專利名稱：一種高分子量靈芝多糖及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥用真菌領(lǐng)域，具體地說涉及一種高分子量靈芝多糖及其檢測方法。
背景技術(shù)：
靈芝多糖是藥用真菌靈芝中的主要藥效成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤、抗衰老、抗高血壓等多種生物活性。靈芝中含有一種高分子量的靈芝多糖成份，分子量為IOOOkDa以上，該多糖可選擇性地刺激B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，顯著增強(qiáng)免疫球蛋白的產(chǎn)生，并
增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能和刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-I P和TNF-a的生成。這種多糖雖然在實驗室可以通過復(fù)雜的分離純化手段獲得，但大規(guī)模的制備方法卻沒有報道。同時靈芝多糖的含量測定基本運(yùn)用苯酚硫酸法，可以測定出總多糖的含量，并不能反映出其中活性多糖的含量，因此建立準(zhǔn)確測定靈芝中具有生物活性的多糖對于靈芝質(zhì)量評價的十分重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先提供了一種高分子量靈芝多糖，該高分子量靈芝多糖是通過如下步驟制備得到的①水提醇沉；②純化；③冷凍干燥；其中純化包括超濾和陰離子樹脂純化；其中超濾為將水提醇沉后的沉淀加水溶解后，用50萬的超濾膜進(jìn)行超濾，得到分子量大于50萬的靈芝多糖；其中陰離子樹脂純化為將分子量大于50萬的靈芝多糖水溶液加入DEAE-Sepharose陰離子樹脂,去除水洗脫部分，收集0_0. 5NaCL洗脫部分,用I萬的超濾膜超濾脫鹽。其中水提醇沉為將靈芝子實體中加水，在80-120°C下熱提，水提液濃縮后再加乙醇沉淀；其中冷凍干燥為將純化后的靈芝多糖先放置于-20°C冷凍2-4小時，然后置于-80°C冷凍5-7小時，之后轉(zhuǎn)到冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥處理，最后得到靈芝高分子量多糖(GLIS)。本發(fā)明還提供了一種制備上述高分子靈芝多糖的方法，該方法包括如下步驟①水提醇沉；②純化；③冷凍干燥；其中純化包括50萬超濾膜的超濾和DEAE-S印harose陰離子樹脂柱的分離純化。本發(fā)明還提供了一種檢測上述高分子量多糖的方法，能夠測定靈芝中活性多糖的含量，用于靈芝質(zhì)量的評價，該方法包括如下步驟①標(biāo)準(zhǔn)品的制備權(quán)利要求I所述的高分子量靈芝多糖用水溶解，然后上Sephacryl 500凝膠層析柱,收集第一個峰,濃縮干燥得到；②將待測樣品進(jìn)行HPLC測定；其中HPLC 的檢測條件為，TSKgel G6000PWXL (13) 7. 8*300 ;流動相0. 05mol/L 的NaH2PO4和0. 15mol/L的NaNO3水溶液；流速0. 5mL/min ;柱溫35°C ;示差檢測器。本發(fā)明使用的靈芝子實體為市售產(chǎn)品。本發(fā)明使用的超濾膜為高分子聚合卷式超濾膜，濾芯材質(zhì)為聚砜PS、聚醚砜PES、聚偏氟乙烯PVDF，具體是購自上海弗立特實業(yè)有限公司的UF-3530超濾膜。 本發(fā)明使用的DEAE-Sepharose陰離子樹脂購自GE公司。本發(fā)明提供的高分子量靈芝多糖，制備方法簡便、適用于大規(guī)模生產(chǎn)，且多糖含量達(dá)到65%以上，并且該靈芝多糖的免疫活性顯著提高，可刺激巨噬細(xì)胞生成一氧化氮(NO)。制備的標(biāo)準(zhǔn)品多糖含量大于90%，本發(fā)明運(yùn)用高效液相法建立了高分子量靈芝多糖的含量測定方法，該檢測方法準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，為靈芝中活性多糖的含量提供了一種新的檢測方法。


圖I高分子量靈芝多糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜。圖2實施例I制備得到的高分子量靈芝多糖的HPLC圖譜。
具體實施例方式實施例I高分子量靈芝多糖的制備I.水提醇沉靈芝子實體5Kg加入10倍的水50L100。C加熱I小時，過濾，殘渣加入10倍水再100° C加熱I小時，過濾，合并濾液160L，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5L，加無水乙醇5L至50%的濃度，靜置過夜，沉淀離心后去除上清。2.靈芝多糖的純化沉淀加水溶解后，上截留值為50萬的超濾膜進(jìn)行超濾，獲得大于50萬的高分子量的靈芝多糖36g。3.進(jìn)一步純化和濃縮大于50萬的靈芝多糖0. 5g加入裝填50_X300_的裝有的DEAE-Sepharose陰離子樹脂柱(GE公司)中進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，收集0-0. 5NaCl洗脫部分，并進(jìn)行超濾濃縮脫鹽。4.冷凍干燥將超濾濃縮后多糖先放置于_20°C冷凍3小時，然后置于-80攝氏度冷凍6小時，之后轉(zhuǎn)到冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥處理，最后得到高分子量靈芝多糖0. 253g。實施例2生物活性檢測，所用的高分子量靈芝多糖為實施例I中制備得到的。I小鼠H22移植瘤模型的建立生長良好的H22腹水瘤小鼠(購自南京中醫(yī)藥大學(xué))，無菌條件下抽取腹水，并用生理鹽水稀釋調(diào)整瘤細(xì)胞數(shù)為3 XlOVml的細(xì)胞懸液，用75%乙醇消毒實驗BALB/c小鼠(購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司)右腋下皮膚，每只小鼠右腋皮下注射0.2ml H22腹水瘤細(xì)胞懸液(含瘤細(xì)胞6 X IO6)。2分組和給藥30只BALB/c小鼠接種24小時后，隨機(jī)分成3組給藥模型組給予等量生理鹽水、5-FU組20mg/kg、高分子量靈芝多糖25mg/kg+5-FU20mg/kg,每組10只。5-FU及靈芝高分子量多糖25mg/kg劑量均每日一次。各組均腹腔注射給藥，持續(xù)8天。3指標(biāo)測定給藥期間，測定小鼠體重和攝食量，末次給藥后24小時分離瘤塊，稱重，計算腫瘤生長抑制率，腫瘤抑制率(％ ) = (I-藥物組平均瘤重/模型平均瘤重)X 100%。4統(tǒng)計方法所有實驗數(shù)據(jù)均以I ±SD表示，采用單因素方差分析和t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，P
<0. 05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。5實驗結(jié)果如表I所示，與模型組相比,5-FU組、5-FU+高分子量靈芝多糖組的腫瘤重量均極顯著減輕(P<0.01)。與5-FU組相比，5-FU+高分子量靈芝多糖組的腫瘤重量顯著減輕(P
<0. 05)。5-FU與高分子量靈芝多糖合用，腫瘤抑制率明顯高于單用5-FU時，對化療藥物5-FU有明顯的增效作用。表I高分子量靈芝多糖組對H22移植瘤小鼠瘤重的影響
權(quán)利要求
1.一種高分子量靈芝多糖，其特征在于該高分子量靈芝多糖是通過如下步驟制備得到的 ①水提醇沉； ②純化； ③冷凍干燥； 其中純化包括超濾和陰離子樹脂純化； 其中超濾為將水提醇沉后的沉淀加水溶解后，用50萬的超濾膜進(jìn)行超濾，得到分子量大于50萬的靈芝多糖； 其中陰離子樹脂純化為將分子量大于50萬的靈芝多糖水溶液加入DEAE-Sepharose陰離子樹脂，去除水洗脫部分，收集0-0. 5NaCL洗脫部分，I萬的超濾膜超濾脫鹽。
2.本發(fā)明還提供了一種檢測權(quán)利要求I所述高分子量多糖的方法，其特征在于該方法包括如下步驟 ①標(biāo)準(zhǔn)品的制備權(quán)利要求I所述的高分子量靈芝多糖用水溶解，然后上Sephacryl500凝膠層析柱，收集第一個峰，濃縮干燥得到； ②將待測樣品進(jìn)行HPLC測定； 其中 HPLC 的檢測條件為，TSKgel G6000PWXL (13) 7. 8*300 ;流動相0. 05mol/L 的NaH2PO4和0. 15mol/L的NaNO3水溶液；流速0. 5mL/min ;柱溫35°C ;示差檢測器。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高分子量靈芝多糖及其檢測方法，該高分子量靈芝多糖是通過水提醇沉、純化、冷凍干燥得到的。本發(fā)明的高分子量靈芝多糖，制備方法簡便、適用于大規(guī)模生產(chǎn)，且多糖含量達(dá)到65%以上，可刺激巨噬細(xì)胞生成一氧化氮(NO)。
文檔編號A61P35/00GK102718880SQ20121020970
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月23日
發(fā)明者劉艷芳, 周帥, 唐傳紅, 唐慶九, 張勁松, 張圣龍, 楊焱, 王晨光 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 上海百信生物科技有限公司