S100鈣結(jié)合蛋白a11制備舒張氣道平滑肌藥物的新用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及蛋白藥物領(lǐng)域，具體公開了一種S100鈣結(jié)合蛋白A11在制備舒張氣道平滑肌藥物的用途及含有該蛋白的藥物制劑。本發(fā)明揭示了S100鈣結(jié)合蛋白A11舒張氣道平滑肌的新功能，S100A11能明顯舒張氣道平滑肌，降低哮喘模型大鼠的氣道阻力，起到治療哮喘的作用，可用于哮喘疾病的治療以及哮喘治療藥物的制備；以針劑或噴霧劑的形式應(yīng)用于哮喘疾病的質(zhì)量，具有使用安全、有效、穩(wěn)定等優(yōu)點。
【專利說明】S1OO鈣結(jié)合蛋白A11制備舒張氣道平滑肌藥物的新用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛋白藥物領(lǐng)域，具體公開了一種SlOO鈣結(jié)合蛋白All制備哮喘治療藥物的用途及含有該重組蛋白的哮喘治療藥物。
【背景技術(shù)】
[0002]SlOO 鈣結(jié)合蛋白 All (S100 calcium binding protein All，S100A11)是 SlOO家族重要成員之一，又被稱為SlOO 鈣結(jié)合蛋白C (S100 calcium binding protein C,S100C)、|丐平衡素(Calgizzarin)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移基因蛋白 70 (Metastatic lymph node gene70protein, MLN70)等。
[0003]SlOOAl I于1989年首次在雞砂囊平滑肌細胞中被發(fā)現(xiàn)，其單體包含N端和C端兩個EF手型基序，N端EF手序(N-terminal EF-hand)兩個單體反向平行的方式相互作用形成S100A11 二聚體，對Ca2+具有很高的親和力。在Ca2+游離狀態(tài)下，S100A11蛋白形成一個緊密的球狀結(jié)構(gòu)，功能保守；但當(dāng)Ca2+與蛋白C端結(jié)構(gòu)域結(jié)合時，可導(dǎo)致蛋白分子空間構(gòu)象發(fā)生改變，使S100A11蛋白功能域暴露，從而能與其它靶蛋白相互作用。
[0004]S100A11分布于細胞核、細胞質(zhì)甚至是細胞邊緣，能與RAGE、Annexin I等多個蛋白或因子相互作用，參與多種生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)；具體包括酶活性的調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)的調(diào)控、細胞生長和凋亡的調(diào)節(jié)。
[0005]目前研究中，對S100鈣結(jié)合蛋白All的研究多集中在腫瘤疾病方面。我們研究發(fā)現(xiàn)，S100A11具有舒張氣道平滑肌的功能，而目前國內(nèi)外尚沒有關(guān)于此功能的報道，這一新的功能可能為哮喘防治提供新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種具有舒張氣道平滑肌功能，并能治療哮喘的蛋白S100A11 (S100鈣結(jié)合蛋白All)，并將其應(yīng)用于哮喘治療藥物的制備。
[0007]本發(fā)明第一方面公開了一種S100鈣結(jié)合蛋白All (S100A11)在制備舒張氣道平滑肌藥物中的應(yīng)用。
[0008]進一步的，所述舒張氣道平滑肌藥物為哮喘治療藥物。
[0009]更進一步的，所述S100鈣結(jié)合蛋白All的氨基酸序列為:MPTETERCIE SLIAVFQKYSGKDGNSCHLS KTEFLSFMNT ELAAFTKNQK DPGVLDRMMK KLDLNSDGQL DFQEFLNLIG GLAIACHESFLQTSQKRI (SEQ ID NO:1)。
[0010]所述S100鈣結(jié)合蛋白All既可以為分離純化獲得的天然蛋白，也可以為通過基因技術(shù)生產(chǎn)的重組蛋白。
[0011]本發(fā)明經(jīng)大量的體外實驗和體內(nèi)實驗證實，重組蛋白S100A11具有舒張氣道平滑肌的功能，并應(yīng)用于哮喘病的治療，具有較好的臨床應(yīng)用前景。
[0012]本發(fā)明第二方面公開了一種舒張氣道平滑肌的藥物，包含S100鈣結(jié)合蛋白AU。
[0013]更進一步的，所述舒張氣道平滑肌的藥物為哮喘治療藥物。[0014]本發(fā)明第三方面公開了一種舒張氣道平滑肌的藥物制劑，含有安全有效量的SlOO鈣結(jié)合蛋白All，余量為藥學(xué)上可接受的載體。
[0015]藥學(xué)上可接受的載體為各種藥學(xué)上常用的輔料和/或賦形劑，包括(但不限于)糖類(如乳糖、葡萄糖和蔗糖)，淀粉(如玉米淀粉和土豆淀粉)，纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素)，黃蓍膠粉末，麥芽，明膠，滑石，固體潤滑劑(如硬脂酸和硬脂酸鎂)，硫酸鈣，植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油，多元醇(如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇)，海藻酸，乳化劑(如Tween、聚氧乙烯蓖麻油)，潤濕劑(如月桂基硫酸鈉)，著色劑，調(diào)味劑，壓片劑、穩(wěn)定劑，抗氧化劑，防腐劑，無熱原水，等滲鹽溶液和磷酸鹽緩沖液等；該載體可根據(jù)需要提高配方的穩(wěn)定性、活性及生物有效性等。
[0016]較優(yōu)的，所述SlOO鈣結(jié)合蛋白All占所述藥物制劑總質(zhì)量的0.0004%~99% 。
[0017]本發(fā)明的藥物制劑可以按照藥劑學(xué)上的通用方法制成任何常規(guī)的制劑形式。
[0018]較優(yōu)的，本發(fā)明所述藥物制劑為針劑或噴霧劑。
[0019]更優(yōu)的，所述針劑中藥學(xué)上可接受的載體選自磷酸鹽緩沖溶液或生理鹽水。
[0020]最優(yōu)的，所述磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.2~7.4。
[0021]進一步的，所述舒張氣道平滑肌藥物制劑為治療哮喘的藥物制劑。
[0022]本發(fā)明揭示了 SlOO鈣結(jié)合蛋白All舒張氣道平滑肌的新功能，S100A11能明顯舒張氣道平滑肌，降低哮喘模型大鼠的氣道阻力，起到治療哮喘的作用，可用于哮喘疾病的治療以及哮喘治療藥物的制備；具有使用安全、有效、穩(wěn)定等優(yōu)點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1:各試劑對大鼠離體氣管螺旋條張力影響的時間效應(yīng)圖
[0024]圖2:空白對照對大鼠離體氣管螺旋條張力影響的時間效應(yīng)圖
[0025]圖3:NS、BSA對大鼠離體氣管螺旋條張力影響的時間效應(yīng)圖
[0026]圖4:TB、HC對大鼠離體氣管螺旋條張力影響的時間效應(yīng)圖
[0027]圖5:S100A11_50對大鼠離體氣管螺旋條張力影響的時間效應(yīng)圖
[0028]圖6:S100A11_100對大鼠離體氣管螺旋條張力影響的時間效應(yīng)圖
[0029]圖7:S100A11_200對大鼠離體氣管螺旋條張力影響的時間效應(yīng)圖
[0030]圖8 =SlOOAl 1_400對大鼠離體氣管螺旋條張力影響的時間效應(yīng)圖
[0031]圖9:S100A11_800對大鼠離體氣管螺旋條張力影響的時間效應(yīng)圖
[0032]圖10:各試劑對哮喘大鼠氣道阻力影響的時間效應(yīng)圖
[0033]圖11:空白對照對哮喘大鼠氣道阻力影響的時間效應(yīng)圖
[0034]圖12:NS對哮喘大鼠氣道阻力影響的時間效應(yīng)圖
[0035]圖13:TB、HC對哮喘大鼠氣道阻力影響的時間效應(yīng)圖
[0036]圖14:S100All_lng/kg對哮喘大鼠氣道阻力影響的時間效應(yīng)圖
[0037]圖15:S100All_10ng/kg對哮喘大鼠氣道阻力影響的時間效應(yīng)圖
[0038]圖16:S100All_100ng/kg對哮喘大鼠氣道阻力影響的時間效應(yīng)圖
[0039]圖17:S100All_1000ng/kg對哮喘大鼠氣道阻力影響的時間效應(yīng)圖
[0040]圖18:各試劑對哮喘大鼠氣道阻力影響的效應(yīng)圖【具體實施方式】
[0041]在進一步描述本發(fā)明【具體實施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍。
[0042]當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本【技術(shù)領(lǐng)域】技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。
[0043]除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見SambiOOk等 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring HarborLaboratory Press,1989 and Third edition,2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York,1987 and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY, Academic Press, San Diego ；ffolffe, CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego,1998 ；METH0DSIN ENZYM0L0GY, Vol.304, Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.ffolffe, eds.), AcademicPress, San Diego,1999 ；和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119, ChromatinProtocols (P.B.Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999 等。
[0044]實施例1離體組織實驗
[0045]1.實驗材料`
[0046]1.1實驗對象
[0047]離體的鼠支氣管平滑肌螺旋條
[0048]支氣管螺旋條的制備:1%戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉大鼠后，分離氣管，按文獻記載的方法制成寬約5mm、長15mm的螺旋條，懸掛于含克_亨氏液浴槽中，通以95%02+5%C02的氣體以保持溶液中Po2 > 53.3kPa，維持37°C恒溫。氣管螺旋條連接于張力換能器，用生理記錄儀記錄張力變化。實驗前氣管條均在1.5g初張力下平衡Ih,用Ach(8mg/ml)預(yù)收縮氣管條2~3次，以達到最大收縮，新鮮K-H液沖冼、平衡后再進行實驗。整個實驗過程中每20min更換新鮮K-H液I次。
[0049]1.2實驗試劑
[0050]將S100A11 蛋白(基因序列號:ΝΜ_001004095，蛋白序列號 NP_001004095.1 ；S100A11 蛋白的制備可參考文獻 Chang N, Sutherland C，Hesse E, Winkfein R, WiehlerWB,Pho M, Veillette C，Li S,WiI son DP,Kiss E et al:1dentification of anovel interaction between the Ca (2+)-binding protein SlOOAl I and theCa(2+)-and phospholipid-binding protein annexin A6.Am J Physiol Cell Physiol2007, 292(4):C1417_1430.)用 pH 7.4 的 PBS 緩沖溶液配置濃度分別為 50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml 的試劑備用。
[0051]2.實驗方法
[0052]氣管條經(jīng)平衡后，分別在浴槽中加入不同劑量的陰性對照試劑(生理鹽水)、陽性對照藥物(特布他林、氫化可的松)或不同劑量(50ng/ml, 100ng/ml, 200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml)的SlOO鈣結(jié)合蛋白All試劑，檢測氣管螺旋條的張力變化。
[0053]離體實驗方法具體分為以下11組:
[0054](I)空白對照組(Blank):不予任何處理。
[0055](2)乙酰膽堿組(Ach) (8mg/ml):僅加入乙酰膽堿刺激支氣管平滑肌螺旋條收縮。
[0056](3)生理鹽水組(NS):加入Ach刺激約1.5min后，加入生理鹽水。
[0057](4)特布他林組(TB) (1.25 μ g/ml):加入Ach刺激約1.5min后,加入特布他林。
[0058](5)氫化可的松組(HC) (1.0 μ g/ml):加入Ach刺激約1.5min后，加入氫化可的松。
[0059](6)牛血清白蛋白組(BSA) (400ng/ml):加入Ach刺激約1.5min后,加入牛血清
白蛋白。
[0060](7) SlOOAl l_50ng/ml 蛋白組(S100_50):加入 Ach 刺激約 1.5min 后，加入S100A11。
[0061](8) SlOOAl l_`100ng/ml 蛋白組(S100_100):加入 Ach 刺激約 1.5min 后，加入S100A11。
[0062](9) SlOOAl l_200ng/ml 蛋白組(S100_200):加入 Ach 刺激約 1.5min 后，加入S100A11。
[0063](10) SlOOAl l_400ng/ml 蛋白組(S100_400):加入 Ach 刺激約 1.5min 后，加入S100A11。
[0064](11) SlOOAl l_800ng/ml 蛋白組(S100_800):加入 Ach 刺激約 1.5min 后，加入S100A11。
[0065]3.實驗結(jié)果
[0066]由圖1 可知，S100A11_100、S100A11_200 和 S100A11_400 在第 I~IOmin 均能明顯降低Ach刺激的大鼠氣管螺旋條張力(P均〈0.05)，特布他林(TB)和氫化可的松(HC)在f IOmin內(nèi)能明顯降低Ach刺激的大鼠氣管螺旋條張力(P均〈0.05)。
[0067]以f IOmin氣管螺旋條張力改變值之和反映各組總張力，比較各處理組對Ach刺激的氣管螺旋條張力影響的劑量效應(yīng)，實驗結(jié)果見圖2-9，與Ach組相比，TB、HC、S100A11_100、S100A11_200、SlOOAl 1_400組氣管螺旋條總張力明顯降低(P均〈0.05)，其中400ng/ml劑量降低張力作用最為明顯。在5(T800ng/ml劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性(F=6.614，P=0.001)，其中5(T400ng/ml區(qū)間呈一定的線性劑量依賴趨勢(F=2.086，P=0.16, R=0.263,P=0.16)。
[0068]本發(fā)明的重組蛋白試劑與特布他林(TB)組和氫化可的松組相比，S100A11_100、S100A11_200、S100A11_400組降低大鼠氣管螺旋條張力的效應(yīng)分別相當(dāng)于TB的30%、40%和47%,相當(dāng)于 HC 的 56%、74% 和 89%。
[0069]因此，實施例1實驗結(jié)果顯示，重組蛋白S100A11能明顯舒張氣道平滑肌，降低Ach刺激的大鼠氣管螺旋條張力，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)；其中，重組蛋白S100A11在400ng/ml的效應(yīng)最為明顯。
[0070]實施例2動物實驗
[0071]1.實驗材料
[0072]1.1實驗對象
[0073]SD大鼠，雄性，4周齡，體重100~120g。
[0074]1.2實驗試劑
[0075]DS100A11蛋白試劑的制備:用pH 7.4的PBS緩沖溶液配置濃度為1000ng/ml的SlOOAlI試劑備用。[0076]2) OVA試劑的制備:腹腔注射致敏液為含有Img OVA和IOmgAl (OH) 3的生理鹽水lml，每只大鼠腹腔注射1ml。激發(fā)液為0.5%0VA,生理鹽水為溶劑，按5mg/kg劑量頸外靜脈注射激發(fā)。
[0077]3)其他試劑均采用分析純的藥物用去離子水配置獲得。
[0078]2.實驗方法
[0079]2.1哮喘模型的制備
[0080]卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏SD大鼠，14天后對SD大鼠進行OVA頸外靜脈激發(fā)。
[0081]2.2實驗組的制備
[0082]卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏SD大鼠，14天后對SD大鼠進行OVA頸外靜脈激發(fā)；激發(fā)前10分鐘，將陰性對照試劑(生理鹽水)、陽性對照藥物(特布他林、氫化可的松)或不同劑量(lng/kg, 10ng/kg, 100ng/kg, 1000ng/kg)的SlOOAl I蛋白頸外靜脈注射入大鼠體內(nèi)，隨后OVA激發(fā)，檢測大鼠呼吸功能。
[0083]動物實驗具體分為以下9組，每組10個平行。
[0084](I)空白對照組(Blank):首次不做特殊處理，2周后頸外靜脈注射OVA激發(fā)。
[0085](2)哮喘模型對照組(AS):首次用含有ImgOVA和IOmg氫氧化鋁的生理鹽水Iml腹腔注射致敏，2周后頸外靜脈注射0.5%0VA激發(fā)(5mg/kg)。
[0086](3)哮喘模型生理鹽水組(NS):首次用OVA腹腔注射致敏，2周后頸外靜脈注射NS，劑量為lml/Kg，IOmin后OVA激發(fā)。
[0087](4)哮喘模型特布他林組(TB):首次用OVA腹腔注射致敏，2周后頸外靜脈注射TB，劑量為55 μ g/kg，IOmin后OVA激發(fā)。
[0088](5)哮喘模型氫化可的松組(HC):首次用OVA腹腔注射致敏，2周后頸外靜脈注射HC，劑量為 15mg/Kg，IOmin 后 OVA 激發(fā)。
[0089](6)哮喘模型S100A1 l_lng/kg蛋白組(S100A11_1):首次用OVA腹腔注射致敏，2周后頸外靜脈注射S100A11蛋白，劑量為lng/kg，IOmin后OVA激發(fā)。
[0090](7)哮喘模型S100A1 l_10ng/kg蛋白組(S100A11_10):首次用OVA腹腔注射致敏，2周后頸外靜脈注射S100A11蛋白，劑量為10ng/kg，10min后OVA激發(fā)。
[0091](8)哮喘模型S100All_100ng/kg蛋白組(S100A11_100):首次用OVA腹腔注射致敏，2周后頸外靜脈注射S100A11蛋白，劑量為100ng/kg，IOmin后OVA激發(fā)。
[0092](9)哮喘模型 S100All_1000ng/kg 蛋白組(S100A11_1000):首次用 OVA 腹腔注射致敏，2周后頸外靜脈注射S100A11蛋白，劑量為1000ng/kg，10min后OVA激發(fā)。
[0093]3.實驗結(jié)果[0094]由圖 14-17 可知，S100A11_1、S100A11_10、S100A11_100 和 S100A11_1000 分別在第2min、第3~5min、第3~5和7min、第4~5和7min能明顯降低哮喘大鼠氣道阻力(P均〈0.05)。由圖13可知，特布他林(TB)和氫化可的松(HC)分別在第2~5min和第2~4min能明顯降低哮喘大鼠氣道阻力(P均〈0.05)。
[0095]以O(shè)VA激發(fā)哮喘后2~4min的峰值氣道阻力之和反映各組最大氣道阻力，比較各處理組對哮喘大鼠氣道阻力影響的劑量效應(yīng)，實驗結(jié)果見圖18:與AS組相比，TB、HC、S100A11_10、S100A11_100、S100A11_1000 組的最大氣道阻力均明顯降低(P 均〈0.01)；在I~1000ng/kg劑量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)一定的劑量依賴趨勢(F=2.792，P=0.059 )，其中，1000ng/kg 劑量降低氣道阻力作用最為明顯。S100A11_10、S100A11_100、S100A11_1000組均較SlOOAl 1_1組的最大氣道阻力明顯降低(P均〈0.05)，在f 1000ng/kg區(qū)間呈現(xiàn)明顯的線性依賴關(guān)系(F=6.324，Ρ=0.018，R=0.417，Ρ=0.018)，S100A11_1、S100A11_10、SlOOAl 1_100和S100A11_1000組降低哮喘大鼠氣道阻力的效應(yīng)分別相當(dāng)于TB組降低哮喘大鼠氣道阻力效應(yīng)的50%、72%、74%和81%，相當(dāng)于HC組效應(yīng)的58%、84%、86%和94%。
[0096]因此，實施例2實驗結(jié)果顯示，S100A11能明顯舒張氣道平滑肌，降低哮喘模型大鼠的氣道阻力，并呈現(xiàn)一 定的劑量依賴趨勢，S100A11在1000ng/kg的效應(yīng)最為明顯。
【權(quán)利要求】
1.一種SlOO鈣結(jié)合蛋白All在制備舒張氣道平滑肌藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述舒張氣道平滑肌藥物為哮喘治療藥物。
3.如權(quán)利要求1或2任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，所述SlOO鈣結(jié)合蛋白AlI的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.一種舒張氣道平滑肌的藥物，包含SlOO鈣結(jié)合蛋白AU。
5.一種舒張氣道平滑肌的藥物制劑，含有安全有效量的SlOO鈣結(jié)合蛋白All，余量為藥學(xué)上可接受的載體。
6.如權(quán)利要求5所述的藥物制劑，其特征在于，所述SlOO鈣結(jié)合蛋白All占所述藥物制劑總質(zhì)量的0.0004%~99%。
7.如權(quán)利要求5所述的藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑為針劑或噴霧劑。
8.如權(quán)利要求7所述的藥物制劑，其特征在于，所述針劑中藥學(xué)上可接受的載體選自磷酸緩沖溶液或生理鹽水。
9.如權(quán)利要求8所述的藥物制劑，其特征在于，所述磷酸緩沖溶液pH值為7.2~7.4。
10.權(quán)利要求5-9任一權(quán)利要求所述的藥物制劑，其特征在于，所述舒張氣道平滑肌藥物制劑為治療哮喘的藥物制劑。
【文檔編號】A61P11/06GK103505719SQ201210219888
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月28日
【發(fā)明者】楊永清, 劉曉燕, 魏穎, 徐玉東, 王宇, 尹磊淼 申請人:上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所