)。濃縮后的胚液隨即進(jìn)行滅活。滅活將雞新城疫病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，計(jì)量加入10%甲醛溶液，開啟攪拌機(jī)攪拌，使其充分混合，甲醛的最終濃度為O. 1%。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以避免罐ロ附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°c滅活16小時(shí)(以罐內(nèi)溫度達(dá)到37°C開始計(jì)時(shí)，開啟攪拌機(jī)連續(xù)攪拌)后取出，放2 8°C保存，應(yīng)不超過I個(gè)月。(2)雞傳染性支氣管炎病毒液的制備接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如10_2或10_3)，接種10 11日齡SPF雞胚，每胚O. 1ml，接種后密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻胚。孵育和觀察雞胚接種后24小時(shí)照胚I次，棄去死胚。此后每4小時(shí)照胚I次，死 亡的雞胚隨時(shí)取出，直至48小時(shí)，無論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置于2 8°C中冷卻12 24小時(shí)。收獲將冷卻的雞胚取出，收獲雞胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml滅菌容器內(nèi)，抽樣檢測(cè)病毒含量，應(yīng)彡106 0EID50/0. lml。同時(shí)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行無菌檢驗(yàn)(可不移植)，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。收獲的胚液滅活前在2 8°C保存，應(yīng)不超過5日。濃縮將收獲的胚液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機(jī)濃縮，至少濃縮4倍，同時(shí)按《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行無菌檢驗(yàn)(可不移植)，應(yīng)無菌生長(zhǎng)，并留樣備測(cè)毒價(jià)。濃縮后的胚液隨即進(jìn)行滅活。滅活將傳染性支氣管炎病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，計(jì)量加入10%甲醛溶液，開啟攪拌機(jī)攪拌，使其充分混合，甲醛的最終濃度為O. 1%。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以避免罐ロ附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°c滅活16小時(shí)(以罐內(nèi)溫度達(dá)到37°C開始計(jì)吋，開啟攪拌機(jī)連續(xù)攪拌)后取出，放2 8°C保存，應(yīng)不超過I個(gè)月。(3)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制備菌液培養(yǎng)用培養(yǎng)罐通氣培養(yǎng)，按容積裝入70%培養(yǎng)基(加卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基)及花生油消泡劑。滅菌后按培養(yǎng)基量的2% 4%接種ニ級(jí)種子菌液，37°C培養(yǎng)，待菌液的0D600值達(dá)到O. 6 I. 0，加入O. 2mol/L α -乳糖，使終濃度達(dá)到O. 02mol/L,再繼續(xù)培養(yǎng)5 8h。開始小量通氣，逐漸增大氣量。破菌培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體。收集的菌體用PBS液清洗2次，將收集的菌體加適量PBS液進(jìn)行重懸，在4°C下用超聲波破碎。破碎后的菌液，3000r/min,離心30min，收集上清液。經(jīng)硫酸銨沉淀后，收集VP2蛋白液隨即進(jìn)行滅活。滅菌將收集的上清液中按比例加入10%的甲醛溶液，開啟攪拌機(jī)攪拌，使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度為O. 2%，然后將胚液導(dǎo)入另ー滅活罐內(nèi)，37°C滅活12小時(shí)(以罐內(nèi)液體溫度達(dá)到37°C開始計(jì)吋)，以滅活殘存的大腸桿菌及毒素。2 8°C保存，不超過7日；_15°C以下保存，不超過60日。(4)雞病毒性關(guān)節(jié)炎病毒液的制備接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如10_2或10_3)，接種9 10日齡易感雞胚，每胚O. 1ml，接種后密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻胚。孵育和觀察雞胚接種后，毎日照胚I次，將30小時(shí)前死亡的雞胚棄去。此后，每4 6小時(shí)照胚I次，死亡雞胚隨時(shí)取出，直至96小時(shí)，無論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置于2 8°C冷卻12 24小時(shí)。收獲將冷卻的雞胚取出，收獲雞胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml滅菌容器內(nèi)，抽樣測(cè)定病毒含量，應(yīng)彡105 0EID50/0. lml。同時(shí)按《中國(guó)獸藥典》的規(guī)定進(jìn)行無菌檢驗(yàn)(可不移植)，應(yīng)無細(xì)菌生長(zhǎng)。收獲的胚液滅活前在2 8°C保存，應(yīng)不超過5日。濃縮將收獲的雞胚病毒液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機(jī)濃縮，至少濃縮4倍，抽樣測(cè)定病毒含量，病毒含量不低于IO5 7EID5tlA). Iml時(shí)停止?jié)饪s。按《中國(guó)獸藥典》的規(guī)定進(jìn)行無菌檢驗(yàn)(可不移植)，應(yīng)無細(xì)菌生長(zhǎng)，并留樣備測(cè)毒價(jià)。濃縮后的胚液隨即進(jìn)行滅活。滅活將病毒性關(guān)節(jié)炎病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，計(jì)量加入10%甲醛溶液，開啟攪拌機(jī)攪拌，使其充分混合，甲醛的最終濃度為O. 1%。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以避免罐ロ附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°c滅活16小時(shí)(以罐內(nèi)溫度達(dá)到37°C開始計(jì)時(shí)，開 啟攪拌機(jī)連續(xù)攪拌)后取出，放2 8°C保存，應(yīng)不超過I個(gè)月。4.滅活疫苗的制備 經(jīng)過檢驗(yàn)合格后的半成品抗原進(jìn)行疫苗制備。油相制備取優(yōu)質(zhì)注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，在油相制備罐中混合均勻并加熱至80°C后，再加司本-806份，至溫度達(dá)到125°C時(shí)維持30分鐘，冷卻后備用。水相制備將檢驗(yàn)合格的雞新城疫病毒液、傳染性支氣管炎病毒液、雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白、病毒性關(guān)節(jié)炎病毒液等量混合,使O. Iml水相中雞新城疫病毒含量不低于108_°EID5Q，M41株傳染性支氣管炎病毒含量不低于IO6 tlEID5tl ;傳染性法氏囊病毒VP2蛋白與雞傳染性法氏囊病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的瓊擴(kuò)效價(jià)不低于1:16 ;病毒性關(guān)節(jié)炎病毒含量不低于105_°EID5Q。取滅菌后的吐溫-804份，加入配液罐中，同時(shí)加混合抗原液96份，充分振搖，開動(dòng)攪拌電機(jī)攪拌20 30分鐘，使吐溫-80完全溶解。乳化取油相2份放入乳化罐中，開動(dòng)電機(jī)，慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)徐徐加入水相I份后，再以4000r/min攪拌30 40分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳汞溶液，使其最終濃度為O. 01%。乳化后，取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)^ O. 5ml。5.成品檢驗(yàn)I.性狀外觀乳白色乳剤。劑型油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第I滴外，均不擴(kuò)散。穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)彡O. 5ml。黏度按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。2.裝量檢查按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行，測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合規(guī)定。3.無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行，無菌生長(zhǎng)。4.安全檢驗(yàn)用7日齡SPF雞10只，每只肌肉或頸部皮下注射疫苗1ml，觀察14日，結(jié)果試驗(yàn)雞均健活，無任何局部和全身不良反應(yīng)。5.效カ檢驗(yàn)
( I)雞新城疫部分效カ檢驗(yàn)采用血清學(xué)方法進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果不符合規(guī)定時(shí)，可采用免疫攻毒法進(jìn)行檢驗(yàn)。I)血清學(xué)方法用30日齡SPF雞15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20 μ 1，另5只不免疫作対照。接種后21日，每只雞分別采血，分離血清，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行HI抗體效價(jià)測(cè)定。免疫組HI抗體效價(jià)的幾何平均值應(yīng)不低于1:16 (微量法)，未免疫對(duì)照組HI抗體效價(jià)的幾何平均值應(yīng)不高于1:4 (微量法)。2)免疫攻毒法用30日齡SPF雞15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20 μ 1，另5只不免疫作対照。接種后21日，每只雞各肌肉注射雞新城疫病毒北京株強(qiáng)毒(CVCC AV1611株)IO5tlELD5tl，觀察14日。對(duì)照組應(yīng)全部死亡，免疫組應(yīng)保護(hù)至少7只。(2)雞傳染性支氣管炎部分用14日齡SPF雞25只，其中20只各點(diǎn)眼、滴鼻接種傳染性支氣管炎活疫苗(Η120株)I羽份(O. 05ml)，另5只不接種作為對(duì)照。接種后21日，分 別采血，分離血清，同時(shí)免疫雞再分別肌肉接種三聯(lián)滅活疫苗O. 3ml，ニ免后21日再將免疫雞和對(duì)照雞分別采血,分離血清。將兩次血清分別測(cè)HI抗體效價(jià)。免疫組ニ免血清HI抗體效價(jià)的幾何平均值應(yīng)比首免血清高4倍以上，未免疫對(duì)照組血清HI抗體效價(jià)的幾何平均值應(yīng)不高于1:8 (微量法)。(3)雞傳染性法氏囊病部分效カ檢驗(yàn)以下方法任擇其一。I)血清學(xué)方法取21日齡SPF雞20只，其中10只各肌肉或頸部皮下注射疫苗O. 2ml，另外10只不免疫作為對(duì)照，同群飼養(yǎng)。接種后21日，每只雞分別采血，分離血清，做瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)。免疫雞應(yīng)至少有8只瓊擴(kuò)效價(jià)不低于1:8，對(duì)照雞應(yīng)全部陰性。2)免疫攻毒法取21日齡SPF雞20只，其中10只各肌肉或頸部皮下注射疫苗O. 2ml，另外10只不免疫作為對(duì)照，同條件下隔離飼養(yǎng)。接種后21日，所有免疫雞和對(duì)照雞，每只點(diǎn)眼途徑接種100倍稀釋的雞傳染性法氏囊病強(qiáng)毒BC6-85株毒液O. Iml (實(shí)含毒量> 100個(gè)BID)。攻毒后，每天觀察雞只的臨床表現(xiàn)，記錄發(fā)病和死亡雞數(shù)，至72 96小吋，撲殺存活雞，逐只剖解，觀察法氏囊等病變。免疫雞應(yīng)至少8只正常，不出現(xiàn)法氏囊病變；對(duì)照雞應(yīng)至少8只發(fā)病，出現(xiàn)明顯的法氏囊病變(如胸肌或腿肌條狀出血、法氏囊腫大或萎縮、發(fā)黃、內(nèi)有膠凍樣分泌物等ー種以上病變)。(4)病毒性關(guān)節(jié)炎部分效カ檢驗(yàn)以下方法任擇其一。I)血清學(xué)方法取21日齡SPF雞15只，其中10各頸部皮下或肌肉注射疫苗O. 2ml，另外5只不免疫作為對(duì)照，同群飼養(yǎng)。21日后，每只雞分別采血、分離血清，做瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，免疫雞抗體陽性數(shù)應(yīng)不少于9只，對(duì)照雞應(yīng)全部陰性。2)免疫攻毒法取21日齡SPF雞15只，其中10各頸部皮下或肌肉注射疫苗O. 2ml，另外5只不免疫作為對(duì)照，同群飼養(yǎng)。21日后，每只雞經(jīng)腳墊接種雞病毒關(guān)節(jié)炎病毒CVCCAV2311株強(qiáng)毒，O. 2ml (含2X IO4ELD5tl)/只，觀察120小時(shí)，檢查趾、跗關(guān)節(jié)病變。對(duì)照組應(yīng)至少有5只雞發(fā)病，免疫組應(yīng)全部保護(hù)。6.甲醛、汞類防腐劑殘留量測(cè)定按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果應(yīng)符合規(guī)定。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明涉及ー種雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎四聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法。本發(fā)明采用新城疫病毒La Sota株、傳染性支氣管炎病毒M41株、表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E. coli BL21/pET28a-VP2株和病毒性關(guān)節(jié)炎AV2311株作為生產(chǎn)菌毒種，超強(qiáng)濃縮エ藝和優(yōu)質(zhì)佐劑制備成滅活疫苗，免疫動(dòng)物后抗體產(chǎn)生快，效價(jià)高，保護(hù)期長(zhǎng)，降低了疫病的發(fā)生及蔓延。本發(fā)明涉及的微生物信息(I)雞新城疫病毒La Sota株(CVCC AV1615)和效檢用雞新城疫強(qiáng)毒北京株(CVCCAV1611株)均購(gòu)于北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8號(hào)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心.中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄第二版，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002，pl42-143)；(2)雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)M41 株(編號(hào)為CVCC AV1511)購(gòu)于北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8號(hào)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心.中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄第二版，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002，pl36)；
(3)表達(dá) Infectious bursal disease virus (IBDV) VP2 蛋白的大腸桿菌基因工程菌E. Co I i BL21/pET28a-VP2株(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC )保管，菌株保藏編號(hào)為M204038，長(zhǎng)江大學(xué)榮俊等提供，榮俊.IBDV VP2基因重組質(zhì)粒Pbv220表達(dá)條件的優(yōu)化?！秳?dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展》2007年第4期；榮俊.傳染性法氏囊病重組亞單位疫苗免疫效カ及安全性試驗(yàn).《浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)》2007年第6期);傳染性法氏囊病病毒BC6-85株(Infectious bursaldisease virus, CVCC AV7株)購(gòu)于北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街18號(hào)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心.中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄第二版，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002，pl35)；(4)禽正呼腸孤病毒(Avian orthoreovirus,本發(fā)明又稱雞病毒性關(guān)節(jié)炎病毒)AV2311株購(gòu)于北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8號(hào)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心.中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄第二版，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002，pl51)。


圖I本發(fā)明エ藝流程圖Al熏蒸消毒是指消毒劑采用熏蒸的方法對(duì)培養(yǎng)雞胚的孵化器進(jìn)行徹底消毒。A3NDV、IBV、AVA接種雞胚指雞胚在孵化至10 11日齡時(shí)接種雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、病毒性關(guān)節(jié)炎病毒在雞胚內(nèi)進(jìn)行繁殖。A4收毒在培養(yǎng)到規(guī)定的時(shí)期，將雞胚中繁殖的雞胚液病毒進(jìn)行收獲。A5病毒濃縮將收獲的含毒雞胚液在2 8°C條件下采用美國(guó)Millipore超濾濃縮機(jī)進(jìn)行抗原的濃縮，使其提高抗原含量，并同時(shí)對(duì)抗原做了進(jìn)ー步的純化。A6測(cè)毒價(jià)測(cè)NDV抗原的血凝價(jià)及IBV抗原、AVA抗原的病毒含量。B5破碎指?jìng)魅拘苑ㄊ夏业腣P2蛋白離心后收集菌體，加適量的PBS液進(jìn)行重懸，在4°C下用超聲波破碎，使其菌體內(nèi)的蛋白充分釋放出來。C滅活將A組和B組的抗原液都用適量的甲醛溶液進(jìn)行滅活，滅活掉抗原活性及細(xì)菌外毒素。D半成品檢驗(yàn)是指要進(jìn)行滅活檢驗(yàn)、VP2蛋白含量檢測(cè)、無菌檢驗(yàn)、內(nèi)毒素檢驗(yàn)，使其各個(gè)指標(biāo)在半成品時(shí)合格，才能進(jìn)行下一歩。E抗原配比指水相中雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊、病毒性關(guān)節(jié)炎的抗原配比是I: I: I: I。F乳化指將含有抗原的水相和油相按照一定的配比方法充分的混合在一起，即成為成品的疫苗狀態(tài)。最佳實(shí)施方式實(shí)施例I(一)抗原制備以及半成品檢驗(yàn)I.雞新城疫病毒液的制備(I)接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作10_4稀釋，接種10日齡易感雞胚200枚，每胚O. 1ml，接種后密封針孔，置37°C繼續(xù)孵育，不翻胚。 (2)孵育與觀察雞胚接種后，每日照胚I次，將60小時(shí)前死亡的雞胚9枚棄去。此后,姆4 6小時(shí)照胚I次,死亡的胚隨時(shí)取出，至96小時(shí),共死亡152枚,全部取出，氣室向上，置于2 8°C冷卻12小時(shí)。(3)收獲將冷卻的雞胚取出，收獲雞胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。共收雞胚191枚，約2450ml尿囊液，抽樣測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)。凝集價(jià)為1:256(微量法)。按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。收獲的胚液滅活前在2 8°C保存。(4)濃縮將收獲的胚液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機(jī)濃縮，濃縮至600ml，抽樣測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，凝集價(jià)為1:2048 (微量法)，按《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，并留樣備測(cè)毒價(jià)。濃縮后的胚液隨即進(jìn)行滅活。(5)滅活將雞新城疫病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，加入10%甲醛溶液6ml，開啟攪拌機(jī)攪拌，使其充分混合，甲醛的最終濃度為O. 1%。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以避免罐ロ附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°c滅活16小時(shí)(以罐內(nèi)溫度達(dá)到37°C開始計(jì)時(shí)，開啟攪拌機(jī)連續(xù)攪拌)后取出，放2 8°C保存。2.雞傳染性支氣管炎病毒液的制備(I)接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作10_3稀釋，接種10日齡SPF雞胚250枚，每胚O. 1ml，接種后密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻胚。(2)孵育和觀察雞胚接種后24小時(shí)照胚I次，棄去5枚死胚。此后每4小時(shí)照胚I次，死亡的雞胚隨時(shí)取出，直至48小時(shí)，共死亡267枚，全部取出，氣室向上直立，置于2 8°C中冷卻12 24小時(shí)。(3)收獲將冷卻的雞胚取出，收獲245枚雞胚，雞胚尿囊液約2600ml (先收活胚后收死胚)。抽樣檢測(cè)病毒含量。按《中國(guó)獸藥典》的規(guī)定進(jìn)行無菌檢驗(yàn)(可不移植)，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。收獲的胚液滅活前在2 8°C保存，應(yīng)不超過5日。(4)濃縮將收獲的胚液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機(jī)濃縮至600ml，按《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行無菌檢驗(yàn)(可不移植)，并留樣備測(cè)毒價(jià)。濃縮后的胚液隨即進(jìn)行滅活。(5)滅活將傳染性支氣管炎病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，加入10%甲醛溶液6ml，開啟攪拌機(jī)攪拌，使其充分混合，甲醛的最終濃度為O. 1%。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以避免罐ロ附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°C滅活16小時(shí)(以罐內(nèi)溫度達(dá)到37°C開始計(jì)吋，開啟攪拌機(jī)連續(xù)攪拌)后取出，放2 8°C保存。3.雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制備(I)菌液培養(yǎng)用培養(yǎng)罐通氣培養(yǎng)，按容積裝入70%培養(yǎng)基(加卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基)及花生油消泡劑。滅菌后按培養(yǎng)基量的4%接種ニ級(jí)種子菌液，37°C培養(yǎng)，待菌液的0D600值達(dá)到O. 8，加入O. 2mol/L α -乳糖，使終濃度達(dá)到O. 02mol/L,再繼續(xù)培養(yǎng)8h。開始小量通氣，逐漸增大氣量。(2)破菌培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體。收集的菌體用PBS液清洗2次，將收集的菌體加適量PBS液進(jìn)行重懸，在4°C下用超聲波破碎。破碎后的菌液，3000r/min,離心30min，收集上清液。經(jīng)硫酸銨沉淀后，收集VP2蛋白液隨即進(jìn)行滅活。(3)滅菌將收集的上清液中按比例加入10%的甲醛溶液，開啟攪拌機(jī)攪拌，使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度為O. 2%，然后將胚液導(dǎo)入另ー滅活罐內(nèi)，37°C滅活12小時(shí)(以罐內(nèi)液體溫度達(dá)到37°C開始計(jì)吋)，以滅活殘存的大腸桿菌及毒素。2 8°C保存。4.雞病毒性關(guān)節(jié)炎病毒液的制備
(I)接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作10_3稀釋，接種10日齡易感雞胚200枚，每胚O. 1ml，接種后密封針孔，置37°C繼續(xù)孵育。(2)孵育和觀察雞胚接種后，毎日照胚I次，將30小時(shí)前死亡的雞胚7枚棄去。此后,姆4 6小時(shí)照胚I次,死亡雞胚隨時(shí)取出，直至96小時(shí),死亡161枚,全部取出，氣室向上直立，置于2 8°C冷卻12小時(shí)。(3)收獲將冷卻的雞胚取出，收獲193枚雞胚的尿囊液(先收活胚后收死胚)共2500ml。抽樣測(cè)定病毒含量。同時(shí)按《中國(guó)獸藥典》的規(guī)定進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，收獲的胚液滅活前在2 8°C保存。(4)濃縮將收獲的雞胚病毒液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機(jī)濃縮至600ml，抽樣測(cè)定病毒含量。按《中國(guó)獸藥典》的規(guī)定進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。濃縮后的胚液隨即進(jìn)行滅活。(5)滅活將病毒性關(guān)節(jié)炎病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，加入10%甲醛溶液6ml，開啟攪拌機(jī)攪拌，使其充分混合。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以避免罐ロ附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°C滅活16小時(shí)(以罐內(nèi)溫度達(dá)到37°C開始計(jì)吋，開啟攪拌機(jī)連續(xù)攪拌)后取出，放2 8°C保存。5.半成品檢驗(yàn)(I)雞新城疫病毒液I)病毒含量測(cè)定將濃縮后滅活前取出的胚液進(jìn)行10倍系列稀釋，取10_7、10_8、10_93個(gè)稀釋度，各尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚5個(gè)，每胚O. 1ml，置37°C繼續(xù)孵育，毎日照胚2次，觀察5日，無論死胚、活胚均應(yīng)測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，凝集價(jià)不低于1:128 (微量法)者，判為感染，計(jì)算EID5tl，結(jié)果O. Iml病毒含量為IO8 9EID5tl的胚液。2)紅細(xì)胞凝集價(jià)測(cè)定取濃縮后滅活前的胚液，按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定方法進(jìn)行測(cè)定，其凝集價(jià)為1:2048 (微量法)。3)滅活檢驗(yàn)取10日齡SPF雞胚6個(gè)，尿囊腔內(nèi)接種滅活病毒液，每個(gè)O. 2ml，置37°C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察5日。雞胚健活，對(duì)所有胚液分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，均不出現(xiàn)凝集，將胚液收獲再盲傳一代，仍無凝集價(jià)，滅活完全。4)無菌檢驗(yàn)取滅活的胚液按《中國(guó)獸藥典》的規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果無菌生長(zhǎng)。(2)傳染性支氣管炎病毒液I)病毒含量測(cè)定將濃縮后滅活前取出的胚液進(jìn)行10倍系列稀釋，取10_5、10_6和10_73個(gè)稀釋度，分別尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚5個(gè)，每胚O. 1ml，每日照胚2次，觀察6日。6日后收取雞胚，無論死胚、活胚(接種后24小時(shí)內(nèi)死亡者除外)均稱重觀察雞胚病變，其胎兒具有失水、卷縮、發(fā)育小(接種胎兒重量比對(duì)照胚最輕胎兒重量少2克以上)等特異性病痕者，判為感染，計(jì)算EID5tlt5每O. Iml病毒含量為IO6 9EID5tlt52)無菌檢驗(yàn)取滅活的病毒液，按《中國(guó)獸藥典》的規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果無菌生長(zhǎng)。3)滅活檢驗(yàn)取10日齡SPF雞胚6個(gè)，尿囊腔內(nèi)接種滅活病毒液，每個(gè)O. 2ml，置37 °C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察5日，雞胚無死亡。對(duì)所有雞胚進(jìn)行檢驗(yàn)，均不出現(xiàn)失水、卷縮、發(fā)育小等現(xiàn)象。將胚液收獲再盲傳一代，仍無死亡，無病變，滅活完全。(3)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白 I) VP2含量檢測(cè)將制苗用VP2蛋白液對(duì)雞傳染性法氏囊病病毒陽性血清(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)按常規(guī)方法進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，上清液中表達(dá)產(chǎn)物VP2的滴度(AGP效價(jià))為1:80。2)無菌檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》的規(guī)定進(jìn)行，結(jié)果無菌生長(zhǎng)。3)內(nèi)毒素檢測(cè)將滅菌后的VP2蛋白液按“附注”方法進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)，用內(nèi)毒素< O. 125EU/ml的氯化鈉注射液將VP2蛋白稀釋1000倍，鱟試劑盒檢測(cè)為陰性。(4)病毒性關(guān)節(jié)炎病毒液I)無菌檢驗(yàn)取滅活的胚液按《中國(guó)獸藥典》的規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果無菌生長(zhǎng)。2)滅活檢驗(yàn)取7日齡SPF雞胚6個(gè)，卵黃囊接種滅活濃縮胚液，每胚O. 2ml，置37°C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察5日。雞胚均健活，收獲胚液并逐個(gè)檢查胎兒，沒有任何病變。將陰性樣品的胚液混合，再盲傳一代，仍無特異性病痕，滅活完全。3)病毒含量測(cè)定將濃縮后滅活前的病毒也用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10_4、10_5、10_63個(gè)稀釋度，分別卵黃囊接種7曰齡SPF雞胚5個(gè)，每胚O. lml，記錄24 168小時(shí)內(nèi)死亡且胎兒病變明顯的雞胚數(shù)，結(jié)果每O. Iml病毒含量為IO5 9EID5tl，可用于制苗。(ニ)疫苗制備(I)油相制備取優(yōu)質(zhì)注射用白油3760ml，硬脂酸鋁80ml，在油相制備罐中混合均勻并加熱至80°C后，再加司本-80240ml，至溫度達(dá)到125°C時(shí)維持30分鐘，冷卻后備用。(2)水相制備將檢驗(yàn)合格的雞新城疫病毒液、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白、病毒性關(guān)節(jié)炎病毒液各500ml混合(使混合后O. Iml水相中雞新城疫病毒含量不低于108_°EID5Q，M41株傳染性支氣管炎病毒含量不低于106_qEID5q ;傳染性法氏囊病毒VP2蛋白與雞傳染性法氏囊病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的瓊擴(kuò)效價(jià)不低于1:16 ;病毒性關(guān)節(jié)炎病毒含量不低于105_°EID5Q)。取滅菌后的吐溫-8028ml，加入配液罐中，同時(shí)加混合抗原液2000ml，充分振搖,開動(dòng)攪拌電機(jī)攪拌30分鐘，使吐溫-80完全溶解。(3)乳化取油相4000ml放入乳化罐中，開動(dòng)電機(jī)，慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)徐徐加入水相I份后，再以4000r/min攪拌30分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳汞溶液60ml。乳化后，取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底無析出的水相。(4)分裝分裝IOOml/瓶，共60瓶，加蓋密封。實(shí)施例2成品檢驗(yàn)——實(shí)驗(yàn)室試制ー批四聯(lián)滅活疫苗約6000ml，批號(hào)為2011001。I.性狀外觀乳白色乳剤。
劑型油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第I滴外，均不擴(kuò)散。穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相為O. Iml,符合規(guī)定。黏度按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行，黏度值為46cP，符合規(guī)定。2.裝量檢查按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定方法進(jìn)行，測(cè)定3瓶結(jié)果為251. 8ml、252. 2ml、252. 5ml,符合規(guī)定。3.無菌檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》的規(guī)定進(jìn)行,無菌生長(zhǎng)。4.安全檢驗(yàn)用7日齡SPF雞10只，每只肌肉或頸部皮下注射疫苗lml，觀察14日，結(jié)果試驗(yàn)雞均健活，無任何局部和全身不良反應(yīng)。 5.效カ檢驗(yàn)(I)雞新城疫部分效カ檢驗(yàn)采用血清學(xué)方法進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果不符合規(guī)定時(shí)，可采用免疫攻毒法進(jìn)行檢驗(yàn)。I)血清學(xué)方法用30日齡SPF雞15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μ 1，另5只不免疫作対照。接種后21日，每只雞分別采血，分離血清，按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定方法進(jìn)行HI抗體效價(jià)測(cè)定。免疫組HI抗體效價(jià)的幾何平均值為1:24(微量法)，未免疫對(duì)照組HI抗體效價(jià)的幾何平均值為1:2 (微量法)。2)免疫攻毒法用30日齡SPF雞15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μ 1，另5只不免疫作対照。接種后21日，每只雞各肌肉注射雞新城疫病毒北京株強(qiáng)毒(CVCC AV1611株)IO5tlELD5tl，觀察14日。對(duì)照組5只應(yīng)全部死亡，免疫組10只全保護(hù)。(2)雞傳染性支氣管炎部分用14日齡SPF雞25只，其中20只各點(diǎn)眼、滴鼻接種傳染性支氣管炎活疫苗(Η120株)I羽份(O. 05ml)，另5只不接種作為對(duì)照。接種后21日，分別采血，分離血清，同時(shí)免疫雞再分別肌肉接種三聯(lián)滅活疫苗O. 3ml，ニ免后21日再將免疫雞和對(duì)照雞分別采血,分離血清。將兩次血清分別測(cè)HI抗體效價(jià)。免疫組ニ免血清HI抗體效價(jià)的幾何平均值比首免血清高6. 4倍(首免為1:20，ニ免為1:128)，未免疫對(duì)照組血清HI抗體效價(jià)的幾何平均值為1:8 (微量法)。(3)雞傳染性法氏囊病部分效カ檢驗(yàn)以下方法任擇其一。I)血清學(xué)方法取21日齡SPF雞20只，其中10只各肌肉或頸部皮下注射疫苗O. 2ml，另外10只不免疫作為對(duì)照，同群飼養(yǎng)。接種后21日，每只雞分別采血，分離血清，做瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)。免疫雞10只瓊擴(kuò)效價(jià)為1:21，對(duì)照雞應(yīng)全部陰性。2)免疫攻毒法取21日齡SPF雞20只，其中10只各肌肉或頸部皮下注射疫苗
O.2ml，另外10只不免疫作為對(duì)照，同條件下隔離飼養(yǎng)。接種后21日，所有免疫雞和對(duì)照雞，每只點(diǎn)眼途徑接種100倍稀釋的雞傳染性法氏囊病強(qiáng)毒BC6-85株毒液O. Iml (實(shí)含毒量> 100個(gè)BID)。攻毒后，每天觀察雞只的臨床表現(xiàn)，記錄發(fā)病和死亡雞數(shù)，至72 96小吋，撲殺存活雞，逐只剖解，觀察法氏囊等病變。免疫雞10只全部正常，不出現(xiàn)法氏囊病變；對(duì)照雞5只全發(fā)病，出現(xiàn)明顯的法氏囊病變(如胸肌或腿肌條狀出血、法氏囊腫大或萎縮、發(fā)黃、內(nèi)有膠凍樣分泌物等ー種以上病變)。(4)病毒性關(guān)節(jié)炎部分效カ檢驗(yàn)I)血清學(xué)方法取21日齡SPF雞15只，其中10各頸部皮下或肌肉注射疫苗O. 2ml，另外5只不免疫作為對(duì)照，同群飼養(yǎng)。21日后，每只雞分別采血、分離血清，做瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，免疫雞10只抗體全部陽性，對(duì)照雞5只應(yīng)全部陰性。2)免疫攻毒法取21日齡SPF雞15只，其中10各頸部皮下或肌肉注射疫苗O. 2ml，另外5只不免疫作為對(duì)照，同群飼養(yǎng)。21日后，每只雞經(jīng)腳墊接種雞病毒關(guān)節(jié)炎病毒AV2311株強(qiáng)毒，O. 2ml (含2X IO4ELD5tl)/只，觀察120小吋，檢查趾、跗關(guān)節(jié)病變。對(duì)照組5只雞全發(fā)病，免疫組10只雞全部保護(hù)。2011001批疫苗的效檢結(jié)果為
權(quán)利要求
1.ー種雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎四聯(lián)滅活疫苗，其特征在于該疫苗主要成分是滅活的La Sota株雞新城疫病毒、M41株傳染性支氣管炎病毒、AV2311株病毒性關(guān)節(jié)炎病毒和E. coli BL21/pET28a_VP2株大腸桿菌基因工程菌表達(dá)的傳染性法氏囊病毒VP2蛋白和疫苗佐劑。
2.如權(quán)利要求I所述ー種雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎四聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于 (1)生產(chǎn)用菌毒種為L(zhǎng)aSota株雞新城疫病毒、M41株傳染性支氣管炎病毒、表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E. coli BL21/pET28a-VP2株和AV2311株病毒性關(guān)節(jié)炎病毒； (2)分別按常規(guī)方法用雞胚繁殖LaSota株雞新城疫病毒、M41株傳染性支氣管炎病毒和AV2311株病毒性關(guān)節(jié)炎病毒，收獲病毒液后經(jīng)濃縮和滅活エ藝制備成滅活病毒液；用加卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E. coli BL21/pET28a-VP2株，經(jīng)過破菌、硫酸銨提取和滅菌エ藝制備成表達(dá)的傳染性法氏囊病毒VP2蛋白； (3)將以上制備的四種滅活抗原混合后按常規(guī)方法制備滅活佐劑疫苗。
3.如權(quán)利要求2所述ー種雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎四聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于四種滅活抗原等量混合，其中0. Iml水相中含有雞新城疫病毒含量不低于108_°EID5(i,0. Iml水相中含有M41株傳染性支氣管炎病毒含量不低于IO6 tlEID5tl ；0. Iml水相中含有病毒性關(guān)節(jié)炎病毒含量不低于105_°EID5(I。
4.如權(quán)利要求2所述ー種雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎四聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于四種滅活抗原等量混合，其中O. Iml水相中含有傳染性法氏囊病毒VP2蛋白效價(jià)按與雞傳染性法氏囊病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的瓊擴(kuò)效價(jià)計(jì)不低于 I:16。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病、病毒性關(guān)節(jié)炎四聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法。本發(fā)明采用新城疫病毒La Sota株、傳染性支氣管炎病毒M41株、表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E.coli BL21/pET28a-VP2株和病毒性關(guān)節(jié)炎AV2311株作為生產(chǎn)菌毒種，超強(qiáng)濃縮工藝和優(yōu)質(zhì)佐劑制備成滅活疫苗，免疫動(dòng)物后抗體產(chǎn)生快，效價(jià)高，保護(hù)期長(zhǎng)，降低了疫病的發(fā)生及蔓延。
文檔編號(hào)A61K39/215GK102688487SQ20121020063
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者左青山, 李昌友, 李曉林, 李芳 , 李陸梅, 范根成 申請(qǐng)人:青島易邦生物工程有限公司