基于聚乙烯亞胺可降解的基因載體及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明所要解決的問(wèn)題在于提供一種基于聚乙烯亞胺可降解的基因載體及其制備方法：通過(guò)邁克爾加成的方法，一步制備基于聚乙烯亞胺的可降解陽(yáng)離子高分子基因載體。該基因載體利用靜電相互作用與帶負(fù)電荷的DNA分子形成聚電解質(zhì)復(fù)合物保護(hù)DNA片段不被核酸酶降解；該基因載體同時(shí)具備可降解性質(zhì)，降解產(chǎn)物失去與DNA結(jié)合的能力，從而達(dá)到高效釋放DNA的目的，最后，釋放的DNA進(jìn)入細(xì)胞核表達(dá)相關(guān)蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)基因治療。
【專(zhuān)利說(shuō)明】基于聚乙烯亞胺可降解的基因載體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及基因治療【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種基于聚乙烯亞胺的可降解陽(yáng)離子高分子基因載體及其制備方法，即可降解陽(yáng)離子通過(guò)靜電相互作用與DNA形成復(fù)合物，遞送DNA進(jìn)入細(xì)胞并且表達(dá)相關(guān)蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)基因治療。
【背景技術(shù)】
[0002]基因治療是指將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^(guò)一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)新技術(shù)。通過(guò)基因治療的方法可以治療多種嚴(yán)重疾病，包括:遺傳病(如囊性纖維病等)、心血管疾病、惡性腫瘤、白血病、感染性疾病(如AIDS、類(lèi)風(fēng)濕等)?；蛑委煹年P(guān)鍵技術(shù)是基因傳遞載體的選擇，當(dāng)前，基因傳遞載體主要可分為兩類(lèi):病毒載體和非病毒載體。病毒載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但是由于病毒載體攜帶基因長(zhǎng)度有限、安全性不高、價(jià)格昂貴等限制了其臨床應(yīng)用。非病毒載體安全、易于制備。而研究最多、應(yīng)用最廣泛的非病毒載體是陽(yáng)離子高分子載體(Li S，Huang L.Gene Ther.2000, 7, 31-34;Mintzer MA, Simanek EE.Chem.Rev.2009, 109，259-302)。
[0003]帶正電的陽(yáng)離子高分子/DNA復(fù)合物與帶負(fù)電的細(xì)胞膜通過(guò)靜電作用相互結(jié)合以后，細(xì)胞通過(guò)胞吞攝取高分子/DNA復(fù)合物。胞吞是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括結(jié)合、內(nèi)在化、形成內(nèi)體、溶酶體融合及裂解等。內(nèi)體中的酸性環(huán)境(pH 5.5)以及可以降解DNA的酶都會(huì)導(dǎo)致復(fù)合物和DNA的降解，因此為 了避免降解，復(fù)合物必須迅速?gòu)膬?nèi)體中逃逸出來(lái)，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)之為內(nèi)體逃逸(endos ome escape)。DNA或復(fù)合物從內(nèi)體中逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中擴(kuò)散到細(xì)胞核的膜上，通過(guò)細(xì)胞核膜上的核孔或在核定位信號(hào)多肽(nuclearlocalization signal peptides)的幫助下通過(guò)核膜受體進(jìn)入細(xì)胞核并表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)。近十多年來(lái)，各種天然和合成的陽(yáng)離子高分子用作基因傳遞系統(tǒng)，包括聚乙烯亞胺(PEI)、聚酰胺-胺樹(shù)形高分子(dendrimer)、脫乙酰殼多糖(chitosan)、明膠(gelatin)、陽(yáng)離子多肽、陽(yáng)離子聚酯(PAGA)、陽(yáng)離子聚磷酸酯(polyphosphoester, PPE)、聚乙烯基批啶鹽、聚(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯等。在現(xiàn)有的陽(yáng)離子高分子載體中，PEI無(wú)疑是最成功的例子，已成為設(shè)計(jì)新的陽(yáng)離子載體的標(biāo)準(zhǔn)。PEI作為基因載體效率高的一個(gè)重要原因是它的高緩沖能力，但是PEI不可降解，對(duì)細(xì)胞毒性高(Fischer D1Bieber T，LiY, Elsasser HP, Kissel T.Pharm.Res.1999, 16, 1273-1279;Lim YB, Kim SM, Suh H, ParkJS.Bioconjugate Chem.2002, 13, 952-957)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的問(wèn)題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中聚乙烯亞胺的基因載體不可降解的缺陷，提供一種高效低毒，基于聚乙烯亞胺可降解的基因載體的制備方法。
[0005]本發(fā)明的所要解決的又一問(wèn)題，在于提供上述的基于聚乙烯亞胺可降解的基因載體。[0006]本發(fā)明的所要解決的又一問(wèn)題，在于提供上述的基于聚乙烯亞胺可降解的基因載體的應(yīng)用。
[0007]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問(wèn)題，本發(fā)明第一方面提供的技術(shù)方案是:基于聚乙烯亞胺可降解的基因載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟，
[0008](I)聚乙烯亞胺溶于無(wú)水甲醇，加入1，4-丁二醇雙丙烯酰胺，聚乙烯亞胺:1，4-丁二醇雙丙烯酰胺的質(zhì)量比為4:1，通往氬氣保護(hù)，反應(yīng)過(guò)夜；
[0009](2)將反應(yīng)液置于RC膜透析袋中，其截留分子量為3500，甲醇透析，最后旋干甲醇溶液，冰水溶解，凍干得到油狀物，即為制備的基于聚乙烯亞胺的可降解基因載體(BDDA-PEI)，保存在-20 V。
[0010]
【權(quán)利要求】
1.基于聚乙烯亞胺可降解的基因載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟， (1)溶于無(wú)水甲醇的聚乙烯亞胺中以質(zhì)量比4:1加入1，4_丁二醇雙丙烯酰胺，通往氬氣保護(hù)，反應(yīng)過(guò)夜； (2)將反應(yīng)液置于RC膜透析袋中，其截留分子量為3500，甲醇透析，最后旋干甲醇溶液，冰水溶解，凍干得到油狀物，即為制備的基于聚乙烯亞胺的可降解基因載體，保存在-20°C，反應(yīng)式如下。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于聚乙烯亞胺可降解的基因載體的制備方法，其特征在于，所述聚乙烯亞胺分子量 為423Da_1800Da。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于聚乙烯亞胺可降解的基因載體的制備方法，其特征在于，所述聚乙烯亞胺分子量為800Da。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于聚乙烯亞胺可降解的基因載體的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中反應(yīng)溫度為25-100° C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于聚乙烯亞胺可降解的基因載體的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中反應(yīng)溫度為50°C。
6.一種基于聚乙烯亞胺可降解的基因載體，如下化學(xué)式1:
7.如權(quán)利要求6所述的基于聚乙烯亞胺可降解的基因載體用于基因治療。
【文檔編號(hào)】A61K47/34GK103509183SQ201210206915
【公開(kāi)日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月21日
【發(fā)明者】張智軍, 劉敏, 沈賀 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所