專利名稱：一種提高畜禽免疫功能的蜂膠黃酮脂質(zhì)體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蜂膠黃酮脂質(zhì)體的制備方法，及其提高畜禽免疫功能的應(yīng)用，屬于中獸藥制備技術(shù)及免疫應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蜂膠黃酮(propolis flavone, PF)是蜂膠中所含的主要有效成分之一,具有抗氧化、抗病原微生物、抗炎、抗感染、抗過敏、抗腫瘤和增強免疫功能等廣泛的生物學功能和藥理學作用。然而，黃酮類化合物的抗氧化作用主要是通過自身的優(yōu)先氧化來避免其它成分被氧化的，這就使得黃酮自身并不穩(wěn)定，而蜂膠黃酮的不穩(wěn)定性又在很大程度上影響著蜂膠提取物的儲藏、使用和其功效的發(fā)揮。而且蜂膠黃酮作為一種免疫增強劑直接用于獸醫(yī)臨床，存在著體內(nèi)代謝較快、作用時間較短、成分復(fù)雜、質(zhì)量控制難、免疫增強作用相對較弱等不足之處，從而限制了蜂膠黃酮的臨床應(yīng)用。為了更好地開發(fā)利用蜂膠的藥理作用，對蜂膠新劑型的研究逐漸成為熱點。脂質(zhì)體是由類脂質(zhì)制備的具有復(fù)層或單層單位膜結(jié)構(gòu)的小囊，其結(jié)構(gòu)類似生物膜，在體內(nèi)能生物降解。由于脂質(zhì)體成份為磷脂和膽固醇，也是生物細胞膜的主要成分，屬機體內(nèi)源性物質(zhì)，具有良好的生物相容性和可降解性，無毒、無免疫原性。脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)和生物細胞相似，易被細胞吸附、融合、脂交換、內(nèi)吞而被細胞攝取；且具有一定的彈性和變形性，比相同粒徑的其他類型的納米粒容易進入病灶組織。因此，脂質(zhì)體已成為現(xiàn)代藥物載體研究的內(nèi)容之一。同時脂質(zhì)體還可用作免疫佐劑，早在1974年由Allison等首次報道脂質(zhì)體能增強機體的體液和細胞介導的免疫應(yīng)答，對疫苗的增效作用可達數(shù)十倍甚至更高。利用脂質(zhì)體具有靶向釋藥、緩釋、無免疫原性、降低藥物毒副作用等優(yōu)勢，將蜂膠黃酮包封于脂質(zhì)體中，脂質(zhì)體不僅可以防止 蜂膠黃酮被氧化，而且可以有效維持蜂膠黃酮在機體內(nèi)的有效濃度，提高了其生物利用度。因而脂質(zhì)體可以作為蜂膠黃酮的一種優(yōu)良載體。本發(fā)明首次采用乙醇注入法將蜂膠黃酮制備成蜂膠黃酮脂質(zhì)體(propolisflavone liposome, PFL),并將其和動物疫苗一起應(yīng)用，建立了蜂膠黃酮脂質(zhì)體的制備方法，優(yōu)化了制備條件，發(fā)現(xiàn)蜂膠黃酮脂質(zhì)體能顯著提高蜂膠黃酮的免疫增強作用，提高其生物利用度。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明針對蜂膠黃酮易氧化、水溶性低、不易被吸收、生物利用度低等問題，提供一種蜂膠黃酮脂質(zhì)體的制備方法，達到顯著提高蜂膠黃酮免疫增強作用目的，并應(yīng)用于畜禽臨床。技術(shù)方案用乙醇注入法及響應(yīng)面法設(shè)計蜂膠黃酮脂質(zhì)體的制備方法。經(jīng)優(yōu)化后蜂膠黃酮脂質(zhì)體最佳制備方法為:按一定比例稱取卵磷脂、膽固醇和蜂膠黃酮，溶于IOmL的無水乙醇中使其溶解。勻速注入到40°C緩沖液PBS 20mL(0.01mol/L)中，繼續(xù)恒溫攪拌，除去有機溶劑直至無乙醇味為止，水浴超聲20min,依次過0.80 μ m>0.45 μ μ m和0.22 μ m的微孔濾膜各1次，即得到蜂膠黃酮脂質(zhì)體。按此方法制備的蜂膠黃酮脂質(zhì)體，平均包封率為91.67%±0.21%。將蜂膠黃酮脂質(zhì)體和新城疫疫苗一起應(yīng)用于雞，能顯著提高雞血清新城疫抗體效價、淋巴細胞增殖和細胞因子含量，具有較好的免疫增強功能，對提高禽免疫功能，防治疾病具有重要應(yīng)用價值。有益效果動物疫病主要靠疫苗來預(yù)防，但是很多疫苗存在免疫原性較弱等缺點，需要免疫增強劑輔助才能產(chǎn)生強大的免疫應(yīng)答?，F(xiàn)有的常用免疫增強劑如油佐劑、鋁膠佐劑等常存在刺激性強、有殘留等缺點。由于中藥具有綠色安全的特點，從中藥中開發(fā)免疫增強劑已成為熱點。蜂膠黃酮是蜂膠中所含的主要有效成分之一,具有抗氧化、抗病原微生物、抗炎、抗感染、抗過敏、抗腫瘤和增強免疫功能等廣泛的生物學功能和藥理學作用。然而，黃酮類化合物的抗氧化作用主要是通過自身的優(yōu)先氧化來避免其它成分被氧化的，這就使得黃酮自身并不穩(wěn)定，而蜂膠黃酮的不穩(wěn)定性又在很大程度上影響著蜂膠提取物的儲藏、使用和其功效的發(fā)揮。而且蜂膠黃酮作為一種免疫增強劑直接用于獸醫(yī)臨床，存在著水溶性差、體內(nèi)代謝較快、作用時間較短、成分復(fù)雜，質(zhì)量控制有一定困難等不足之處，免疫增強作用相對較弱，從而限制了臨床應(yīng)用。利用脂質(zhì)體包封蜂膠黃酮，不僅可以防止蜂膠黃酮被氧化不穩(wěn)定，解決水溶性差等問題，而且可以有效維持蜂膠黃酮在機體內(nèi)的有效濃度，提高其生物利用度。本發(fā)明采用乙醇注入法和響應(yīng)面法將蜂膠黃酮制備成蜂膠黃酮脂質(zhì)體，所得脂質(zhì)體包封率高，不僅可以解決蜂膠黃酮成分易氧化、水溶性低，不易制劑等問題，而且便于藥物的吸收，可以使藥物緩慢地的釋放，有效地延長藥效，能顯著提高動物免疫功能，對抵抗疫病有重要意義。本發(fā)明作為一種新型中獸藥，沒有副作用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點如下:1.蜂膠黃酮脂質(zhì)體的制備國內(nèi)外未見報道，本發(fā)明提供了一種蜂膠黃酮脂質(zhì)體的制備方法及其優(yōu)化的條件，填補了國內(nèi)外研究的空白。2.蜂膠黃酮脂質(zhì)體的免疫增強活性未見報道。通過本發(fā)明的實施，證明蜂膠黃酮通過制備成蜂膠黃酮脂質(zhì)體后能夠顯著提高其免疫增強活性，表現(xiàn)為明顯提高抗體效價、淋巴細胞增殖、IgG和IgM含量、細胞因子IL-2、IFN-Y的含量，與蜂膠黃酮比，在免疫中后期效果更好，具有較強的緩釋作用，從而增強動物免疫功能。因此，蜂膠黃酮脂質(zhì)體可以作為研制新型免疫增強劑的材料，為研制新型免疫增強劑提供了材料和示范。
具體實施例方式1.蜂膠黃酮脂質(zhì)體的制備采用乙醇注入法制備蜂膠黃酮脂質(zhì)體。按一定比例稱取卵磷脂、膽固醇和蜂膠黃酮，溶于IOmL的無水乙醇中使其溶解。勻速注入到40°C緩沖液PBS 20mL(0.0ImoI/L)中，繼續(xù)恒溫攪拌，除去有機溶劑直至無乙醇味為止，水浴超聲20min,依次過0.80 μ m、0.45 μ m和0.22 μ m的微孔濾膜各I次，即得到蜂膠黃酮脂質(zhì)體。在單一因素考察的基礎(chǔ)上，確定影響蜂膠黃酮脂質(zhì)體包封率的3個主要影響因素，即脂藥比(A)、膜材比(B)、注入速度(C)3個因素，以此3個因素為自變量，每個因素又選擇3個水平，以脂質(zhì)體包封率為響應(yīng)值，做3因素3水平共17個試驗點(5個中心點)二次回歸正交組合試驗。試驗設(shè)計及結(jié)果見表I。對表I中試驗結(jié)果進行響應(yīng)面分析，經(jīng)過二次回歸擬合后，得到蜂膠黃酮脂質(zhì)體的包封率對脂藥比(A)、膜材比(B)、注入速度(C)的二次多項回歸方程為:Y =91.30-0.91A+2.21B-0.029C-0.64AB-2.36AC+0.36BC-7.32A2-4.87B2_7.57C2。表I Box-Behnken試驗設(shè)計表及結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種蜂膠黃酮脂質(zhì)體的制備方法，采用乙醇注入法及響應(yīng)面法設(shè)計優(yōu)化制備蜂膠黃酮脂質(zhì)體。
(1)采用乙醇注入法制備蜂膠黃酮脂質(zhì)體。
按一定比例稱取卵磷脂、膽固醇和蜂膠黃酮，溶于IOmL的無水乙醇中使其溶解。勻速注入到40°C緩沖液PBS 20mL(0.0ImoI/L)中，繼續(xù)恒溫攪拌，除去有機溶劑直至無乙醇味為止，水浴超聲20min，依次過0.80 μ m、0.45 μ m和0.22 μ m的微孔濾膜各I次，即得蜂膠黃酮脂質(zhì)體。
(2)通過響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化出按照上述方法制備蜂膠黃酮脂質(zhì)體的最佳條件為:脂藥比9.6: 1、膜材比 8.5: 1、注入速度 0.8mL.mirT1。
(3)在最佳條件下制備的蜂膠黃酮脂質(zhì)體的包封率高，包封率平均值為91.67%±0.21%。
2.權(quán)利要求1所述方法獲得的蜂膠黃酮脂質(zhì)體能夠顯著提高雞的抗體效價、淋巴細胞增殖和細胞因子 含量，具有較好的免疫增強功能。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高畜禽免疫功能的蜂膠黃酮脂質(zhì)體及其制備方法，屬于中獸藥制備技術(shù)及免疫應(yīng)用領(lǐng)域。用乙醇注入法制備蜂膠黃酮脂質(zhì)體，以包封率為指標，采用響應(yīng)面法研究了脂藥比、膜材比和注入速度3個因素并對其進行優(yōu)選，確定最佳制備條件為脂藥比9.6∶1、膜材比8.5∶1、注入速度0.8mL·min-1，所得蜂膠黃酮脂質(zhì)體的包封率高，免疫增強活性強。本發(fā)明蜂膠黃酮脂質(zhì)體顯著提高了蜂膠黃酮的免疫增強活性。
文檔編號A61K9/127GK103191157SQ201210203668
公開日2013年7月10日 申請日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者王德云, 袁菊, 胡元亮, 劉家國, 范云鵬, 趙曉娟, 黃葉娥 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學