一種抗皮膚光老化制劑及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本申請(qǐng)公開了一種含有王漿酸（10-HDA）的抗皮膚光老化制劑，同時(shí)，還公開了10-HDA在制備護(hù)膚品、化妝品和藥妝品中的應(yīng)用。本申請(qǐng)?zhí)峁┑目构饫匣苿?，能夠明顯提高UVA照射后的細(xì)胞的活性，抑制UVA誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS，抑制UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老，具有顯著的抗光老化的作用。其作用機(jī)制的研究顯示，本申請(qǐng)抗光老化制劑中含有的10-HDA能夠抑制p-JNK和p38?MAPK信號(hào)通路的活化，減少UVA誘導(dǎo)的MMP-1和MMP-3的表達(dá)，從而增加細(xì)胞中的膠原蛋白含量，是一種有效的抗皮膚光老化的制劑。
【專利說(shuō)明】一種抗皮膚光老化制劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請(qǐng)涉及抗皮膚衰老制劑領(lǐng)域,特別是涉及王衆(zhòng)酸在抗皮膚光老化制劑,如抗光老化護(hù)膚品、化妝品、藥妝品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】[0002]皮膚老化主要包括內(nèi)源性老化和外源性老化。外源性老化是指皮膚受環(huán)境因素影響而引起的衰老變化，因以紫外線(Ultraviolet, UV)福射的影響為主，故又稱為光老化。長(zhǎng)波紫外線(UVA)和中波紫外線(UVB)均可造成光老化。由于UVB對(duì)皮膚的灼傷作用較UVA強(qiáng)1000倍，長(zhǎng)期以來(lái)UVB—直被認(rèn)為是導(dǎo)致光老化的主要光譜。然而，最近的研究表明UVA才是引起皮膚光老化的主要光譜。
[0003]皮膚光老化的主要臨床表現(xiàn)是皮膚皺紋、粗糙、干燥、松弛、毛細(xì)血管擴(kuò)張、脆性增加和色素沉著。長(zhǎng)期日光照射可影響皮膚的多種細(xì)胞成分和組織結(jié)構(gòu)改變，其中最具特征性的變化是真皮細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變。真皮細(xì)胞外基質(zhì)包括膠原纖維、彈力纖維、氨基多糖和蛋白多糖等，其中I型膠原蛋白是其主要結(jié)構(gòu)蛋白。在光老化皮膚，I型與III型膠原纖維減少、紊亂，彈性纖維變性、變粗，聚集成塊，氨基多糖裂解，導(dǎo)致皮膚松弛、皺紋的發(fā)生。
[0004]皮膚光老化的發(fā)生機(jī)制尚未完全明了，但是基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinases,MMPs)表達(dá)增高或活性增強(qiáng)是膠原纖維等基質(zhì)成分降解的重要機(jī)制。MMPs是一組含鋅蛋白酶家族，由MMP-1、MMP-2、MMP-3等25名成員組成。根據(jù)其底物特異性以及它們分泌后是可溶性蛋白還是細(xì)胞膜結(jié)合蛋白將其分為膠原酶類、明膠酶類、基質(zhì)溶素和膜型MMPs。在正常人體皮膚表達(dá)的19種MMPs中，只有三種對(duì)UV照射做出反應(yīng)而被顯著誘導(dǎo)，即MMP-1、MMP_3和MMP-9。UV照射24小時(shí)后，MMP-1和MMP-3 mRNA水平顯著增高，而MMP-9 mRNA水平僅有適度增高。
[0005]UV照射誘導(dǎo)的MMPs在皮膚光老化真皮細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。紫外線照射皮膚后可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌多種基質(zhì)金屬蛋白酶酶原，并通過(guò)調(diào)節(jié)酶原的活化及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的表達(dá)使其轉(zhuǎn)化成有活性的MMPs。活化的MMPs可以降解幾乎所有的真皮細(xì)胞外基質(zhì)成分，引起皮膚松弛、皺紋形成等皮膚光老化改變。
[0006]不同類型的MMP降解不同的真皮基質(zhì)蛋白。例如，MMP-1降解1、11和III型膠原蛋白，MMP-9降解IV、V膠原蛋白和明膠，而MMP-3則有更廣泛的底物特異性，它可以降解多種類型的膠原蛋白以及基質(zhì)分子，如蛋白多糖、層粘連蛋白和纖維連接蛋白。對(duì)于膠原蛋白，尤其是I型和III型膠原蛋白，首先由MMP-1啟動(dòng)膠原纖維斷裂，然后被升高的MMP-3和MMP-9進(jìn)一步降解。因此，長(zhǎng)期的UV照射會(huì)導(dǎo)致MMPs產(chǎn)生過(guò)量，繼而降解膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，引起皮膚松弛、皺紋形成等皮膚光老化改變。
[0007]在人皮膚，UV可誘導(dǎo)表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮的成纖維細(xì)胞表達(dá)MMPs，其中角質(zhì)形成細(xì)胞是MMPs的主要細(xì)胞來(lái)源。UV照射誘導(dǎo)MMPs基因表達(dá)涉及復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)通路，其中最重要的就是MAPK和NF- K B信號(hào)通路，前者與轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活化有關(guān)，后者與轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B的活化有關(guān)?；罨腁P-1和NF-κ B可分別與多種MMPs啟動(dòng)子的AP-1和NF- K B位點(diǎn)結(jié)合而誘導(dǎo)MMPs的表達(dá)。已經(jīng)證實(shí)，UV激活的AP-1刺激角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞MMP-1和MMP-3的轉(zhuǎn)錄。由于MMP-1和MMP-3兩者啟動(dòng)子具有相似的結(jié)構(gòu)，UVB照射后活化的AP-1分別與MMP-1和MMP-3啟動(dòng)子的AP-1位點(diǎn)結(jié)合導(dǎo)致MMP-1和MMP-3的轉(zhuǎn)錄。UV照射引起的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生被認(rèn)為是激活上述兩條信號(hào)通路的一個(gè)始動(dòng)環(huán)節(jié)。[0008]綜上所述，UV照射可通過(guò)激活復(fù)雜的信號(hào)通路誘導(dǎo)MMPs的活化，進(jìn)而降解真皮細(xì)胞外基質(zhì)成分導(dǎo)致皮膚光老化，因此阻斷這些信號(hào)通路的始動(dòng)環(huán)節(jié)或者關(guān)鍵環(huán)節(jié)便能抑制MMPs活化達(dá)到抗光老化的作用。近年來(lái)，MMPs被認(rèn)為是一個(gè)有前景的抗光老化治療靶點(diǎn)。研發(fā)有效的MMPs抑制劑已經(jīng)成為一個(gè)重要的研究熱點(diǎn)。到目前為止，已經(jīng)有大量來(lái)自于天然生物的MMPs抑制劑被研究開發(fā)。它們分別以R0S、MAPK通路、NF- κ B通路或多個(gè)環(huán)節(jié)為靶點(diǎn)達(dá)到抗光老化的作用。以ROS為靶點(diǎn)的MMPs抑制劑如白絨水龍骨葉提取物、葉黃素、小珊瑚藻等。這些物質(zhì)可通過(guò)清除ROS而抑制MMPs的表達(dá)。以MAPK通路為靶點(diǎn)的MMPs抑制劑如巖藻依聚糖、反式玉米素等可通過(guò)阻斷UV介導(dǎo)的MAPK通路以抑制MMPs的表達(dá)。以NF- κ B通路為靶點(diǎn)的MMPs抑制劑如蟲草素、木蘭醇等可通過(guò)抑制UV介導(dǎo)的NF- κ B通路抑制MMPs的表達(dá)。
[0009]王衆(zhòng)酸(化學(xué)名:10_羥基 _2_ 癸烯酸，10-hydroxy-2-decenoic acid, 10-HDA)是工蜂的舌腺、上顎腺等腺體分泌的一種天然物質(zhì)，是蜂王漿中特有的一種不飽和脂肪酸。由德國(guó)科學(xué)家D.J.郎格在1921年首次發(fā)現(xiàn)。自那以后，關(guān)于王漿酸的研究被陸續(xù)報(bào)道，揭示王漿酸具有醫(yī)療保健效果，在急性輻射損傷方面具有顯著療效。但是，抗急性輻射和抗光老化是完全不同的概念，兩者的作用機(jī)制也完全不同，因此，目前在王漿酸的抗光老化方面尚未有相關(guān)的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本申請(qǐng)的目的是提供一種新的抗皮膚光老化制劑，以及10-HDA在制備抗光老化護(hù)膚品、抗光老化化妝品、抗光老化藥妝品中的應(yīng)用。
[0011]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請(qǐng)采用了以下技術(shù)方案:
[0012]本申請(qǐng)公開了一種抗皮膚光老化制劑，其抗光老化的主要活性物質(zhì)包括王漿酸。需要說(shuō)明的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，該抗皮膚光老化制劑中還含有其它藥學(xué)上可以接受的載體、溶劑，或者還可含有護(hù)膚、美膚的常用添加劑等。
[0013]進(jìn)一步的，上述抗光老化制劑中10-HDA的含量為0.5-1.5mmol/L。
[0014]本申請(qǐng)還公開了上述抗皮膚光老化制劑在抗光老化護(hù)膚品、抗光老化化妝品或抗光老化藥妝品中的應(yīng)用。
[0015]具體的，本申請(qǐng)公開了一種抗光老化護(hù)膚品，其抗光老化的主要活性物質(zhì)包括王漿酸。
[0016]進(jìn)一步的，上述護(hù)膚品中王漿酸的含量為0.5-1.5mmol/L。
[0017]具體的，本申請(qǐng)還公開了一種抗光老化化妝品，其抗光老化的主要活性物質(zhì)包括
王漿酸。[0018]進(jìn)一步的，上述化妝品中王漿酸的含量為0.5-1.5mmol/L。
[0019]具體的，本申請(qǐng)還公開了一種抗光老化藥妝品，其抗光老化的主要活性物質(zhì)包括
王漿酸。
[0020]進(jìn)一步的，上述藥妝品中王漿酸的含量為0.5-1.5mmol/L。
[0021]由于采用以上技術(shù)方案，本申請(qǐng)的有益效果在于:
[0022]本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N新的抗光老化制劑，其中含有10-HDA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10-HDA可明顯提高UVA照射后的細(xì)胞的活性，抑制UVA誘導(dǎo)產(chǎn)生R0S，抑制UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老，具有顯著的抗光老化的作用。研究顯示，本申請(qǐng)的抗光老化制劑中含有的10-HDA能夠抑制P-JNK和p38 MAPK信號(hào)通路的活化，減少UVA誘導(dǎo)的MMP-1和MMP-3的表達(dá)，從而增加細(xì)胞中的膠原蛋白含量，是一種有效的抗皮膚光老化的制劑。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1是本申請(qǐng)實(shí)施例中王漿酸對(duì)經(jīng)過(guò)UVA照射后的細(xì)胞的活力測(cè)定結(jié)果；
[0024]圖2是本申請(qǐng)實(shí)施例中王漿酸對(duì)活性氧的影響結(jié)果；
[0025]圖3是本申請(qǐng)實(shí)施例中王漿酸的抗光老化效果檢測(cè)；
[0026]圖4是本申請(qǐng)實(shí)施例中王漿酸對(duì)膠原蛋白的影響結(jié)果；
[0027]圖5是本申請(qǐng)實(shí)施例中 熒光定量PCR檢測(cè)的王漿酸對(duì)MMP-1的mRNA表達(dá)的影響
結(jié)果;
[0028]圖6是本申請(qǐng)實(shí)施例中熒光定量PCR檢測(cè)的王漿酸對(duì)MMP-3的mRNA表達(dá)的影響
結(jié)果;
[0029]圖7是本申請(qǐng)實(shí)施例中蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)的王漿酸對(duì)MMP-1蛋白的影響結(jié)果；
[0030]圖8是本申請(qǐng)實(shí)施例中蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)的王漿酸對(duì)MMP-3蛋白的影響結(jié)果；
[0031]圖9是本申請(qǐng)實(shí)施例中蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)的王漿酸對(duì)JNK蛋白的影響結(jié)果；
[0032]圖10是本申請(qǐng)實(shí)施例中蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)的王漿酸對(duì)p38蛋白的影響結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0033]本申請(qǐng)的發(fā)明人通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 10-HDA能夠抑制UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性以及ROS的產(chǎn)生、抑制UVA誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞衰老、抑制p-JNK和p38MAPK信號(hào)通路的活化、減少UVA誘導(dǎo)的MMP-1和MMP-3的表達(dá)，增加細(xì)胞上清液中的膠原蛋白含量。
[0034]在上述研究的基礎(chǔ)上，本申請(qǐng)的發(fā)明人提供了一種含有10-HDA的新的抗皮膚光老化制劑。該抗皮膚光老化制劑將10-HDA添加到醫(yī)學(xué)上可接受的溶劑載體(如液體石蠟等)中制備而成，以用于皮膚的抗光老化。
[0035]進(jìn)一步的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，鑒于10-HDA的抗光老化作用，能夠很容易的將10-HDA或上述的抗皮膚光老化制劑添加到護(hù)膚品、藥妝品或其它化妝品中，以制備出含10-HDA的具有抗光老化作用的護(hù)膚品、藥妝品或其它化妝品。
[0036]此外，10-HDA除了用于上述的護(hù)膚品、化妝品和藥妝品以外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，10-HDA還可以制作成其他藥學(xué)上可以接受的制劑，以用于抗皮膚光老化的治療或美容；或者10-HDA與其它適用于局部施用到皮膚上的載體制備成具有抗光老化作用的組合物。[0037]下面通過(guò)具體實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本申請(qǐng)作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例僅對(duì)本申請(qǐng)進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不應(yīng)理解為對(duì)本申請(qǐng)的限制。
[0038]實(shí)施例一王漿酸(10-HDA)的抗光老化作用
[0039]( I)人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)
[0040]實(shí)驗(yàn)方法:取兒童包皮環(huán)切術(shù)后的包皮組織，分離獲得純化的人成纖維細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%的特級(jí)胎牛血清(FBS)和青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于含5% CO2的37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0041](2) UVA 照射
[0042]實(shí)驗(yàn)方法:當(dāng)成纖維細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%~90%匯合時(shí)予以UVA照射。將細(xì)胞從培養(yǎng)箱取出，吸棄培養(yǎng)基，用37°C預(yù)熱的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次。每孔加入等量的薄層PBS，然后用不同劑量的UVA照射。照射后立即吸棄PBS溶液，加入新鮮配制的正常培養(yǎng)液，置于95%的濕度、5% CO2的37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本例中正常培養(yǎng)液即含10%的特級(jí)胎牛血清(FBS)和青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液。
[0043](3)細(xì)胞活力測(cè)定
[0044]實(shí)驗(yàn)方法:為了檢 測(cè)10-HDA是否可以抑制UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，本例用CCK-8試劑(Dojindo，日本)測(cè)定細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)分成3組:空白對(duì)照組、UVA照射組和10-HDA組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組:正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；UVA照射組:用4J/cm2 UVA照射，照射后換正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；10-HDA組:用4J/cm2UVA照射，照射后用含lmmol/L 10-HDA的培養(yǎng)液培養(yǎng)。將成纖維細(xì)胞按5 X IO3細(xì)胞/孔密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔添加100 μ I培養(yǎng)液，接種24h后UVA照射組和10-HDA細(xì)胞分別給予4J/cm2 UVA照射，照射后，各組細(xì)胞按照上述條件加入含或不含10-HDA的培養(yǎng)液，分別選取培養(yǎng)24h、48h后進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試時(shí)在每孔中加入10 μ I的CCK-8試劑，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定450nm吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0045]結(jié)果:如圖1所示，其中A為空白對(duì)照組結(jié)果，B為UVA照射組結(jié)果，C為10-HDA組結(jié)果，其中設(shè)定空白對(duì)照組的吸光度表示100%的細(xì)胞活性，B、C各組的吸光度與A組的吸光度比值表示各組的細(xì)胞相對(duì)活性；其中白色柱表示培養(yǎng)24h后的檢測(cè)結(jié)果，黑色柱表示培養(yǎng)48h后的檢測(cè)結(jié)果。與空白對(duì)照組相比，UVA照射組的細(xì)胞活力下降，提示UVA照射對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，而用10-HDA處理的細(xì)胞其活力較高，提示10-HDA可以抑制UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。10-HDA處理48h后，10-HDA組的細(xì)胞活性明顯增高，與UVA照射組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。
[0046](4)活性氧(ROS)水平測(cè)定
[0047]實(shí)驗(yàn)方法:實(shí)驗(yàn)分成3組:空白對(duì)照組、UVA照射組和10-HDA組?？瞻讓?duì)照組:正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；UVA照射組:用4J/cm2 UVA照射，照射前用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；10-HDA組:細(xì)分為3個(gè)濃度組，UVA照射前分別加入不同濃度的10-HDA (0.5mmol/L、lmmol/L、1.5mmol/L)作用24h，再用4J/cm2 UVA照射。將細(xì)胞接種于12孔板中，培養(yǎng)24h后換液，10-HDA組添加含10-HDA的培養(yǎng)液，空白對(duì)照組和UVA照射組則用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后予以4J/cm2 UVA照射，照射完立即加入Iml含10 μ mol/L H2DCFDA熒光探針的溶液(用預(yù)熱的PBS溶液新鮮配制)，37°C避光孵育30min，孵育完加入Iml預(yù)熱的PBS溶液洗2次以去除殘留的H2DCFDA,加入不含酚紅的0.25%的胰酶37°C消化3min，顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮、脫落時(shí)，立即加入含10% FBS但不含酚紅的DMEM培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至不透明的96孔培養(yǎng)板中，在熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510_570nm。
[0048]結(jié)果:如圖2所示，其中A為空白對(duì)照組、B為UVA照射組、C、D、E分別為10-HDA組中0.5mmol/L、lmmol/L、l.5mmol/L濃度的10-HDA。UVA照射組細(xì)胞內(nèi)的ROS水平是空白對(duì)照組的1.4倍左右，兩者比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.01)，提示UVA照射可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生R0S。用0.5mmol/L-l.5mmol/L的10-HDA處理后細(xì)胞內(nèi)的ROS水平可呈劑量依賴性下降，與UVA照射組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)，提示10-HDA處理細(xì)胞后可以抑制UVA誘導(dǎo)的ROS。
[0049](5)細(xì)胞衰老β -半乳糖苷酶(SA- β -gal)染色
[0050]實(shí)驗(yàn)方法:實(shí)驗(yàn)分成3組:空白對(duì)照組、UVA照射組和10-HDA組?？瞻讓?duì)照組:正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；UVA照射組:用4J/cm2 UVA照射，照射后換正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；10_HDA組:細(xì)分為3個(gè)濃度組，用4J/cm2 UVA照射，照射后分別加入不同濃度的10_HDA(0.5mmol/L、ImmoI/L、1.5mm0l/L)。將細(xì)胞接種于12孔板中，培養(yǎng)24h，予以4J/cm2 UVA照射，照射后采用含10-HDA或不含10-HDA的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后進(jìn)行SA-β -gal染色。染色步驟如下:吸棄培養(yǎng)基，PBS溶液洗I次，加入500 μ I預(yù)配好的固定液室溫固定15min。固定后用Iml的PBS溶液洗2次，然后加入500 μ I預(yù)配好的染液，37°C孵育24-36h。β -半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞率計(jì)算方法:每組在200Χ鏡下連續(xù)選取四個(gè)視野，陽(yáng)性細(xì)胞為藍(lán)色，即衰老細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)X 100%。
[0051]結(jié)果:如圖3所示，其中A為空白對(duì)照組、B為UVA照射組、C、D、E分別為10-HDA組中0.5mmol/L、lmmol/L、l.5mmol/L濃度的10-HDA。與空白對(duì)照組相比，UVA照射組SA- β -gal染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.01 )，提示UVA照射可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老。從圖中可以看出，細(xì)胞用0.5mmol/L 10-HDA處理后SA-β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞與UVA照射組相比有下降，統(tǒng)計(jì)分析顯示，lmmol/L 10-HDA處理后SA-β -gal染色陽(yáng)性細(xì)胞與UVA照射組相比下降具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，1.5mmol/L 10-HDA處理后SA-β -gal染色陽(yáng)性細(xì)胞與UVA照射組相比下降顯著。細(xì)胞用(0.5-1.5mmoI/DlO-HDA處理后細(xì)胞衰老的數(shù)量呈劑量依賴性下降，提示10-HDA處理細(xì)胞后可以抑制UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。
[0052](6)膠原蛋白含量測(cè)定
[0053]實(shí)驗(yàn)方法:實(shí)驗(yàn)分成兩大組，第一大組無(wú)UVA照射，第二大組給予UVA照射。每一大組均細(xì)分為2組:對(duì)照組和10-HDA組。對(duì)照組:正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；10-HDA組:培養(yǎng)液中含lmmol/L 10-HDA。將成纖維細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后第二大組用4J/cm2 UVA照射，照射后改用含或不含10-HDA的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h后檢測(cè)上清液的膠原蛋白含量。第一大組除了不用UVA照射，其他操作同第二大組。膠原蛋白含量測(cè)定的詳細(xì)步驟如下:收取細(xì)胞上清液，低速離心(500g,5min) I次,再高速離心(12000rpm, IOmin) I次以去除雜質(zhì)。取800 μ I離心后的上清液轉(zhuǎn)移至低蛋白粘附的離心管中，加入160 μ I的膠原蛋白分離和濃縮試劑，將離心管放入含冰水混合物的容器中，4°C孵育過(guò)夜。孵育后小心取出并離心(12000rpm, IOmin),小心吸棄上清液，加入800 μ I Sircol染液,鏇潤(rùn)振蕩混勻，在搖床上室溫輕輕搖晃30min,離心(12000rpm, IOmin),小心吸棄上清液,加入250 μ I的堿試劑，漩渦振蕩混勻，混勻后取200 μ I混合液至96孔酶標(biāo)板中，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定570nm吸光度。每組設(shè)兩個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0054]結(jié)果:如圖4所示，其中A對(duì)照組、B為10-HDA組，白色柱表示未經(jīng)UVA照射，黑色柱表示經(jīng)過(guò)UVA照射。采用Sircol膠原蛋白分析試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中的可溶性膠原蛋白。細(xì)胞經(jīng)UVA照射后加入含有IO-HDA的培養(yǎng)液孵育48h后測(cè)定。與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞用lmmol/L IO-HDA處理后上清液中的膠原蛋白含量增加。與空白對(duì)照組相比，UVA照射組的膠原蛋白含量增加，提示UVA可以增加成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中的膠原蛋白含量。與UVA照射組相比，IO-HDA組上清液中的膠原蛋白含量增加。
[0055](7)熒光定量PCR
[0056]實(shí)驗(yàn)方法:采用熒光定量PCR檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-1 (MMP-1)和MMP-3mRNA的水平。實(shí)驗(yàn)分成兩大組，第一大組無(wú)UVA照射，第二大組給予UVA照射。每一大組均細(xì)分為2組:對(duì)照組和10-HDA組。對(duì)照組:正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；10-HDA組:培養(yǎng)液中含lmmol/L10-HDA。取第3-8代成纖維細(xì)胞按I X IO5細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，每孔加2ml的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后給予4J/cm2 UVA照射，照射24h后提取細(xì)胞總RNA及合成cDNA，然后采用兩步法PCR反應(yīng)程序進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，以GAPDH為內(nèi)參照基因，結(jié)果分析采用國(guó)際通用的2-Λ ACt方法。
[0057]細(xì)胞總RNA提取采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的RNA提取方法，RNA存儲(chǔ)于_80°C備用。以提取的細(xì)胞總cRNA為模板采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法合成cDNA，合成的cDNA存儲(chǔ)于_20°C備用。
[0058]突光定量PCR 反應(yīng)體系:2 XPremix Ex Taq? II 10.0 μ 1、10 μ M 上游引物0.8 μ 1、10 μ M下游引物0.8 μ 1、cDNA模板IOOng,補(bǔ)充滅菌去離子水至20 μ I。其中SYBR熒光染料為常規(guī)實(shí)時(shí)熒光PCR所使用的熒光染料，上游和下游引物參見表1。
[0059]反應(yīng)條件，95°C預(yù)變性30sec，然后進(jìn)入40個(gè)循環(huán):95°C 5sec、60°C 20sec。反應(yīng)完成后進(jìn)行融解曲線分析。
[0060]表1熒光定量PCR擴(kuò)增引物
基因名引物序列產(chǎn)物長(zhǎng)度
~上游:V-CTCGCCACAACTGCCAAMG-y
MMP-1103 bn
下游:5f-CTGTCCCTGAACAGCCCAGTACTTA-yp
[0061]上游:5,-ATTCCATGGAGCCAGGCTTTC-:r
ΜΜΡ-3138 bn
下游:5'- CATTTGGGTCAAACTCCAACTGTG'VF
…—η 上游:5,-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC'V,…
GAPDH 下游:5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'i38bp
[0062]結(jié)果:如圖5和圖6所示，圖5是MMP-1的檢測(cè)結(jié)果，圖6是MMP-3的檢測(cè)結(jié)果，其中，A為空白對(duì)照組，B為10-HDA組，白色柱表示未經(jīng)過(guò)UVA照射，黑色柱表示經(jīng)過(guò)UVA照射。熒光定量PCR結(jié)果顯示，UVA照射組細(xì)胞內(nèi)的MMP-1和MMP_3 mRNA水平分別是空白對(duì)照組的3.7倍和5.9倍，與空白對(duì)照組比較差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.01 )，提示UVA照射可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)MMP-1和MMP-3 mRNA。與UVA照射組相比，細(xì)胞用10-HDA處理后細(xì)胞的MMP-1和MMP-3 mRNA水平下降，提示10-HDA處理細(xì)胞后可以抑制UVA誘導(dǎo)的MMP-1 和 MMP-3 mRNA 的表達(dá)。
[0063](8)蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot):
[0064]實(shí)驗(yàn)方法:采用Western blot檢測(cè)MMP-1、MMP-3、JNK和p38 MAPK蛋白的水平。實(shí)驗(yàn)分成兩大組，第一大組無(wú)UVA照射，第二大組給予UVA照射。每一大組均細(xì)分為2組:對(duì)照組和10-HDA組。對(duì)照組:正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；10-HDA組:培養(yǎng)液中含lmmol/L 10-HDA。取第3-8代成纖維細(xì)胞按I X IO5細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，每孔加2ml的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后給予4J/cm2 UVA照射。檢測(cè)MMP-1和MMP-3蛋白水平時(shí)在UVA照射后培養(yǎng)24h提取細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)JNK和p38 MAPK蛋白水平時(shí)則在UVA照射后培養(yǎng)1.5h提取細(xì)胞總蛋白。每組收集等量的蛋白樣品，將收集的蛋白樣品上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，然后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉以及孵育一抗(鼠抗人MMP-1抗體、鼠抗人MMP-3抗體、兔抗人P-JNK抗體、兔抗人t-JNK抗體、兔抗人p-p38 MAPK抗體和兔抗人t-p38 MAPK抗體)。孵育二抗后進(jìn)行顯色(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗)。顯色后將膠片進(jìn)行掃描，將掃描后的圖片用凝膠圖象處理系統(tǒng)ImageJ軟件分析條帶的密度，以內(nèi)參基因β _actin作校正計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
[0065]結(jié)果:如圖7-10所示，圖7為MMP-1的檢測(cè)結(jié)果，圖8為MMP-3的檢測(cè)結(jié)果，圖9為JNK的檢測(cè)結(jié)果，圖10為p38的檢測(cè)結(jié)果，其中為I凝膠圖像，II為定量分析柱圖；A為對(duì)照組，B為10-HDA組，白色柱表示未經(jīng)UVA照射，黑色柱表示經(jīng)過(guò)UVA照射。與空白對(duì)照組相比，UVA照射組細(xì)胞內(nèi)的MMP-1、MMP-3、p-JNK和p-p38 MAPK蛋白水平明顯增加，提示UVA照射可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)MMP-l、MMP-3、p-JNK和p-p38 MAPK蛋白的表達(dá)。UVA照射的細(xì)胞用10-HDA處理后MMP-1、MMP-3、p-JNK和p-p38 MAPK蛋白水平下降，提示10-HDA處理細(xì)胞后可以抑制UVA誘導(dǎo)的MMP-1、MMP-3、p-JNK和p-p38 MAPK蛋白的表達(dá)。
[0066]本例中，上述(3)至(8)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)都重復(fù)至少3次；并采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)中獲得的各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，兩組間比較再用方差分析中的LSD檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(means土SD)表不。
[0067]本例的上述(3)至(8)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10-HDA可以抑制UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性、抑制UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老、抑制UVA誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，并增加膠原蛋白含量，說(shuō)明10-HDA具有抗光老化的作用，其機(jī)制與抑制JNK and p38 MAPK信號(hào)通路的活化而減少M(fèi)MP-1和MMP-3表達(dá)有關(guān)。因此，10-HDA是一種有效的抗皮膚光老化物質(zhì)。
[0068]實(shí)施例二含王漿酸(10- HDA)的抗光老化制劑
[0069]將10-HDA與硬脂酸、液體石蠟等乳化劑混合制成10-HDA乳液。選擇24個(gè)健康成人，將含有10-HDA的乳液或空白對(duì)照(不含10-HDA)分別涂在右手臂內(nèi)側(cè)的兩個(gè)地方，每天使用乳液三次，連續(xù)使用15天，在實(shí)驗(yàn)的開始用紫外線照射手臂，每隔三天照一次，共照二次，分別在照射后第1、3、5、7、10、15天觀察局部紅斑和色素沉著情況。
[0070]結(jié)果顯示，在照射后第1、3、5、7天紫外線照射處皮膚均可見紅斑，10-HDA乳液涂抹處的紅斑面積和顏色均較空白對(duì)照涂抹處輕。在照射后第10、15天紫外線照射處均可見褐色的色素沉著，10-HDA乳液涂抹處的色素沉著面積和顏色均較空白對(duì)照涂抹處輕。因此10-HDA乳液可以減輕紫外線照射皮膚后引起的紅斑和色素沉著。可見，長(zhǎng)期使用含10-HDA這一成分的化妝品后可以改善皮膚光老化的臨床癥狀，起到淡化皺紋，減少色素沉著、毛細(xì)血管擴(kuò)張，增加皮膚彈性，使皮膚更加緊致、細(xì)膩，并可預(yù)防脂溢性角化病、光線性肉芽腫、日光性角化病、惡性黑色素瘤、基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌等皮膚病的發(fā)生。
[0071]需要說(shuō)明的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，鑒于10-HDA的抗皮膚光老化作用，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠很容易的將10-HDA添加到護(hù)膚品、藥妝品或其它化妝品中，以制備出含10-HDA的具有抗光老化作用的護(hù)膚品、藥妝品或其它化妝品。
[0072]本例中將10-HDA制成乳液，具有良好的抗光老化效果。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，上述溶劑、載體、或IO-HDA的劑型并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)的限制；在不脫離本申請(qǐng)的基本構(gòu)思的情況下還可以制備出若干的含10-HDA的組合物，只要該組合物被用于抗皮膚光老化的美容或治療中均在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0073]以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本申請(qǐng)所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本申請(qǐng)的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本申請(qǐng)所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本申請(qǐng)構(gòu)思的前 提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本申請(qǐng)的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種抗皮膚光老化制劑，其特征在于:含有王漿酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗皮膚光老化制劑，其特征在于:所述王漿酸的含量為0.5-1.5mmol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗皮膚光老化制劑在抗光老化護(hù)膚品、抗光老化化妝品或抗光老化藥妝品中的應(yīng)用。
4.一種抗光老化護(hù)膚品，其特征在于:含有王漿酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗光老化護(hù)膚品，其特征在于:所述王漿酸的含量為0.5-1.5mmol/L。
6.一種抗光老化化妝品，其特征在于:含有王漿酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗光老化化妝品，其特征在于:所述王漿酸的含量為0.5-1.5mmol/L。
8.一種抗光老化藥妝品，其特征在于:含有王漿酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗光老化藥妝品，其特征在于:所述王漿酸的含量為`0.5-1.5mmol/L。`
【文檔編號(hào)】A61K8/365GK103505374SQ201210206686
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月20日
【發(fā)明者】鄭錦芬 申請(qǐng)人:鄭錦芬, 陸春, 深圳市神蜂科技開發(fā)有限公司