專利名稱：當(dāng)歸芍藥散在制備治療肝硬化腹水藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療肝硬化腹水的藥物，具體是涉及當(dāng)歸芍藥散在制備治療肝硬化腹水藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝硬化是各種慢性肝病發(fā)展的晚期階段，是由一種或多種原因長期作用于肝臟引起的肝臟慢性、進(jìn)行性、彌漫性損害，肝細(xì)胞廣泛壞死，殘存肝細(xì)胞形成再生結(jié)節(jié)，結(jié)締組織增生及纖維化，導(dǎo)致正常肝臟結(jié)構(gòu)破壞、假小葉形成，導(dǎo)致肝功能損害和門靜脈高壓。肝硬化早期患者肝臟處于代償狀態(tài)，若不加干預(yù)即進(jìn)入失代償時期，患者生活質(zhì)量及生存率將受到極大影響。肝硬化失代償期患者約75%伴有腹水，其中約15%的患者在I年內(nèi)死亡，44%的腹水患者在2年內(nèi)死亡。
關(guān)于肝硬化腹水發(fā)生機(jī)制主要有以下三種學(xué)說經(jīng)典學(xué)說、泛溢學(xué)說以及外周血管擴(kuò)張學(xué)說。(I)經(jīng)典學(xué)說又稱充盈不足學(xué)說。主要由于血漿與腹水之間的膠體滲透壓差與門脈毛細(xì)血管與腹腔內(nèi)液體靜水壓差之間的平衡被打破所致。其機(jī)制為①血循環(huán)中血容量減少，引起腎素、醛固酮產(chǎn)生過多，水鈉潴留。②肝硬化使白蛋白合成減少，引起低蛋白血癥。③門靜脈及肝竇壓力增高，引起液體靜水壓增高。④由于肝血竇兩側(cè)壓力差增高，液體由肝竇流入Disse間隙，形成過多的淋巴液。⑤腹水形成后由于有效血容量減少，腎素、血管緊張素II、醛固酮產(chǎn)生過多，造成水鈉潴留。⑥壓力感受器興奮，去甲腎上腺素增加，交感神經(jīng)興奮，血管加壓素(AVP)增加，加重水鈉潴留。(2)泛溢學(xué)說主要是由于門脈高壓激活了血竇周圍豐富的神經(jīng)纖維和壓力感受器，增強(qiáng)肝腎神經(jīng)反射，鈉潴留，全身血容量增力口，液體由內(nèi)臟循環(huán)中漏出，形成腹水。(3)外周血管擴(kuò)張學(xué)說肝硬化患者存在嚴(yán)重的門靜脈、血竇高壓和高動力狀態(tài),表現(xiàn)為血壓下降，高血容量,高心排出量和血管阻力降低,夕卜周血管擴(kuò)張，小動靜脈短路，引起血容量和血管容量不平衡。機(jī)體反射性地出現(xiàn)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活，交感神經(jīng)興奮，血管加壓素(AVP)增加，水鈉潴留，使肝和內(nèi)臟的淋巴液產(chǎn)生過多，引起液體流入腹腔。一般認(rèn)為，肝硬化早、中期，腹水形成機(jī)制以泛溢學(xué)說為主，后期以充盈不足學(xué)說為主。精氨酸加壓素(AVP)又稱血管加壓素、抗利尿激素，由下丘腦的視上核和室旁核細(xì)胞產(chǎn)生，貯存于神經(jīng)垂體。AVP主要生理作用是增加腎臟對水的重吸收，即發(fā)揮抗利尿作用。AVP在肝硬化腹水發(fā)病中的主要作用可歸納為①肝硬化伴腹水、血漿AVP升高與無溶質(zhì)水的排出減少密切相關(guān)，AVP越高，無溶質(zhì)水排出越少；②在實(shí)驗(yàn)性肝硬化模型中，AVP分泌增加與水排出量減少相平行；③在實(shí)驗(yàn)性肝硬化模型中證實(shí)，水通道2 (即AVP調(diào)節(jié)性水通道，介導(dǎo)水從細(xì)胞小管側(cè)至毛細(xì)管側(cè)的運(yùn)輸)運(yùn)輸能力增強(qiáng)已證實(shí)先天性AVP缺失大鼠不會發(fā)生水排出障礙；⑤使用vaptans可恢復(fù)大部分肝硬化伴低鈉血癥患者腎臟排出無溶質(zhì)水的能力，糾正低鈉血癥，而中斷用藥與低鈉血癥復(fù)發(fā)相關(guān)。與之相對應(yīng)的是AVP受體拮抗劑類藥物在肝硬化腹水治療中存在其獨(dú)特的優(yōu)勢(I)使得患者可以不必嚴(yán)格限制水的攝入，從而改善患者生活質(zhì)量.(2)與常規(guī)利尿劑聯(lián)用可減少尿鈉的排出，避免低鈉血癥的出現(xiàn).(3)隨著低鈉血癥的改善，肝性腦病的發(fā)生將減少.(4)移植前改善低鈉血癥可以減少移植后中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。近年來，水通道蛋白(aquaporin，AQP)的發(fā)現(xiàn)，為研究肝硬化腹水的形成提供了新的角度，實(shí)驗(yàn)已證實(shí)機(jī)體水分子的跨膜運(yùn)動有90%是通過AQP實(shí)現(xiàn)的，僅10%是通過彌散作用實(shí)現(xiàn)的。肝腹水的發(fā)病機(jī)制可能是肝硬化時循環(huán)血容量和血管容量減少，反射性地激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，交感神經(jīng)興奮，精氨酸加壓素(AVP)分泌增多，AVP與腎臟V2受體結(jié)合，使腎臟遠(yuǎn)端小管與集合管上皮 細(xì)胞的AVP依賴性水通道-水通道蛋白2(aquaporin-2, AQP2)開放，引起腎臟集合管對水的重吸收增加、門靜脈壓力增高、繼發(fā)性醛固酮增多，腎臟對水、鈉重吸收增加，從而導(dǎo)致水鈉潴留，形成腹水。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對肝腹水的治療策略則是調(diào)節(jié)水、鈉平衡，以限鈉利尿?yàn)樵瓌t，糾正循環(huán)功能紊亂。難治性腹水常采用大量腹腔放液及擴(kuò)充血容量、自身腹水濃縮回輸、腹腔靜脈分流術(shù)、頸靜脈肝內(nèi)門體分流術(shù)及肝移植等。上述治療手段和技術(shù)雖有療效，但由于會對患者造成新的損傷及肝移植成本高等原因，存在較多弊端。有鑒于此，本發(fā)明基于中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論，從AVP和AQP等肝硬化腹水發(fā)病機(jī)制和途徑出發(fā)，提供了一種當(dāng)歸芍藥散在制備治療肝硬化腹水藥物中的應(yīng)用，在肝硬化腹水治療上表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的提供了一種當(dāng)歸芍藥散在制備治療肝硬化腹水藥物中的應(yīng)用，當(dāng)歸芍藥散能明顯降低肝硬化腹水大鼠TBIL、ALT、AST指標(biāo)，升高ALB及改善A/G比例倒置，可改善肝細(xì)胞的代謝，改善肝功能，實(shí)現(xiàn)保肝護(hù)肝；改善肝纖維化病理狀態(tài)，緩解假小葉形成，進(jìn)而防止肝硬化的形成；當(dāng)歸芍藥散通過與腎臟遠(yuǎn)曲小管、集合管V2受體結(jié)合，抑制腎臟集合管對水的重吸收；提高肝組織AQP4的表達(dá)，促進(jìn)對腹水的轉(zhuǎn)運(yùn)，減少肝硬化腹水生成，進(jìn)而達(dá)到對肝硬化腹水的治療作用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種當(dāng)歸芍藥散在制備治療肝硬化腹水藥物中的應(yīng)用，所述當(dāng)歸芍藥散是由2 4重量份當(dāng)歸、14 18重量份茍藥、6 10重量份川彎、3 5重量份白術(shù)、3 5重量份獲苓、6 10重量份澤瀉和藥學(xué)上允許的輔料加工的口服制劑。優(yōu)選的，所述當(dāng)歸芍藥散是由3重量份當(dāng)歸、16重量份芍藥、8重量份川芎、4重量份白術(shù)、4重量份茯苓、8重量份澤瀉和藥學(xué)上允許的輔料加工的口服制劑。優(yōu)選的，所述口服制劑為口服液、散劑、膠囊劑、顆粒劑或片劑。優(yōu)選的，所述輔料選自淀粉、糊精、乳糖、可壓性淀粉、微晶纖維素、無機(jī)鹽和甘露醇中的一種或多種。優(yōu)選的，所述無機(jī)鹽選自硫酸鈣、磷酸氫鈣和藥用碳酸鈣中一種或多種。當(dāng)歸芍藥散能明顯降低肝硬化腹水大鼠TBIL、ALT、AST指標(biāo)，升高ALB及改善A/G比例倒置，說明當(dāng)歸芍藥散可改善肝細(xì)胞的代謝，改善肝功能，實(shí)現(xiàn)保肝護(hù)肝；當(dāng)歸芍藥散能夠改善肝纖維化病理狀態(tài)，緩解假小葉形成，進(jìn)而防止肝硬化的形成；當(dāng)歸芍藥散通過與腎臟遠(yuǎn)曲小管、集合管V2受體結(jié)合，抑制腎臟集合管對水的重吸收；當(dāng)歸芍藥散通過提高肝組織AQP4的表達(dá)，促進(jìn)對腹水的轉(zhuǎn)運(yùn)，減少肝硬化腹水生成，進(jìn)而達(dá)到對肝硬化腹水的治療作用。


圖I是正常組大鼠肝組織HE染色10X40倍的結(jié)果圖。圖2是模型組大鼠肝組織病理學(xué)HE染色10X40倍的結(jié)果圖。圖3是陽性組大鼠肝組織病理學(xué)HE染色10X40倍的結(jié)果圖。圖4是當(dāng)歸芍藥散低劑量組大鼠肝組織病理學(xué)HE染色10X40倍的結(jié)果圖。圖5是當(dāng)歸芍藥散高劑量組大鼠肝組織病理學(xué)HE染色10X40倍的結(jié)果圖。圖6是正常組大鼠肝組織AQP4染色10X40倍的結(jié)果圖。圖7是模型組大鼠肝組織AQP4染色10 X 40倍的結(jié)果圖。圖8是當(dāng)歸芍藥散高劑量組大鼠肝組織AQP4染色10X40倍的結(jié)果圖。圖9是當(dāng)歸芍藥散低劑量組大鼠肝組織AQP4染色10X40倍的結(jié)果圖。圖10是陽性組大鼠肝組織AQP4染色10X40倍的結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。本發(fā)明所采用的當(dāng)歸、芍藥、川芎、白術(shù)、茯苓、澤瀉購自南京醫(yī)藥合肥天星醫(yī)藥公司，并符合《中華人民共和國藥典》(2010年版)項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)；四氯化碳(分析純)購自江蘇強(qiáng)盛化工有限公司；福臨門一級菜籽油購自中糧東海糧油工業(yè)有限公司；甲醛(分析純)購自上海中試化工總公司；AVP酶免試劑盒購自上海活樂生物科技有限公司；甘利欣購自江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司。本發(fā)明使用的動物是由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供的體重為220±20g的SD雄性大鼠，其合格證號為SCXK (滬)2003-0002，各組動物實(shí)驗(yàn)前均在實(shí)驗(yàn)室正常飼養(yǎng)一周(自由飲食，飲水，喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，室溫18-22°C )。本發(fā)明使用的電子天平購自北京賽多麗斯股份有限公司，型號為SartoriusBSllOS ;離心沉淀器購自上海手術(shù)器械二廠，型號為800型；島津全自動生化分析儀購自O(shè)lympus公司JE0L21230型電鏡(日本)；LKB2N0VA型切片機(jī)(瑞典)。實(shí)施例I制備藥材浸膏按照當(dāng)歸2重量份，芍藥18重量份，川芎6重量份，白術(shù)5重量份，茯苓3重量份，澤瀉10重量份和藥學(xué)上允許的輔料稱量藥材，加10倍于藥材總重量的50 %乙醇，浸 泡60min，水浴回流I. 5h，冷卻后收集濾液；再加8倍于藥材總重量的50%乙醇水浴回流I. 5h，冷卻后收集濾液。合并兩次濾液，濾過，回收乙醇至無醇味，水浴濃縮至浸膏，真空干燥，即得當(dāng)歸芍藥散。實(shí)施例2制備藥材浸膏按照當(dāng)歸3重量份，芍藥16重量份，川芎8重量份，白術(shù)4重量份，茯苓4重量份，澤瀉8重量份和藥學(xué)上允許的輔料稱量藥材，加10倍于藥材總重量的50 %乙醇，浸 泡60min，水浴回流I. 5h，冷卻后收集濾液；再加8倍于藥材總重量的50%乙醇水浴回流I. 5h，冷卻后收集濾液。合并兩次濾液，濾過，回收乙醇至無醇味，水浴濃縮至浸膏，真空干燥，即得當(dāng)歸芍藥散。實(shí)施例3制備藥材浸膏按照當(dāng)歸4重量份 ，芍藥14重量份，川芎10重量份，白術(shù)3重量份，茯苓5重量份，澤瀉6重量份和藥學(xué)上允許的輔料稱量藥材，加10倍于藥材總重量的50%乙醇，浸泡60min，水浴回流I. 5h，冷卻后收集濾液；再加8倍于藥材總重量的50%乙醇水浴回流
I.5h，冷卻后收集濾液。合并兩次濾液，濾過，回收乙醇至無醇味，水浴濃縮至浸膏，真空干燥，即得當(dāng)歸芍藥散。實(shí)施例4建立肝硬化腹水動物模型及給藥將75只雄性SD大鼠隨機(jī)分為7組正常組(10只)、模型組(20只)、當(dāng)歸芍藥散大劑量組(15只)、當(dāng)歸芍藥散小劑量組(15只)、陽性對照組(15只，甘利欣)。實(shí)驗(yàn)第一周，除正常組外，其他各組用35%苯巴比妥溶液作為飲用水誘導(dǎo)。從第二周，除正常組外，其余組均采用以下腹腔注射給藥第二周13%四氯化碳溶液，第三周16%四氯化碳溶液，第四周20%四氯化碳溶液，第五周至第十周25%四氯化碳溶液。每周腹腔注射2次，0. lmL/100g。實(shí)驗(yàn)前兩周給予復(fù)合飼料，之后給予普通飼料。本發(fā)明采用四氯化碳聯(lián)合苯巴比妥誘發(fā)肝硬化腹水模型的方法。由于苯巴比妥是肝藥酶誘導(dǎo)劑，能促進(jìn)細(xì)胞色素P450的合成，加速四氯化碳的代謝從而加重肝毒性，縮短了單純使用四氯化碳誘導(dǎo)肝硬化腹水的時間。大鼠經(jīng)35%苯巴比妥誘導(dǎo)一周后，四氯化碳油溶液腹腔注射連續(xù)10周可復(fù)制肝硬化腹水模型，且模型組腹水量、肝功能指標(biāo)較正常組差異均有顯著性差異。當(dāng)歸芍藥散低劑量組、高劑量組給藥劑量分別為3. 9g/kg、7. 8g/kg(相當(dāng)于生藥14. 8g/kg、29. 6g/kg);甘利欣26. 25mg/kg ;正常組和模型組給予等劑量蒸懼水。從建立模型第一天開始灌胃給藥，I次/天，灌胃劑量為lmL/100g，連續(xù)十周。第十周末，給藥后禁食12h,腹主動脈取血并采集肝組織標(biāo)本。實(shí)施例5指標(biāo)檢測和結(jié)果分析I、指標(biāo)檢測方法(I)腹腔積液量腹水量可用濾紙在腹腔放置前后重量之差來評估。大鼠麻醉后，腹腔剪開I. 5cm，將已稱重濾紙迅速塞入腹腔，3分鐘后濾紙充分吸收腹腔積液取出，稱濾紙重，計算腹腔積液重量。(2)血清肝功能大鼠麻醉后，腹主動脈取血，血液室溫放置30分鐘后，離心15min,轉(zhuǎn)速3500r/min，分離血清，置_20°C保存，待用全自動生化檢測儀檢測ALT、AST、TBIL、ALB和A/G相關(guān)指標(biāo)。(3)肝組織勻漿AVP含量測定從肝臟同一葉，剪取50mg肝臟，冰生理鹽水洗凈，剪碎，置勻漿器，加0. 5mL的冰生理鹽水，研磨勻漿，制成肝臟勻漿，靜置，2500r/min，4°C離心lOmin，取上清液，置于_20°C保存，酶聯(lián)免疫法測定AVP含量。(4)肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察肝臟同葉取材修剪后用10%甲醛溶液固定。制作病理石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅01E)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并攝相。(5)肝組織水通道蛋白4(AQP4)表達(dá)肝組織標(biāo)本以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 u m連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片梯度酒精洗脫后，3% H2O2孵育20min，消除內(nèi)源性過氧化氫酶活性；微波修復(fù)抗原IOmin ;滴加非免疫血清，室溫孵育20min，棄去多余血清；滴加I : 100 —抗4°c過夜，37°C復(fù)溫45分鐘，PBS洗三次每次2分鐘；滴加生物素化二抗，室溫20分鐘；PBC洗2次每次5分鐘；滴加試劑SABC，室溫20分鐘；PBS洗2次每次5分鐘；DAB顯色；蒸餾水洗，蘇木素復(fù)染2分鐘、鹽酸酒精分化；脫水、透明、封片、鏡檢。以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)有棕黃色染色為陽性細(xì)胞，所有切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，取染色良好(陽性細(xì)胞染色清晰，背景染色很低)的組織切片進(jìn)行照相，并應(yīng)用細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)測定灰度值法檢測AQP4的表達(dá)情況。(6)統(tǒng)計學(xué)處理連續(xù)型變量均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X土s)表示，采用單因素方差分析，應(yīng)用SPSS10. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。2、結(jié)果分析(I)對肝硬化大鼠腹腔積液的影響模型組與正常組比較，腹腔積液量明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0. 01)，說明四氯化碳聯(lián)合苯巴比妥誘導(dǎo)的肝硬化模型可最終形成腹水。當(dāng)歸芍藥散高劑量組、 當(dāng)歸芍藥散低劑量組、陽性組大鼠腹腔積液量較模型組均有所降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P
<0. 05)。當(dāng)歸芍藥散對肝硬化腹水模型大鼠腹腔積液的影響(7±s，n = 10)如表I所示。表I
權(quán)利要求
1.ー種當(dāng)歸芍藥散在制備治療肝硬化腹水藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述當(dāng)歸芍藥散是由2 4重量份當(dāng)歸、14 18重量份芍藥、6 10重量份川芎、3 5重量份白木、3 5重量份茯苓、6 10重量份澤瀉和藥學(xué)上允許的輔料加工的ロ服制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的當(dāng)歸芍藥散在制備治療肝硬化腹水藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述當(dāng)歸芍藥散是由3重量份當(dāng)歸、16重量份芍藥、8重量份川芎、4重量份白木、4重量份茯苓、8重量份澤瀉和藥學(xué)上允許的輔料加工的ロ服制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的當(dāng)歸芍藥散在制備治療肝硬化腹水藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述ロ服制劑為ロ服液、散劑、膠囊劑、顆粒劑或片劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的當(dāng)歸芍藥散在制備治療肝硬化腹水藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述輔料選自淀粉、糊精、乳糖、可壓性淀粉、微晶纖維素、無機(jī)鹽和甘露醇中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的當(dāng)歸芍藥散在制備治療肝硬化腹水藥物中的應(yīng)用，其特征在干所述無機(jī)鹽選自硫酸鈣、磷酸氫鈣和藥用碳酸鈣中ー種或多種。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種當(dāng)歸芍藥散在制備治療肝硬化腹水藥物中的應(yīng)用，當(dāng)歸芍藥散能明顯降低肝硬化腹水大鼠TBIL、ALT、AST指標(biāo)，升高ALB及改善A/G比例倒置，改善肝細(xì)胞的代謝，改善肝功能，實(shí)現(xiàn)保肝護(hù)肝；改善肝纖維化病理狀態(tài)，減緩假小葉形成，進(jìn)而防止肝硬化的形成；當(dāng)歸芍藥散通過與腎臟遠(yuǎn)曲小管、集合管V2受體結(jié)合，抑制腎臟集合管對水的重吸收；上調(diào)肝組織AQP4的表達(dá)，促進(jìn)對腹水的轉(zhuǎn)運(yùn)，減少肝硬化腹水生成，進(jìn)而達(dá)到對肝硬化腹水的治療作用。
文檔編號A61P7/10GK102727681SQ201210218960
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者彭代銀, 許釩, 陶春蕾 申請人:安徽中醫(yī)學(xué)院