專利名稱：一種殼聚糖支載羥基喜樹堿-量子點(diǎn)fret復(fù)合探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)及生物技術(shù)交叉領(lǐng)域，特別是一種殼聚糖支載羥基喜樹堿-量子點(diǎn)FRET復(fù)合探針。
背景技術(shù)：
眾所周知,癌癥是人類生命的一大威脅,如何實(shí)現(xiàn)癌癥的有效治療以及治療療效的實(shí)時監(jiān)控成為學(xué)者們最關(guān)注的問題之一。目前，對于癌癥最常用的手段是化學(xué)療法，抗癌藥物可通過抑制脫氧核醣核酸 (DNA)復(fù)制，阻斷癌細(xì)胞的分裂，從而抑制癌細(xì)胞的生長，以達(dá)到治療療效。但化療藥物一般并不專一，在殺死癌細(xì)胞的同時，也會對正常細(xì)胞的細(xì)胞分裂產(chǎn)生影響，傷害需要進(jìn)行分裂以維持正常功能的健康組織及細(xì)胞，例如毛發(fā)基部細(xì)胞和腸粘膜細(xì)胞等，從而使病人常有脫發(fā)及惡心嘔吐等癥狀。同時，現(xiàn)在通常使用的對實(shí)體瘤的療效評價標(biāo)準(zhǔn)為RECIST(Response EvaluationCriteria in Solid Tumors，RECIST)和WHO，通過治療前后腫瘤最長徑尺度變化評價疾病的發(fā)展情況，其評價指標(biāo)主要有完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)、疾病進(jìn)展(PD)。其他檢測手段，如胸部X片(適用于肺部)、計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)、核磁共振成像(MRI)、超聲波檢查(適用于體表或淺層，不適合腹腔)、內(nèi)窺鏡及腹腔鏡、腫瘤標(biāo)記等細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)檢查手段，對腫瘤變化過程也只是一種靜態(tài)刻畫，難于實(shí)現(xiàn)抗癌藥物治療療效的原位實(shí)時評價，藥效療效評價具有一定的滯后性。向腫瘤癌細(xì)胞病灶靶向投遞藥物是有效治療癌癥的有效方法之一，它可克服化學(xué)藥物治療所帶來的副作用。這一系統(tǒng)可將藥物最大限度地運(yùn)送到靶區(qū)，使藥物在靶區(qū)濃集，可超出普通試劑的數(shù)倍乃至數(shù)百倍，直接作用于病變組織、器官和細(xì)胞，延長藥物與靶部位的作用時間，治療效果明顯提高；同時可減少藥物用量，降低了藥物在其他部位的濃度，達(dá)到高效低毒的治療效果。此外，在眾多實(shí)體瘤治療療效評價方法中，熒光探針法較傳統(tǒng)的同位素檢測法相比，表現(xiàn)出速度快、重復(fù)性好、用量少及無輻射等優(yōu)點(diǎn)，在疾病診斷、抗癌藥物分析、抗體免疫分析等方面已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。與葉酸分子偶聯(lián)的熒光體通過葉酸受體的特異性作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，使腫瘤組織明顯區(qū)別于臨近正常組織。與放射成像技術(shù)相比，熒光成像無創(chuàng)傷，也使人體免受粒子輻射。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是一種新型熒光研究方法，由于FRET對于距離和熒光基團(tuán)的空間取向高度靈敏，可以通過FRET效率的測量，觀察生物分子間相互作用的改變情況，反應(yīng)兩分子團(tuán)的距離信息。從理論上講，在分子水平上研究任何生物學(xué)機(jī)制都可以通過FRET技術(shù),關(guān)鍵在于找到合適的突光探針。輕基喜樹堿是一種抗癌譜較廣，毒性小的抗腫瘤藥，本身具有一定的熒光特性，其激發(fā)波長為363nm，發(fā)射波長為550nm。由于其熒光量子產(chǎn)率低，熒光強(qiáng)度不高，不具備同時殺死癌細(xì)胞和與癌細(xì)胞熒光原位表達(dá)的功能。而量子點(diǎn)(Quantum Dots,簡稱QDs)作為一種熒光半導(dǎo)體材料，因其具有熒光發(fā)射譜峰狹窄而對稱、有較寬得光譜激發(fā)范圍、發(fā)射波長可調(diào)和抗漂白性強(qiáng)等優(yōu)異的光譜性質(zhì)使得它在FRET的應(yīng)用中具有很多優(yōu)勢。選擇合適波長的量子點(diǎn)，并將它與羥基喜樹堿耦合在同一載體上，使它們二者能形成熒光共振能量轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)熒光檢測靈敏度，可實(shí)現(xiàn)在羥基喜樹堿殺滅癌細(xì)胞的同時，實(shí)時熒光表達(dá)癌細(xì)胞作用形態(tài)，實(shí)現(xiàn)羥基喜樹堿與腫瘤癌細(xì)胞作用過程及治療療效的原位實(shí)時動態(tài)監(jiān)控。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種殼聚糖支載羥基喜樹堿-量子點(diǎn)FRET復(fù)合探針，該探針將具有一定波長的量子點(diǎn)與抗癌藥羥基喜樹堿相耦合，形成具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)特性的復(fù)合結(jié)構(gòu)，在紫外光或可見光量激發(fā)下表達(dá)FRET特性的熒光探針，采用葉酸對該探針進(jìn)行修飾構(gòu)建成一種靶向作用于腫瘤癌細(xì)胞的羥基喜樹堿-量子點(diǎn)FRET熒光探針。利用葉酸和葉酸受體的特異性結(jié)合特性實(shí)現(xiàn)對腫瘤癌細(xì)胞的靶向標(biāo)記；利用探針上羥基喜樹堿和量子點(diǎn)之間的FRET特性，通過探針與癌病灶作用過程中，F(xiàn)RET現(xiàn)象結(jié)構(gòu)變化信息和量子點(diǎn)熒光圖像變化的觀察，實(shí)現(xiàn)熒光探針與腫瘤癌細(xì)胞相互作用過程及效率的原位實(shí)時動態(tài)監(jiān)控。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案是提供一種殼聚糖支載羥基喜樹堿-量子點(diǎn)FRET復(fù)合探針,其中該復(fù)合探針包括葉酸修飾的殼聚糖、量子點(diǎn)和抗癌藥輕基喜樹堿；所述量子點(diǎn)為具有一定波長，能作為能量供體與抗癌藥羥基喜樹堿相耦合，形成具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)特性的復(fù)合探針結(jié)構(gòu)，在紫外光或可見光激發(fā)下，能與羥基喜樹堿發(fā)生光電轉(zhuǎn)移而發(fā)生熒光淬滅，并將激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到羥基喜樹堿上而表達(dá)FRET特性的一類水溶性量子點(diǎn)。本發(fā)明效果為I.本發(fā)明一種殼聚糖支載羥基喜樹堿-量子點(diǎn)FRET復(fù)合探針，構(gòu)建了羥基喜樹堿-量子點(diǎn)FRET復(fù)合探針結(jié)構(gòu)，在紫外光或可見光激發(fā)下，量子點(diǎn)與羥基喜樹堿發(fā)生光電轉(zhuǎn)移，量子點(diǎn)發(fā)生熒光淬滅，并將激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到羥基喜樹堿上，增強(qiáng)羥基喜樹堿的熒光強(qiáng)度，使其具有與癌細(xì)胞作用的熒光原位表達(dá)特性。 2.本發(fā)明一種殼聚糖支載羥基喜樹堿-量子點(diǎn)FRET復(fù)合探針，通過葉酸和葉酸受體的特異性結(jié)合特性可靶向投遞至腫瘤癌細(xì)胞并對其進(jìn)行染色，根據(jù)熒光行為觀察復(fù)合探針在腫瘤癌細(xì)胞各區(qū)域的作用過程及分布規(guī)律；在羥基喜樹堿釋放并與腫瘤癌細(xì)胞作用過程中，復(fù)合探針的FRET復(fù)合結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，量子點(diǎn)的熒光圖像逐漸恢復(fù)，通過量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度變化大小和變化速率等信息的實(shí)時監(jiān)控，可間接實(shí)現(xiàn)羥基喜樹堿與腫瘤癌細(xì)胞作用過程的原位實(shí)時動態(tài)監(jiān)控。


圖I為本發(fā)明的復(fù)合熒光探針體系的結(jié)構(gòu)示意圖。I、殼聚糖 2、量子點(diǎn) 3、葉酸 4、輕基喜樹堿 5、葉酸受體6、腫瘤癌細(xì)胞 7、藥物釋放過程 8、細(xì)胞核
具體實(shí)施方式

結(jié)合附圖對本發(fā)明的一種殼聚糖支載羥基喜樹堿-量子點(diǎn)FRET復(fù)合探針的組成及作用過程加以說明。
本發(fā)明的一種殼聚糖支載羥基喜樹堿-量子點(diǎn)FRET復(fù)合探針，該復(fù)合探針包括有葉酸修飾殼聚糖、量子點(diǎn)和抗癌藥羥基喜樹堿；所述量子點(diǎn)為具有一定波長，并能與抗癌藥羥基喜樹堿相耦合，形成具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)特性的復(fù)合探針結(jié)構(gòu)，并在紫外光或可見光激發(fā)下能表達(dá)FRET特性的一類量子點(diǎn)。所述復(fù)合探針在紫外光或可見光激發(fā)下，量子點(diǎn)與羥基喜樹堿發(fā)生光電轉(zhuǎn)移，量子點(diǎn)發(fā)生熒光淬滅，并將激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到羥基喜樹堿上，表達(dá)FRET特性，羥基喜樹堿熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。所述殼聚糖為兩親性殼聚糖，其分子量為2000 4000。所述FRET復(fù)合探針結(jié)構(gòu)中，量子點(diǎn)為能量供體,輕基喜樹堿為能量受體。量子點(diǎn)的發(fā)射波長為353 373nm。如圖I所示，本發(fā)明所涉及的一種殼聚糖支載羥基喜樹堿-量子點(diǎn)FRET復(fù)合探針功能是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所涉及的一種殼聚糖支載羥基喜樹堿-量子點(diǎn)FRET復(fù)合探針，該探針有抗癌藥羥基喜樹堿4、量子點(diǎn)2和葉酸3修飾的殼聚糖I構(gòu)成。所選抗癌藥羥基喜樹堿4是一種抗癌譜較廣，毒性小的抗腫瘤藥，本身具有一定的熒光特性，其激發(fā)波長為363nm，發(fā)射波、長為550nm ;所選量子點(diǎn)2為水溶性量子點(diǎn)，具有一定波長，并能作為能量供體與羥基喜樹堿4形成具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET復(fù)合結(jié)構(gòu)，并在紫外光或可見光激發(fā)下能表達(dá)FRET特性；所選葉酸3修飾的殼聚糖I為兩親性殼聚糖，其分子量大小為20001000 ;量子點(diǎn)2通過包裹方式組裝在葉酸3修飾殼聚糖I內(nèi)構(gòu)成葉酸修飾殼聚糖-量子點(diǎn)復(fù)合體，羥基喜樹堿4也通過包裹方式組裝在葉酸修飾殼聚糖-量子點(diǎn)復(fù)合體內(nèi)。將具有一定波長的量子點(diǎn)2與抗癌藥輕基喜樹堿4稱合,使有量子點(diǎn)2的發(fā)射波長與輕基喜樹堿4的激發(fā)波長相匹配，形成具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET復(fù)合結(jié)構(gòu)。在紫外光或可見光激發(fā)下，量子點(diǎn)2與羥基喜樹堿2發(fā)生光電轉(zhuǎn)移，量子點(diǎn)2發(fā)生熒光淬滅，并將激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到羥基喜樹堿4上，表達(dá)FRET特性，羥基喜樹堿4熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。該探針載體選擇為殼聚糖1，殼聚糖為兩親性并用葉酸3進(jìn)行了修飾。利用葉酸3和葉酸受體5的特異性結(jié)合特性實(shí)現(xiàn)該探針對腫瘤癌細(xì)胞6的靶向投遞作用；利用該復(fù)合探針的FRET特性，通過對探針與癌病灶相互作用過程中，F(xiàn)RET現(xiàn)象結(jié)構(gòu)和量子點(diǎn)2熒光圖像變化信息的監(jiān)控，實(shí)現(xiàn)復(fù)合探針與腫瘤癌細(xì)胞6的相互作用過程的原位實(shí)時動態(tài)監(jiān)控。殼聚糖支載抗癌藥輕基喜樹堿-量子點(diǎn)FRET復(fù)合探針進(jìn)入活體組織后,通過葉酸3和葉酸受體5的特異性結(jié)合特性靶向運(yùn)輸至腫瘤癌細(xì)胞6細(xì)胞膜上，殼聚糖I本身所帶的正電荷與腫瘤癌細(xì)胞6細(xì)胞膜上負(fù)電荷結(jié)合，形成內(nèi)涵體，并通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入腫瘤癌細(xì)胞6細(xì)胞漿。ATP酶驅(qū)動的質(zhì)子泵將質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入內(nèi)涵體，使內(nèi)涵體表面呈酸性，PH值約為5，殼聚糖I溶解，抗癌藥羥基喜樹堿4得到釋放，并作用于細(xì)胞核8而發(fā)揮藥效。在這一過程中，復(fù)合探針的FRET對腫瘤癌細(xì)胞5進(jìn)行染色，通過其復(fù)合探針熒光行為變化和量子點(diǎn)熒光變化清況，可觀察復(fù)合探針在腫瘤癌細(xì)胞5各區(qū)域的作用過程及分布規(guī)律。在藥物釋放過程7中，由于具有FRET特性的熒光探針對于距離和熒光基團(tuán)的空間取向具有高度敏感性，羥基喜樹堿4與量子點(diǎn)2之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移受到破壞，其熒光行為發(fā)生變化，量子點(diǎn)2的熒光圖像恢復(fù)并隨時間發(fā)生變化，通過對該過程中量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的變化大小和變化速率等信息的實(shí)時監(jiān)測，可間接實(shí)現(xiàn)腫瘤癌細(xì)胞6與羥基喜樹堿4作用過程的原位實(shí)時動態(tài)監(jiān)控。實(shí)施例
I)用親水性的琥珀酸和疏水性長鏈酸酐修飾殼聚糖，使其具有疏水-親水兩親性。用葉酸對其進(jìn)一步修飾，并將其與水溶性量子點(diǎn)羧基CdTe組裝成葉酸修飾殼聚糖-量子點(diǎn)復(fù)合體。以復(fù)合體為載體，組裝抗癌藥物羥基喜樹堿，形成羥基喜樹堿-羧基CdTe量子點(diǎn)FRET突光探針體系。將該探針用于標(biāo)記治療肺癌A459細(xì)胞發(fā)現(xiàn),探針能選擇性地標(biāo)記進(jìn)入肺癌細(xì)胞，在羥基喜樹堿與肺癌細(xì)胞作用過程中，熒光圖像清晰，隨著羥基喜樹堿的釋放，量子點(diǎn)的熒光圖像逐漸恢復(fù)，其熒光強(qiáng)度逐漸從0. 2恢復(fù)至I. O。根據(jù)量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的恢復(fù)情況，很好地跟蹤了羥基喜樹堿 與肺癌細(xì)胞的作用過程，實(shí)現(xiàn)了藥物療效的原位實(shí)時動態(tài)監(jiān)控。
權(quán)利要求
1.一種殼聚糖支載輕基喜樹堿-量子點(diǎn)FRET復(fù)合探針,其特征是該復(fù)合探針包括有葉酸修飾的殼聚糖、量子點(diǎn)和抗癌藥羥基喜樹堿； 所述量子點(diǎn)為具有一定波長，能夠作為能量供體與抗癌藥羥基喜樹堿相耦合，形成具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)特性的復(fù)合探針結(jié)構(gòu)，在紫外光或可見光激發(fā)下，能與抗癌藥羥基喜樹堿發(fā)生光電轉(zhuǎn)移而發(fā)生熒光淬滅，并將激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到抗癌藥羥基喜樹堿上而表達(dá)FRET特性的一類水溶性量子點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述殼聚糖支載羥基喜樹堿-量子點(diǎn)FRET復(fù)合探針，其特征是所述殼聚糖為兩親性殼聚糖，其分子量大小為200(T4000。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述殼聚糖支載羥基喜樹堿-量子點(diǎn)FRET復(fù)合探針，其特征是所述FRET復(fù)合探針結(jié)構(gòu)中，水溶性量子點(diǎn)為能量供體，其發(fā)射波長為353 373nm。
全文摘要
本發(fā)明提供一種殼聚糖支載羥基喜樹堿-量子點(diǎn)FRET復(fù)合探針，該探針將具有一定波長的量子點(diǎn)與抗癌藥羥基喜樹堿相耦合，形成具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移特性的復(fù)合結(jié)構(gòu)，在紫外光或可見光激發(fā)下表達(dá)FRET特性的復(fù)合探針。有益效果是通過羥基喜樹堿-量子點(diǎn)FRET復(fù)合結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，將能量轉(zhuǎn)移到羥基喜樹堿上，增強(qiáng)加羥基喜樹堿熒光強(qiáng)度，使其具有與癌細(xì)胞作用的熒光原位表達(dá)特性。通過復(fù)合探針靶向投遞過程中熒光行為觀察復(fù)合探針在腫瘤癌細(xì)胞各區(qū)域的作用過程及分布規(guī)律；在羥基喜樹堿釋放并與腫瘤癌細(xì)胞作用過程中，復(fù)合探針的FRET體系遭到破壞，量子點(diǎn)的熒光逐漸恢復(fù)，通過量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度變化大小和變化速率等信息的監(jiān)控，可間接實(shí)現(xiàn)羥基喜樹堿與腫瘤癌細(xì)胞作用過程原位實(shí)時動態(tài)監(jiān)控。
文檔編號A61K31/4745GK102698294SQ201210216640
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月28日
發(fā)明者劉麗娟, 曹凌云, 費(fèi)學(xué)寧, 賈國治, 郝亞超 申請人:天津城市建設(shè)學(xué)院