專利名稱：山楂葉及其提取物的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及山楂葉及其提取物的新用途。
背景技術(shù)：
白內(nèi)障是由于晶狀體混濁，失去雙透鏡作用，使光線不能透過晶狀體到達(dá)視網(wǎng)膜，導(dǎo)致患者失明的一種常見眼科疾病，也是世界首位致盲因素，大多是因?yàn)槔匣痛x障礙如糖尿病等引發(fā)。白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為在高血糖情況下多元醇通路被激活，導(dǎo)致多元醇積聚，引起晶體纖維水腫，蛋白質(zhì)合成減少、蛋白質(zhì)分解、裂解及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，最后晶體皮質(zhì)和核渾濁，白內(nèi)障形成。醛糖還原酶(AR)是多元醇代謝通路的關(guān)鍵限速酶，在高血糖生理狀態(tài)或組織過度利用糖時(shí)被激活，促使體內(nèi)過量葡萄糖轉(zhuǎn)化為山梨醇。山梨醇在細(xì)胞內(nèi)大量蓄積可改變細(xì)胞膜的通透性，造成細(xì)胞滲透性水腫，進(jìn)而出現(xiàn)糖尿病并發(fā)癥，尤其在AR含量較高的敏感部位，腎小球基底膜、視網(wǎng)膜及外周神經(jīng)等。大量動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明醛糖還原酶抑制劑(ARI)能有效改善多元醇代謝通路異常，治療和預(yù)防白內(nèi)障?，F(xiàn)代白內(nèi)障囊外摘除或超聲乳化術(shù)聯(lián)合后房人工晶狀體植入術(shù)是當(dāng)前治療白內(nèi)障的主要手段。術(shù)后晶狀體后囊渾濁即后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生會使術(shù)后提高的視力再度下降，影響手術(shù)效果且費(fèi)用昂貴。因此，探討用藥物防治白內(nèi)障，尋找療效確切、廉價(jià)的防治白內(nèi)障新藥就成為藥學(xué)工作者研究的重點(diǎn)。山楂葉為薔薇科植物山里紅Crataeguspinnatifida Bge. var. major N. E. Br.或山楂C. pinnatifida Bge.的葉子。性酸、甘、平,主入肝經(jīng)。《中國藥典》2005年版載其具有“活血化瘀，理氣通脈”的作用。因此進(jìn)一步研究山楂葉的藥理作用，將其用于白內(nèi)障的預(yù)防和治療，是現(xiàn)階段一個(gè)新的研究方向，具有重要的臨床意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供山楂葉的新用途。本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供山楂葉提取物的新用途。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明提供了山楂葉在抑制醛糖還原酶活性中的用途。本發(fā)明提供了山楂葉在增強(qiáng)晶狀體的抗氧化能力，減少晶狀體的氧化損傷中的用途。本發(fā)明提供了山楂葉在制備醛糖還原酶抑制藥物中的用途。本發(fā)明提供了山楂葉在制備預(yù)防和治療白內(nèi)障的藥物中的用途。本發(fā)明提供了山楂葉提取物在抑制醛糖還原酶活性中的用途。本發(fā)明提供了山楂葉提取物在增強(qiáng)晶狀體的抗氧化能力，減少晶狀體的氧化損傷中的用途。
本發(fā)明提供了山楂葉提取物在制備醛糖還原酶抑制藥物中的用途。本發(fā)明提供了山楂葉提取物在制備預(yù)防和治療白內(nèi)障的藥物中的用途。
優(yōu)選的，上述用途中所述山楂葉提取物為山楂葉乙醇提取物。優(yōu)選的，上述用途中所述山楂葉乙醇提取物為山楂葉50%_95%乙醇提取物。本發(fā)明還提供了實(shí)現(xiàn)上述用途的藥物組合物，包含治療有效量的山楂葉和/或山楂葉提取物以及任選的藥學(xué)可接受的賦形劑。上述藥學(xué)可接受的賦形劑可以是藥物制劑領(lǐng)域中任何常規(guī)的賦形劑，特定賦形劑的選擇將取決于用于治療特定患者的給藥方式或疾病類型和狀態(tài)，用于特定給藥模式的合適藥物組合物的制備方法完全在藥物領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。例如，可以作為藥學(xué)可接受的賦形劑包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、載體、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑等。上述組合物可以制成滴劑、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、注射乳劑、注射用無菌粉針等多種形式，上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。 本發(fā)明的有益效果是山楂葉及其提取物通過抑制醛糖還原酶，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，從而有望用于制備治療白內(nèi)障的藥物，進(jìn)而達(dá)到對于白內(nèi)障的治療目的。


圖IA為山楂葉HPLC圖譜；圖IB為山楂葉提取物HPLC圖譜。
具體實(shí)施例方式為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例I山楂葉提取物的制備稱取干燥山楂葉1kg，加入70%乙醇10L，沸騰回流提取2小時(shí)，過濾，殘?jiān)屑尤?0%乙醇10L，沸騰回流提取2小時(shí)，過濾，兩次濾液合并，40°C水浴加熱減壓濃縮至干，得到山楂葉70%乙醇提取物214g。實(shí)施例2山楂葉提取物的制備稱取干燥山楂葉1kg，加入50%乙醇10L，沸騰回流提取2小時(shí)，過濾，殘?jiān)屑尤?0%乙醇10L，沸騰回流提取2小時(shí)，過濾，兩次濾液合并，40°C水浴加熱減壓濃縮至干，得到山楂葉50%乙醇提取物235g。 實(shí)施例3山楂葉提取物的制備稱取干燥山楂葉1kg，加入90%乙醇10L，沸騰回流提取2小時(shí)，過濾，殘?jiān)屑尤?0%乙醇10L，沸騰回流提取2小時(shí)，過濾，兩次濾液合并，40°C水浴加熱減壓濃縮至干，得到山楂葉90%乙醇提取物20lg。實(shí)施例4山楂葉提取物的制備山楂葉藥材Ikg用10倍量70%乙醇提取2次，每次2h，提取液減壓濃縮揮去乙醇，濾過。濾液用DlOl大孔樹脂吸附，樹脂床體積與生藥量之比為1:1 (w/v);上樣后，先以2倍樹脂床體積的水洗滌，棄去水洗液，用4倍樹脂床體積的70%乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，真空干燥，即得山楂葉提取物88g。實(shí)施例5山楂葉和山楂葉提取物中金絲桃苷的測定I儀器和試藥Agilent 1100液相色譜系統(tǒng)(VWD檢測器)；甲醇，乙腈，四氫呋喃為色譜純；金絲桃苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號111521-200303)；山楂葉藥材采自天津薊縣青山嶺，并經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院郭俊華副研究員鑒定為薔薇科植物山楂的葉。DlOl大孔樹脂(天津市海光化工有限公司，凈品型)。2方法與結(jié)果 2. I山楂葉提取物的制備山楂葉藥材用10倍量70%乙醇提取2次，每次2h，提取液減壓濃縮揮去乙醇，濾過。濾液用DlOl大孔樹脂吸附，樹脂床體積與生藥量之比為1:1 (w/v);上樣后，先以2倍樹脂床體積的水洗滌，棄去水洗液，用4倍樹脂床體積的70%乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，真空干燥，即得山楂葉提取物。2. 2供試品溶液的制備2. 2. I山楂葉中金絲桃苷含量測定供試品溶液取山楂葉藥材粉末I. 0g，精密稱定，加70%乙醇IOOml回流提取2小時(shí)，補(bǔ)足失重，0. 45 Pm微孔濾膜過濾，即得。2. 2. 2山楂葉提取物中金絲桃苷含量測定供試品溶液取山楂葉提取物20mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加甲醇約20ml，超聲處理(功率250W,頻率40kHz) 5分鐘，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，0. 45 u m微孔濾膜過濾，即得。2. 3HPLC 條件大連依利特色譜柱(Hypersil 0DS, 4. 6mmX 250mm, 5 u m),流動相為乙腈甲醇四氫呋喃0. 5% 醋酸=I 1 19. 4 78. 6 (v/v),流速lmL min-1 ;檢測波長 363nm。2. 4方法學(xué)考察金絲桃苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱定金絲桃苷對照品適量，用甲醇配成系列濃度的對照品溶液，按2. 3色譜條件測定，金絲桃苷的回歸方程為Y(A)=17997X(e)+35. 17，相關(guān)系數(shù)r=0. 9995，線性范圍為8-320 u g. mL'金絲桃苷最低檢測限(LOD)和最低定量限(LOQ)分別為I U g. ml/1和3 ii g. mL'日間精密度和日內(nèi)精密度均小于4%。加樣回收率為96-104% (RSD%〈2%)。2. 5含量測定結(jié)果經(jīng)測定，山楂葉及山楂葉提取物中金絲桃苷含量分別為0. 16%和2. 35%。色譜圖見圖IA和圖IB。實(shí)施例6對蛋白質(zhì)糖基化終末產(chǎn)物形成抑制I.相關(guān)溶液配制IOmMP-巰基乙醇含有135mM磷酸緩沖液(pH7.0)配制方法精確稱取磷酸二氫鉀18. 36g、磷酸氫二鈉19. 17g，分別加入IL蒸餾水中，兩溶液混合調(diào)節(jié)pH值至7. O，按74. 18mg/100ml加入P -巰基乙醇，振蕩溶解。180mM磷酸緩沖液(pH7. 0)配制方法精確稱取磷酸二氫鉀24. 48g、磷酸氫二鈉25. 56g，分別加入IL蒸餾水中，兩溶液混合調(diào)節(jié)pH值至7. O。I. OM硫酸鋰溶液配制方法精確稱取硫酸鋰I. Ig溶于IOml蒸餾水中振蕩溶解。IOmM DL-甘油醛溶液配制方法精確稱取0. 9gDL_甘油醛溶于IL蒸餾水中振蕩溶解。IOmM咪唑含6M氫氧化鈉溶液配制方法精確稱取240g氫氧化鈉溶解于IL蒸餾水中，再稱取6. 8g咪唑振蕩溶解。0. 3mM NADPH溶液配制方法精確稱取2. 5mg NADPH加入IOml 180mM磷酸緩沖液(PH7.0)振蕩溶解，取出Iml溶液，加入27ml 180mM磷酸緩沖液(pH 7. 0)，配成0. OlM的NADPH溶液，冰浴保存。2.樣品溶液配制用DMSO溶解實(shí)施例I所述山楂葉70%乙醇提取物，配成64mg/ml的溶液，_20°C保存。實(shí)驗(yàn)前將樣品DMSO溶液用180mM磷酸緩沖液(pH 7. 0 )稀釋成400 u g/ml、200 u g/ml、100 y g/ml>50 u g/ml>25 u g/ml、12. 5 u g/ml、6. 25 u g/ml>0 u g/ml,各樣品溶液在終濃度時(shí)所含DMSO體積相等且小于2. 5%。3.醛糖還原酶制備
(I)醛糖還原酶提取方法Wistar大鼠脫白處死，立即摘取眼球，采用后路手術(shù)摘取晶狀體(冰上進(jìn)行)放入20mll0mMP-巰基乙醇含有135mM磷酸緩沖液(pH 7. 0)中，勻漿，100000Xg、4° C離心30min，取上清，-20°C保存。(2)醛糖還原酶篩選方法實(shí)驗(yàn)在玻璃試管中進(jìn)行，設(shè)三組，每組4個(gè)復(fù)孔，分別為對照組A、樣品組B、空白組C，各樣品測試組，180mM磷酸緩沖液(pH7. 0) 225 U 1U.0M硫酸鋰溶液50 u IUOmMDL-甘油醛溶液50 yl、提取的酶溶液100 ill和樣品溶液25iU混合，30°C預(yù)熱3min，加入0. 3mMNADPH溶液50 U 1，30°C反應(yīng)30min，加入0. 5M的鹽酸150 U I終止反應(yīng)；標(biāo)準(zhǔn)曲線組，180mM磷酸緩沖液(pH7. 0)2450 ii I、I. OM硫酸鋰溶液700 y IUOmM DL-甘油醛溶液700 y I、二甲基亞砜350 ill、提取的酶溶液1400 ill和0. 5M的鹽酸2100 ill混合后取出600 yl，分別加入NADP溶液使其終濃度為0 ii M、I ii M、2 ii M、4 ii M、8 ii M、16 u M，各測試管分別加入IOmM咪唑含6M氫氧化鈉溶液，60°C反應(yīng)20min，室溫放冷后于激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長460nm檢測熒光吸收度。4抑制活性計(jì)算方法按照以下公式計(jì)算有效組分各濃度的抑制率，據(jù)各濃度的抑制率計(jì)算出IC50。 抑制率(％)=(A-B)/ (A-C) XlOO其中A為對照組吸收度，B為樣品組吸收度，C為空白組吸收度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果山楂葉70%乙醇提取物醛糖還原酶半數(shù)抑制濃度(IC50)為89. 7 U g/ml，表明山楂葉70%乙醇提取物具有抑制醛糖還原酶活性，可以用于制備預(yù)防和治療白內(nèi)障的藥物，進(jìn)而治療白內(nèi)障。實(shí)施例7山楂葉70%乙醇提取物對硒誘導(dǎo)的白內(nèi)障大鼠的治療作用I.實(shí)驗(yàn)動物出生12天的Wistar大鼠60只(自己繁殖)，由母鼠喂養(yǎng)，飼養(yǎng)在天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，環(huán)境設(shè)施符合《中華人民共和國衛(wèi)生部實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)》二級標(biāo)準(zhǔn)，合格證號為醫(yī)動字第01-19981109號。

2.藥品配制方法制備滴眼液精確稱取實(shí)施例I所述一定量的山楂葉70%乙醇提取物，溶于雙蒸水中振蕩溶解配成lmg/ml、2mg/ml的溶液，抽濾后得滴眼液。動物分組出生12天的Wistar乳鼠，雌雄不拘，平行分成正常組、模型組、山楂葉70%乙醇提取物高劑量組(4mg/kg)、山楂葉70%乙醇提取物低劑量組(2mg/kg)、陽性對照組(卩比諾克辛鈉滴眼液，商品名白內(nèi)停，武漢遠(yuǎn)大制藥集團(tuán)股份有限公司，批號080925)，每組12只，母
乳喂養(yǎng)。白內(nèi)障模型制作及給藥于乳鼠出生第12天用鑷子輕輕打開乳鼠的眼瞼成杯狀，正常組和模型組滴入蒸餾水，給藥組滴入上述不同濃度的山楂葉70%乙醇提取物滴眼液，陽性對照組滴入吡諾克辛鈉滴眼液2ml/kg體重,保持眼睛睜開約Imin,防止藥液溢出眼外,每8h給藥I次,連續(xù)7日。于乳鼠出生第14天皮下注射亞硒酸鈉19mol/kg體重，96h后肉眼觀察白內(nèi)障程度，水合氯醛麻醉，腹主動脈取血、采集晶狀體，-80°C保存。4樣本采集腹主動脈取血后，迅速摘取眼球，采用后路手術(shù)法剝離晶狀體，用粗濾紙吸干，稱重，-80°C保存。檢測方法I血清指標(biāo)檢測血液3500r min'fC離心IOmin,分離出血清。用超氧化合物歧化酶試劑盒、丙二醛試劑盒、過氧化氫酶試劑盒(均為南京建成生物有限公司生產(chǎn))，于多功能讀板機(jī)上檢測超氧化合物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)水平。2晶狀體生化檢測晶狀體稱重后置勻漿管中，加入冰I. Oml 180mM磷酸緩沖液(pH7. 0)，勻漿，3500r mirTSfC離心IOmin,取上清液，用超氧化合物歧化酶試劑盒、丙二醒試劑盒、谷胱甘肽試劑盒、過氧化氫酶試劑盒(均為南京建成生物有限公司生產(chǎn))，于多功能讀板機(jī)上檢測SOD、MDA、GSH、CAT ;熒光分光光度法檢測醛糖還原酶活性。4實(shí)驗(yàn)結(jié)果4. I血清指標(biāo)檢測結(jié)果乳鼠血清SOD、CAT的活性及MDA含量見表1，可知模型組乳鼠血清SOD活性比正常組比顯著性降低，吡諾克辛鈉滴眼液、山楂葉70%乙醇提取物高劑量組和山楂葉70%乙醇提取物低劑量組均能顯著性提高亞硒酸鈉誘導(dǎo)的白內(nèi)障乳鼠血清SOD的活性；吡諾克辛鈉滴眼液、山楂葉70%乙醇提取物高劑量組乳鼠血清SOD的活性明顯高于正常組，山楂葉70%乙醇提取物高劑量的作用優(yōu)于吡諾克辛鈉滴眼液組。模型組乳鼠血清CAT活性與正常組比顯著性下降，吡諾克辛鈉滴眼液、山楂葉70%乙醇提取物高劑量組均能顯著性提高乳鼠血清CAT的活性，山楂葉70%乙醇提取物低劑量組有提高乳鼠血清CAT活性的趨勢。各劑量組乳鼠血清MDA含量沒有顯著性差異。表I乳鼠血清SOD、CAT的活性和MDA含量
權(quán)利要求
1.山楂葉作為唯一活性成分在制備預(yù)防和治療白內(nèi)障的藥物中的用途。
2.山楂葉乙醇提取物作為唯一活性成分在制備預(yù)防和治療白內(nèi)障的藥物中的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述山楂葉乙醇提取物為山楂葉50%-95%乙醇提取物。
全文摘要
本發(fā)明提供了山楂葉及其提取物在制備預(yù)防和治療白內(nèi)障的藥物中的用途，所述山楂葉及其提取物通過抑制醛糖還原酶，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，從而有望用于制備預(yù)防和治療白內(nèi)障的藥物，進(jìn)而達(dá)到對于白內(nèi)障的治療目的。
文檔編號A61P27/12GK102697901SQ20121020331
公開日2012年10月3日 申請日期2010年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月23日
發(fā)明者劉二偉, 張德芹, 李玉紅, 王濤, 胡利民, 趙春風(fēng), 高秀梅 申請人:天津中醫(yī)藥大學(xué)