吉馬酮在制備用于治療肝癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了吉馬酮作為治療肝癌藥物的應(yīng)用，吉馬酮對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IC50約160μm，流式細(xì)胞儀檢測吉馬酮對肝癌HepG2細(xì)胞周期和凋亡的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，吉馬酮能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞G2/M周期阻滯并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。通過不同濃度吉馬酮處理HepG2細(xì)胞，檢測周期阻滯、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示吉馬酮通過下調(diào)cyclinB1和CDK1蛋白誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞G2/M周期阻滯，通過p53調(diào)控的線粒體凋亡途徑促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡。本發(fā)明檢測了吉馬酮處理后的HepG2細(xì)胞ROS產(chǎn)量，結(jié)果顯示吉馬酮可以促進(jìn)ROS產(chǎn)量的上升，可以造成細(xì)胞氧化性損傷。
【專利說明】吉馬酮在制備用于治療肝癌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及治療肝癌的藥物，具體涉及吉馬酮(分子式=C15H22O)在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵和基礎(chǔ)就是對其有效成分的鑒定和有效成分作用機(jī)理的研究，因此對中藥有效成分中的深入研究具有非常重要的意義，這將有利于中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程，加快中藥世界化的腳步，更有利于保障人類健康。
[0003]莪術(shù)揮發(fā)性油抗癌的潛力越來越受到關(guān)注和確認(rèn)，但是對于莪術(shù)揮發(fā)性油中的具體化學(xué)成分和其作用機(jī)制還處于研究階段，特別是吉馬酮、莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮等莪術(shù)揮發(fā)性油中的三種主要成分的抗癌效果一直還沒有定論。中國專利(申請?zhí)枮?2125900.3)公開了吉馬酮用來抗腫瘤細(xì)胞，中國專利(申請?zhí)枮?01010604066.3)公開了吉馬酮單獨(dú)使用治療宮頸癌，未檢索到吉馬酮單獨(dú)使用用來治療肝癌的文獻(xiàn)。
[0004]肝癌的致病因素至今未研究清楚，目前的研究認(rèn)為其誘病原因包括物理、化學(xué)等各種因素導(dǎo)致肝細(xì)胞增殖特別是周期調(diào)控失控和腫瘤抑制子失活或表達(dá)受阻等，對肝癌這種疾病，目前尚無有效的治療藥物。因此，研究治療肝癌的有效藥物，是醫(yī)藥領(lǐng)域的一項(xiàng)重要課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的 在于提供一種治療肝癌的藥物，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006]本發(fā)明提供的治療肝癌的藥物是吉馬酮。吉馬酮是莪術(shù)揮發(fā)油中的主要成分，吉馬酮化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。本發(fā)明對莪術(shù)揮發(fā)油中的主要成分吉馬酮在人肝癌細(xì)胞H印G2中進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，吉馬酮對人肝癌細(xì)胞(HepG2)生長有明顯的抑制作用。經(jīng)吉馬酮處理后的人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞未有明顯的細(xì)胞毒性,從而為臨床上肝癌疾病的治療提供了一種安全有效毒副作用小的有效藥物。
[0007]本發(fā)明首先通過MTT法檢測了吉馬酮對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示吉馬酮對H印G2細(xì)胞的增殖顯示濃度依賴性的抑制。然后，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡并給以藥物處理24h后，結(jié)果顯示藥物在80-240 μ M濃度內(nèi)，誘導(dǎo)H印G2細(xì)胞G2/M周期阻滯并濃度依賴性的促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們還檢測了藥物對H印G2細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果同樣顯示吉馬酮抑制H印G2細(xì)胞周期蛋白cyclinBl和周期蛋白依賴性激酶CDkl的表達(dá)，并上調(diào)腫瘤抑制蛋白p53的表達(dá)，同時(shí)也檢測了吉馬酮對H印G2細(xì)胞ROS產(chǎn)量的影響，結(jié)果顯示給以吉馬酮處理后，ROS含量明顯上升，說明吉馬酮可以造成HepG2細(xì)胞氧化性損傷。其次，我們檢測了吉馬酮對于正常肝細(xì)胞的細(xì)胞毒性，對應(yīng)濃度吉馬酮處理人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞后，MTT結(jié)果顯示吉馬酮對L02細(xì)胞增殖沒有明顯影響。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，確定吉馬酮可以作為用于預(yù)防和治療肝癌的藥物。吉馬酮可以單獨(dú)制成治療肝癌藥物，也可以以吉馬酮為活性成分制備用于預(yù)防和治療肝癌的復(fù)方制劑。吉馬酮的給藥劑量按照細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用量為80-240 μ M0
[0008]本發(fā)明提供了吉馬酮作為治療肝癌藥物的應(yīng)用，吉馬酮對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IC5tl約160 μ m，流式細(xì)胞儀檢測吉馬酮對肝癌H印G2細(xì)胞周期和凋亡的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，吉馬酮能誘導(dǎo)H印G2細(xì)胞G2/M周期阻滯并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。通過不同濃度吉馬酮處理H印G2細(xì)胞，檢測周期阻滯、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示吉馬酮通過下調(diào)cyclin BI和⑶Kl蛋白誘導(dǎo)H印G2細(xì)胞G2/M周期阻滯，通過p53調(diào)控的線粒體凋亡途徑促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡。本發(fā)明檢測了吉馬酮處理后的HepG2細(xì)胞ROS產(chǎn)量，結(jié)果顯示吉馬酮可以促進(jìn)ROS產(chǎn)量的上升，可以造成細(xì)胞氧化性損傷。
[0009]本發(fā)明對已知化合物吉馬酮發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域。吉馬酮可從藥材莪術(shù)中提取而得，而且提取技術(shù)成熟，提取的吉馬酮純度可達(dá)98%以上，能夠保證工業(yè)化生產(chǎn)。以吉馬酮為活性成分的藥物可以配置成多種劑型，如:口服膠囊劑、片劑、軟膠囊劑、微囊劑等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為吉馬酮化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
[0011]圖2為吉馬酮對H印G2細(xì)胞的增殖抑制檢測示意圖，不同濃度藥物加入到H印G2細(xì)胞中培養(yǎng)24h后，采用MTT法檢測藥物對細(xì)胞生長的影響結(jié)果圖；
[0012]圖3為吉馬酮處理對!fepG2細(xì)胞形態(tài)的改變和細(xì)胞核的影響。A、C圖為對照組；B圖為16(^11吉馬酮處理后，!10(*65^33258染色液染色后的熒光照片；D圖為160 μ M吉馬酮處理后倒置顯微鏡下IfepG2細(xì)胞的形態(tài)。
[0013]圖4為一種檢測藥物對HepG2細(xì)胞凋亡的影響。不同濃度吉馬酮(A:對照，B:80 μ M, C: 160 μ Μ, D: 200 μ Μ)處理 24h 后，Annexin-V 和 PI 兩種染料雙染 HepG2 細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析處于正常(左下)、早凋(右下)、晚凋(右上)、壞死(左上)期的細(xì)胞比例。
[0014]圖5為吉馬酮對HepG2細(xì)胞周期的影響結(jié)果分析。(A圖為對照，Β:80μΜ, C:160yM, D:200yM)
[0015]圖6為檢測藥物對HepG細(xì)胞中周期和凋亡相關(guān)幾種蛋白表達(dá)的影響。將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞用不同濃度的實(shí)施例1處理后，提取總蛋白，以GAPDH為內(nèi)參，通過western blot 方法檢測 p53, p21, Cyclin BI, CDKI, Bax, Bcl-2, Bcl-xl 蛋白的表達(dá)水平。
[0016]圖7為檢測藥物對HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)物的影響。將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞用不同濃度的實(shí)施例1處理，通過DCFH-DA探針檢測ROS的含量。(A-F: 0，40 μ M，80 μ M，160 μ Μ, 200 μ Μ, 240 μ Μ)
[0017]圖8為檢測藥物對人正常肝細(xì)胞L02增殖的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0018]為了更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施方法對本
【發(fā)明內(nèi)容】
作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。
[0019]實(shí)施例1吉馬酮對H印G2細(xì)胞的增殖抑制作用比較
[0020]1.實(shí)驗(yàn)材料
[0021]1.1細(xì)胞株[0022]人肝癌細(xì)胞株HepG2購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for TypeCultureCollection, CCTCC)。
[0023]1.2藥品及試劑
[0024]吉馬酮:購自成都曼斯特生物科技有限公司
[0025]DMSO:美國S i gma公司產(chǎn)品
[0026]DMEM及胎牛血清:美國Gibco產(chǎn)品
[0027]青霉素-鏈霉素溶液:安特捷生物技術(shù)有限公司
[0028]MTT:美國S i gma公司產(chǎn)品
[0029]胰蛋白酶:碧云天生物技術(shù)研究所
[0030]酶標(biāo)儀Sunrise:TECAN 公司
[0031]超凈實(shí)驗(yàn)臺SZX型:上海浦東躍欣科儀廠
[0032]C02培養(yǎng)箱HH.CP型:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司
[0033]微量移液槍P2.5等:大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司
[0034]2.實(shí)驗(yàn)方法: [0035]2.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0036]人肝癌!fepG2細(xì)胞株!fepG2用含有10%FBS、青霉素100 μ g/ml、鏈霉素100 μ g/ml的高糖DMEM培養(yǎng)液于37°C，C02體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0037]2.2MTT法檢測不同藥物對H印G2細(xì)胞生長抑制情況
[0038]將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔20000個細(xì)胞，過夜待細(xì)胞貼壁后，加入不同藥液，每個濃度平行5孔，370C，5%C02培養(yǎng)24小時(shí)候每孔加入5mg/ml MTT 24 μ I，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，棄去上清液，每孔加入DMSO 100 μ 1，用酶標(biāo)儀在492nm波長處測出細(xì)胞對照組和各藥物組的OD值，取各組均值，重復(fù)試驗(yàn)3次。以下面的公式計(jì)算各組藥物對細(xì)胞的抑制率IR= (1-藥物組OD值/對照組OD值)X 100%。結(jié)果顯示:吉馬酮明顯抑制H印G2細(xì)胞增殖且呈劑量依賴關(guān)系(見圖2)
[0039]實(shí)施例2吉馬酮抑制HepG2細(xì)胞增殖的機(jī)制研究
[0040]1.實(shí)驗(yàn)材料
[0041]1.1細(xì)胞株(同實(shí)施例1)
[0042]1.2藥品及試劑
[0043]吉馬酮:購自成都曼斯特生物科技有限公司
[0044]DMSO:購自美國S i gma公司產(chǎn)品
[0045]DMEM及胎牛血清:購自美國Gibco產(chǎn)品
[0046]Western及IP細(xì)胞裂解液:購自碧云天生物技術(shù)研究所
[0047]PMSF:購自碧云天生物技術(shù)研究所
[0048]Hoechst 33258染色液:購自碧云天生物技術(shù)研究所
[0049]MTT:美國Si gma公司產(chǎn)品
[0050]十二烷基硫酸鈉(SDS):武漢鼎國生物技術(shù)有限公司
[0051]甘氨酸:武漢鼎國生物技術(shù)有限公司
[0052]Nacl:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司
[0053]甲醇:武漢鼎國生物技術(shù)有限公司[0054]三羥甲基氨基甲烷(Tris):武漢鼎國生物技術(shù)有限公司
[0055]過硫酸銨(APS):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司
[0056]丙烯酰胺:武漢安科生物科技有限公司
[0057]雙甲叉丙烯酰胺:武漢安科生物科技有限公司
[0058]TEMED:武漢三益實(shí)驗(yàn)用品經(jīng)營部
[0059]P1:武漢三益實(shí)驗(yàn)用品經(jīng)營部
[0060]RNA酶A:武漢市洪山區(qū)仁久實(shí)驗(yàn)器材公司
[0061]蛋白上樣緩沖液:武漢三益實(shí)驗(yàn)用品經(jīng)營部
[0062]NC膜:博士德生物有限公司[0063]預(yù)染蛋白質(zhì)Marker III (藍(lán)色):博士德生物有限公司
[0064]胰蛋白酶:碧云天生物技術(shù)研究所
[0065]PBS:博士德生物有限公司
[0066]p53、p21、Bax、Bcl_2、Bcl-xl、cyclinBl、CDKl 對應(yīng)一抗:Santa Cruz
[0067]羊抗兔和羊抗鼠二抗:博士德生物有限公司
[0068]BSA:武漢三益實(shí)驗(yàn)用品經(jīng)營部
[0069]脫脂奶粉:內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)
[0070]化學(xué)發(fā)光檢測底物:Thermo Scientific
[0071]BCA蛋白濃度測定試劑盒:碧云天生物技術(shù)研究所
[0072]動物組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒:北京莊盟國際生物基因科技有限公司
[0073]逆轉(zhuǎn)錄試劑盒:Fermentas
[0074]流式細(xì)胞儀(BDLSR II):美國BD公司產(chǎn)品
[0075]電泳儀DYY-4:北京六一儀器廠
[0076]轉(zhuǎn)膜儀DYY-4:北京六一儀器廠
[0077]低溫高速離心機(jī)CR21G I1:日本日立公司
[0078]壓力蒸汽滅菌鍋YX-400B:上海三申醫(yī)療器械有限公司
[0079]熒光顯微鏡1X71:日本Olympus公司
[0080]倒置顯微鏡永新XD-202:南京江南永新光學(xué)有限公司
[0081]2.試驗(yàn)方法
[0082]2.1細(xì)胞形態(tài)觀察及Hoechst33258染色
[0083]取對數(shù)生長期H印G2細(xì)胞以2X IO5個/孔的細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板中，置于細(xì)胞C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6-8h待細(xì)胞貼壁后，加入終濃度為160 μ M的吉馬酮處理24h，對照組加同樣體積(Iml)的DMEM培養(yǎng)液。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變；Hoechst 33258是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，對細(xì)胞的毒性較低。Hoechst 33258染色液可直接用于固定細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色，也可直接用于活細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色。經(jīng)過Hoechst33258染色后在突光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示吉馬酮處理后，HepG2細(xì)胞形態(tài)有明顯改變，而且核皺縮明顯(見圖3)。
[0084]2.2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡
[0085]取對數(shù)生長期H印G2細(xì)胞以2X105個/孔的細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板中，置于細(xì)胞C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6-8h待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的吉馬酮，終濃度為80，160，200 μ M，對照組加同樣體積(Iml)的DMEM培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24h，每孔收集約10萬細(xì)胞，離心后棄上清。加0.5ml的染色緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入5μ I Annexin V-FITC和10μ I PI，4°C染色15min，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示吉馬酮可以濃度依賴性的促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡，而對細(xì)胞壞死沒有明顯影響(見圖4)。
[0086]2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期
[0087]取對數(shù)生長期H印G2細(xì)胞以2X105個/孔的細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板中，置于細(xì)胞C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6-8h待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的吉馬酮，終濃度為80，160，200μΜ，對照組加同樣體積(Iml)的DMEM培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24h，每孔收集約10萬細(xì)胞，離心后棄上清，PBS洗滌2次后用80%的冰乙醇_20°C固定過夜，離心收集細(xì)胞(最多可放2周)，依次加入PBS，PI (IOX)和RNA酶A (10 X )各10 μ 1，最后加入PBS至總體積200-300 μ 1，小心吹打均勻，避光染色15min后上機(jī)檢測，結(jié)果顯示吉馬酮可以誘導(dǎo)!fepG2細(xì)胞G2/M周期阻滯(見圖5)。
[0088]
【權(quán)利要求】
1.吉馬酮在制備用于治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
2.一種用于治療肝癌的藥物制劑，由作為活性成分的吉馬酮和藥學(xué)上可接受的載體或/和添加劑組成。`
【文檔編號】A61P35/00GK103505444SQ201210203255
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月19日
【發(fā)明者】何光源, 楊廣笑, 柳昀熠, 方斌, 王維, 陳明潔 申請人:華中科技大學(xué)