專利名稱：J亞群禽白血病病毒的肽核酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種J亞群禽白血病病毒的肽核酸及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
禽白血病是由禽白血病病毒(avian lekosis virus, ALV)引起的以造血細胞惡性增生為主的一類傳染病,包括淋巴細胞性白血病,成紅細胞性白血病,成髓細胞白血病和髓細胞樣白血病，對養(yǎng)禽業(yè)危害最大的是禽淋巴細胞性白血病(lymphoid leukosis, LL)。根據(jù)病毒囊膜特性、病毒中和實驗、宿 主范圍和基因組的分子生物學(xué)特性，現(xiàn)已將該病毒分類成10個亞群A J亞群，其包括了除網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒以外引起禽類腫瘤性疾病的所有逆轉(zhuǎn)錄病毒。其中A、B、C、D為外源性病毒，E、F、G、H、I為內(nèi)源性病毒。A、B亞群是商業(yè)蛋雞(來航雞)最為常見的外源性病毒亞群，而C、D亞群感染率極低，幾乎很難檢測到；E亞群包括普遍存在的低致病性和無致病性的內(nèi)源性病毒。J亞群于1988年，由Payne等同事首次從商品代肉用雞中分離得到，J亞群是一外源性白血病病毒，其與內(nèi)源性E亞群的重組體，可以通過水平和垂直傳播在雞群中廣泛散播，所有肉用型品系的雞對ALV-J都易感，但感染雞的腫瘤發(fā)病率卻有顯著差異，蛋雞雖可感染ALV-J，但自然感染時很少引起腫瘤；隨著養(yǎng)雞生產(chǎn)規(guī)模的不斷增大，疑似淋巴性白血病J亞群(ALV — J)的發(fā)生更為廣泛，使發(fā)病雞群死淘率高，給養(yǎng)雞生產(chǎn)場帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。該病1998年在世界范圍內(nèi)暴發(fā)，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了沉重打擊。1999年，杜巖等在國內(nèi)首次從商品代肉雞中分離并檢測到ALV-J病毒。2000年以后，J亞群白血病在我國雞群中全面暴發(fā)，并呈現(xiàn)出宿主范圍擴展，其垂直和水平傳播引起臨床和亞臨床感染而造成較大的經(jīng)濟損失。禽白血病導(dǎo)致的經(jīng)濟損失主要有兩個方面。一是引起腫瘤，導(dǎo)致雞的死亡。二是產(chǎn)生非腫瘤性疾病，造成免疫抑制造成的亞臨床感染，表現(xiàn)為雞的消瘦和貧血，耐受性病毒血癥，免疫抑制等，由此嚴(yán)重影響?zhàn)B雞生產(chǎn)。ALV-J感染可造成雞多重感染，在個體病雞中可同時檢出幾種不同的病毒，如網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒(REV)、傳染性法氏囊病毒、雞傳染性貧血病毒等。在實際生產(chǎn)過程中，人們通常只關(guān)注腫瘤形成對生產(chǎn)的影響，往往忽略其亞臨床感染。免疫抑制可包括淋巴器官萎縮或發(fā)育不全、高血癥丙球蛋白增多、促有絲分裂劑誘導(dǎo)的胚細胞形成減少以及抗體應(yīng)答降低。因此，ALV對養(yǎng)禽業(yè)造成的損失主要是由于其前期非腫瘤性疾病(免疫抑制)引發(fā)的，而后期由于腫瘤造成的死亡只是免疫抑制從量變到質(zhì)變的一個表面現(xiàn)象。病雞臨床癥狀主要表現(xiàn)為食欲不振，進行性消瘦；羽毛異常，患病雞精神狀態(tài)差；部分雞的腹部脹大，可觸摸到腫大的肝臟；雞冠及肉髯蒼白，有些雞冠萎縮；有的頭部、背部、胸部、腿部及翅膀可見I 3 Cm大小的血皰，呈褐紫色，質(zhì)地柔軟，有一定的彈性，與周圍皮膚界限清楚，血皰破裂后流血不止，血皰周邊的羽毛被大片血跡污染。免疫抑制是指由于受到各種因素(如營養(yǎng)、疾病、應(yīng)激等)的影響，使得機體對抗原應(yīng)答能力低下甚至缺失的現(xiàn)象。其中由病毒引起的免疫抑制尤為嚴(yán)重從而形成免疫抑制。ALV-J引起成年肉雞骨髓細胞瘤，導(dǎo)致很高的死亡率，還能使繁殖力下降(由于影響種公雞的發(fā)育)。由于種母雞的死亡和繁殖力下降，使得孵化用蛋減少，造成肉雞飼養(yǎng)業(yè)的嚴(yán)重損失。ALV除了可引起原發(fā)感染引起雞的死亡，更重要的是損害免疫器官，如對雞胸腺、法氏囊等主要免疫器官可造成嚴(yán)重損傷，使免疫器官功能降低，使得機體的抗病力下降，最終導(dǎo)致并發(fā)癥和繼發(fā)感染。另外，ALV-J造成免疫抑制的解除很困難，使雞群對疫苗免疫不產(chǎn)生應(yīng)答或應(yīng)答能力下降，造成免疫失敗，引起烈性傳染病暴發(fā)。病毒粒子直徑80 100 nm，由外部的囊膜和內(nèi)部的電子致密的核衣殼構(gòu)成，核心結(jié)構(gòu)由二倍體RNA和核衣殼、反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶組成，呈正二十面體。病毒囊膜上有放射狀突起，直徑約為8 nm。ALV基因組全長約7. 2 kb，可直接作為mRNA。ALV結(jié)構(gòu)基因從5’端至3’端順序為gag-pol-env,分別編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白、RNA依賴的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)和囊膜糖蛋白。gag基因編碼病毒內(nèi)部非糖基化結(jié)構(gòu)蛋白，包括基質(zhì)蛋白、蛋白酶、衣殼和核衣殼。在ALV亞群間，這些病毒蛋白十分保守，具有高度的同源性，即所謂的群特異性抗原或GSA。pol基因編碼病毒的反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶，以完成作為細胞基因信息表達前的病毒至前病毒以及前病毒DNA整合進細胞染色體的過程。env基因編碼病 毒囊膜糖基化蛋白。包括膜表面糖蛋白亞單位(SU) gp85和跨膜糖蛋白亞單位(TM) gp37。SU是由gp85基因編碼的，它含有病毒一受體決定簇，決定禽白血病的亞群特異性；TM負責(zé)將病毒轉(zhuǎn)入細胞。結(jié)構(gòu)基因兩側(cè)的長末端序列(long terminal repeats, LTR ),與病毒RNA的復(fù)制和翻譯有關(guān)。急性轉(zhuǎn)化型ALV還帶有病毒性腫瘤基因(^oncogene)。該病毒含有5種結(jié)構(gòu)蛋白即病毒群特異性抗原衣殼蛋白P27，病毒基膜蛋白P19，參與RNA加工與包裝的核衣殼蛋白P12，參與蛋白前體剪切的天冬氨酸酶P15，功能不詳?shù)腜10。內(nèi)源性病毒RAV-O株中存在P27的變異體即P27°。反義核酸(antisense nucleic acid)是一段與祀基因(mRNA或DNA)的某段序列互補的天然存在或人工合成的核苷酸序列，反義核酸通過堿基配對方式特異性的與病毒靶基因結(jié)合形成雜交分子，從而在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)靶基因的表達，或誘導(dǎo)RNase H識別并切割mRNA，進而使其功能喪失。反義核酸包括反義RNA (antisense RNA)和反義DNA (antisense DNA),具有合成方便、序列設(shè)計簡單、容易修飾、選擇性高、親和力強等特點。反義核酸作為一種新的抗病毒、抗腫瘤藥物，掀起了一場藥理學(xué)領(lǐng)域的革命，即新的藥物受體mRNA通過新受體結(jié)合方式(Watson-Crick雜交)、引發(fā)新的藥物受體結(jié)合后反應(yīng)(I) RNase H介導(dǎo)的祀RNA的降解；(2)抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的加工和翻譯等?？梢哉f反義寡核苷酸(ODNs)療法比傳統(tǒng)的藥物治療手段有更高的特異性。從二十世紀(jì)70年代末到現(xiàn)在，在這三十年的時間中，反義核酸藥物已走出實驗室，進入了實際臨床應(yīng)用。特別是第一個反義核酸藥物Fomivirsen通過FDA批準(zhǔn)上市后,人們對反義療法尤為關(guān)注。反義核酸作用原理基于堿基配對原則，可通過與靶RNA進行堿基配對結(jié)合的方式參與對相關(guān)基因表達的調(diào)控。其作用方式可能有①反義RNA與病毒mRNA結(jié)合形成互補雙鏈阻斷核糖體與病毒mRNA的結(jié)合，從而抑制了病毒mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的過程。②反義DNA能與祀基因形成一種三鏈核酸(triple helix nucleic acid),它通過作用于控制基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄子、增強子和啟動子區(qū)，對基因的轉(zhuǎn)錄進行調(diào)控。③反義核酸與病毒mRNA的結(jié)合可阻擋mRNA向細胞質(zhì)的運輸。④反義核酸與病毒mRNA結(jié)合后使得mRNA更加易被核酸酶識別降解，從而大大縮短mRNA的半衰期。上述四種作用途徑都可表現(xiàn)為對病毒基因表達的抑制或調(diào)控，且這種調(diào)控是高度特異性的。反義核酸是通過堿基互補配對的原理來識別所打靶的基因，從理論來分析，研究人員以動物細胞為例，其染色體大約有幾十億對堿基，如果4個堿基(A、G、C和T)的數(shù)目大致相同，并在整個基因中隨機分布，那么按照統(tǒng)計學(xué)原理，大于17個堿基的反義核酸與非靶基因雜交的可能性不大，所以長度超過17個堿基的反義核酸分子與靶基因的結(jié)合可以說是唯一的，從而使反義核酸具有高度的特異性。研究表明，在細胞內(nèi)部一個拷貝的基因會產(chǎn)生200-300條mRNA，翻譯出10萬個具有生物活性的蛋白質(zhì)分子。傳統(tǒng)藥物主要作用于有生物功能的蛋白分子的某結(jié)構(gòu)域上的幾個作用位點，事實上蛋白的結(jié)構(gòu)是非常復(fù)雜的，且在生物體內(nèi)，活性蛋白的空間結(jié)構(gòu)又是千
變?nèi)f化的，以傳統(tǒng)藥物有限的幾種作用位點來控制靶分子的動態(tài)的和整體的功能很難達到理想的效果，因而不難看出傳統(tǒng)藥物的局限性。由mRNA可翻譯出幾十到幾百個蛋白，反義核酸在mRNA水平對靶基因直接進行調(diào)控，這個步驟相當(dāng)于將傳統(tǒng)藥物作用放大了數(shù)十到數(shù)百倍，可見反義核酸的調(diào)控是極其經(jīng)濟合理的。毒理學(xué)研究表明，反義核酸在體內(nèi)具有很低的毒性，盡管其在生物體內(nèi)的存留時間有長有短，但最終都將被降解消除，這避免了如轉(zhuǎn)基因療法中外源基因整合到宿主染色體上的危險性。與傳統(tǒng)藥物相比，反義核酸藥物具有特異性強，效率高和毒副作用低等優(yōu)點，在抑制腫瘤生長和抗病毒復(fù)制等方面顯現(xiàn)出了良好的應(yīng)用價值。目前已有多個藥物進入美國和歐洲市場，另還有30多種反義核酸藥物正在進行臨床前期的研究或開發(fā)后進入了 I、II和III期實驗。由于動物體內(nèi)存在大量的核酸外切酶，反義核酸若不經(jīng)過化學(xué)修飾，很快就被降解，失去活性。目前對反義核酸的化學(xué)修飾有很多方法，常見的有硫代修飾反義核酸及2’-甲氧基修飾反義核酸等。且目前硫代修飾藥物的研究最為全面，它可有效抵抗核酸酶的降解，同時可促進核酸酶Rase H的活性，目前這種修飾方法已成功用于臨床的反義核酸藥物。但這些還只是第一代反義核酸的修飾方法，隨著技術(shù)的發(fā)展與進步，新的修飾途徑與方法被開發(fā)出來，使得反義核酸的研究進入了第二、三代，其中肽核酸的修飾最為引人關(guān)注。肽核酸(peptidenucleic acids, PNAs),是一種以中性酰胺鍵為骨架的全新的DNA類似物，可序列特異的靶向作用于DNA的大溝槽，其骨架的結(jié)構(gòu)單元為N(2-氨基乙基)-甘氨酸，堿基部分通過亞甲基羰基連接于主骨架的氨基N上。為反義核酸的第二代產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種
本發(fā)明所提供的肽核酸，選自如下任一種或任幾種肽核酸
a)其核酸序列為序列表中的序列I 5， - AGACUAAGGCAAAAAUC腳U-3，；
b)其核酸序列為序列表中的序列2 5， - ACGACUUAUUGAAAAACUCUC-3，；
c)其核酸序列為序列表中的序列3 5，- UAUAACC⑶CU⑶A⑶UGGAC-3，；d)其核酸序列為序列表中的序列4 5， - ACAUAUUUGAUUAUCUCUCCU-3，。其中，所述肽核酸可以為經(jīng)殼聚糖修飾的肽核酸。本發(fā)明的肽核酸用于制備抗J亞群禽白血病病毒的藥物。本發(fā)明的肽核酸制劑，其活性成分為所述的肽核酸。其中，所述制劑為結(jié)腸溶控釋微囊制劑、注射用凍干制劑或口服用水溶性顆粒劑。
本發(fā)明的肽核酸制劑還含有可藥用載體或賦形劑。本發(fā)明的肽核酸制劑的穩(wěn)定性分析
高溫流通蒸汽高溫105°C，20分鐘滅菌不影響其生物活性。極端溫度50°C存放6個月不影響其生物活性。室溫存放24個月不影響其生物活性。低溫-20°C存放48個月不影響其生物活性。本發(fā)明的肽核酸無毒副作用，無耐藥性，能特異性直接抑制ALV-J復(fù)制，抗病毒效果好，無藥殘等食品安全問題。
具體實施例方式J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒(aivan leukosis subgroup J, ALV-J )引起的一種主要發(fā)生于雞的傳染病，其主要引起雞的造血細胞惡性增生，該病近年來在我國雞群中病毒陽性率呈快速上升趨勢，并呈現(xiàn)出宿主范圍擴展，其垂直和水平傳播引起臨床和亞臨床感染而造成較大的經(jīng)濟損失。到目前為止，對該病尚無有效的防控措施，開發(fā)預(yù)防和治療ALV-J感染的新技術(shù)顯得尤為迫切，另ALV-J侵害雞的免疫系統(tǒng)，使感染后雞群的免疫力低下，引發(fā)免疫抑制，一旦感染容易繼發(fā)其它傳染病。到目前為止，尚未成功開發(fā)出可以預(yù)防該病的有效疫苗，本發(fā)明率先將肽核酸技術(shù)與反義核酸技術(shù)結(jié)合起來，并應(yīng)用于預(yù)防和治療ALV-J病毒感染引發(fā)的相關(guān)疾病。為此，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案
ALV-J毒株NS-X11株，來自楠森獸醫(yī)診斷技術(shù)研究中心實驗室。CEF細胞常規(guī)方法制備的雞胚成纖維細胞(CEF)。DF-I細胞來自楠森獸醫(yī)診斷技術(shù)研究中心實驗室。 針對抗ALV-J的肽核酸體外抗病毒效果分析
從GenBank數(shù)據(jù)庫檢索出ALV-J的基因組，用生物學(xué)軟件進行序列分析，綜合考慮序列的保守性，G+C%含量，堿基分布特點，然后從中挑選出合適的區(qū)域設(shè)計反義核酸，最后所確定的針對病毒的gp85和P27基因的反義核酸序列如下。 gp85
gp85-l :5，- AGACUAAGGCAAAAAUCUGUU-3，；gp85-2 :5， _ UAAAUCGGUGUUGUUAUCGCA-3，；gp85-3 :5， - ACGACUUAUUGAAAAACUCUC-3，；
P27
P27-1 :5，- AUAACUCUCAUUAGAUUCGUA-3，；
P 27-2 :5， - UAUAACCGUCUGUAGUUGGAC-3，；P27-3 :5， - ACAUAUUUGAUUAUCUCUCCU-3，。人工合成如下肽核酸，肽核酸的序列如下 gp85
gp85-l :5，- AGACUAAGGCAAAAAUCUGUU-3，；gp85-2 :5， _ UAAAUCGGUGUUGUUAUCGCA-3，；gp85-3 :5， - ACGACUUAUUGAAAAACUCUC-3，；
P27
P27-1 :5，- AUAACUCUCAUUAGAUUCGUA-3，；
P 27-2 :5， - UAUAACCGUCUGUAGUUGGAC-3，；
P27-3 :5， - ACAUAUUUGAUUAUCUCUCCU-3，。殼聚糖-肽核酸以殼聚糖修飾肽核酸，修飾方法為本領(lǐng)域中已知的多種方法具體如下述文獻
Luessen H Lj de Ieeuw B Jj Lang emeyer Mj et al . Mucoadhesive polymers inperoral peptide drug delivery. 0 . carbomer and chitosan impro ve t he abso rption of the pept ide drug buser elin in vivo [ J] . Pha rm Res, 1996，13 ( 11) : I668- I 172.
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釆用ALV-J病毒特異性定量RT-PCR檢測肽核酸對病毒靶基因的抑制程度，同時運用病毒毒價測定實驗檢測抗病毒的滴度。Day I:
鋪板消化前期準(zhǔn)備的DF-I細胞，離心收集，細胞計數(shù)，用完全培養(yǎng)基(DMEM+5%胎牛血清+青鏈霉素)將細胞濃度調(diào)到3 6X IO5個/ml，鋪24孔板，于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)18-24小時。Day 2:
顯微鏡觀察細胞的密度，待細胞長滿孔板面積的7(Γ80%時，且細胞狀態(tài)良好。吸去培養(yǎng)液，每孔加入300μ1待篩選藥物(即肽核酸)，每個藥物10個孔。溫育I小時后，加入ΙΟΟμΙALV-J (感染比為O. 01)，吸附2小時后，用營養(yǎng)液洗去未吸附的病毒后，再加入含4%FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37°C和5%C02環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，感染后定時觀察細胞病變。感染后72h，將感染細胞進行反復(fù)凍融以釋放病毒，以此為樣本進行病毒檢測。實驗過程中還設(shè)不加病毒和肽核酸的正常細胞對照組，加病毒、不加肽核酸陽性對照組和加肽核酸藥物、不加病毒的陰性對照組。Day 3~5:
觀察藥物對細胞的保護效應(yīng)，并對結(jié)果進行評判。Real-time PCR 定量檢測
收集上述各處理組中的上清液，用病毒總RNA提取試劑盒提取病毒RNA。對獲得的病毒RNA首先進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后運用針對的引物分別檢測ALV-J處理組中的病毒含量。定量擴增后的結(jié)果，運用統(tǒng)計學(xué)軟件計算出各處理組中病毒滴度，抑制效果以PNA組與空白對照組差異的倍數(shù)。本發(fā)明參考Huang等提供的引物，采用real-time PCR定量檢測ALV-J。ALV-J特異性檢測引物
引物 I: 5’ - TCAGGACCAAGGGCTTAC -3’ ；
引物 2: 5，- CTGCCGCTATAACCGTCTG -3，。
β -actin為內(nèi)參
Actin-F 5’ - TCCCTGTATGCCTCTGGTC -3’ ；
Actin-R 5，- TCTCTCTCGGCTGTGGTGG -3，。
反應(yīng)體系(25 μ I)
權(quán)利要求
1.一種肽核酸，選自如下任一種或任幾種肽核酸 a)其核酸序列為序列表中的序列I 5， - AGACUAAGGCAAAAAUC腳U-3，； b)其核酸序列為序列表中的序列2 5， - ACGACUUAUUGAAAAACUCUC-3，； c)其核酸序列為序列表中的序列3 5，- UAUAACC⑶CU⑶A⑶UGGAC-3，； d)其核酸序列為序列表中的序列4 5， - ACAUAUUUGAUUAUCUCUCCU-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的肽核酸，其特征在于，所述肽核酸為經(jīng)殼聚糖修飾的肽核酸。
3.權(quán)利要求I或2所述的肽核酸在制備用于抗J亞群禽白血病病毒的藥物中的應(yīng)用。
4.一種肽核酸制劑，其活性成分為權(quán)利要求1-2中任一所述的肽核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的肽核酸制劑，其特征在于，所述制劑為結(jié)腸溶控釋微囊制劑、注射用凍干制劑或口服用水溶性顆粒劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的肽核酸制劑，其特征在于，還含有可藥用載體或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種J亞群禽白血病病毒的肽核酸及其應(yīng)用。該肽核酸選自如下任一種或任幾種肽核酸a)其核酸序列為序列表中的序列1；b)其核酸序列為序列表中的序列2；c)其核酸序列為序列表中的序列3；d)其核酸序列為序列表中的序列4。本發(fā)明的肽核酸無毒副作用，無耐藥性，能特異性直接抑制ALV-J復(fù)制，抗病毒效果好，無藥殘等食品安全問題。
文檔編號A61P31/14GK102876675SQ20121020506
公開日2013年1月16日 申請日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者韓健寶, 徐步, 范建華 申請人:韓健寶