專利名稱：重組促紅細(xì)胞生成素及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組促紅細(xì)胞生成素及制備方法，具體涉及化學(xué)修飾的重組促紅細(xì)胞生成素及制備方法。
背景技術(shù)：
促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin)也稱促紅素,英文簡稱ΕΡ0,是一種糖蛋白激素，其主要的生理功能是刺激骨髓紅細(xì)胞前體細(xì)胞的分化與增殖，因此EPO被認(rèn)為是促進(jìn)紅細(xì)胞的產(chǎn)生并能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)的紅細(xì)胞總量在最適宜水平的主要調(diào)節(jié)因子。天然人促紅細(xì)胞生成素(hEPO)是一種主要由腎臟合成并分泌的糖蛋白激素。當(dāng)腎臟功能衰竭時(shí)，EPO就無法正常合成，因而導(dǎo)致紅細(xì)胞生成數(shù)量的減少，即造成貧血。貧血是慢性腎病的常見癥狀之一，以前對(duì)于慢性腎病引起的貧血沒有有效的預(yù)防和治療措施，基本上只能是通過輸血來暫時(shí)緩解癥狀。

隨著現(xiàn)代基因技術(shù)的發(fā)展，1984年重組人促紅素(r-HuEPO)首次研究成功并廣泛應(yīng)用于臨床，大大加速了人們對(duì)促紅素的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究，并為腎性貧血病患者提供了新的醫(yī)療途徑。現(xiàn)有的研究表明促紅素的作用要比以前所認(rèn)識(shí)到的廣泛，它不僅適用于慢性腎功能衰竭導(dǎo)致的貧血、惡性腫瘤或化療導(dǎo)致的貧血、失血后貧血和艾滋病引起的貧血等，還可以降低病人對(duì)輸血的需求，減少艾滋病以及病毒性肝炎等通過血液制品傳播疾病的發(fā)生幾率。目前，越來越多得貧血患者在接受EPO治療。目前醫(yī)藥市場上的促紅素產(chǎn)品以第一代重組促紅素為主，主要在中華豚鼠細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和然后純化。而第一代重組促紅素，因其血漿半衰期較短以及對(duì)蛋白酶降解的敏感性，其在體內(nèi)的生物利用度較低。針對(duì)第一代產(chǎn)品的缺陷，目前已經(jīng)開發(fā)出第二代重組促紅素產(chǎn)品(以羅氏制藥(Roche)開發(fā)出來的CERA為代表)，即經(jīng)聚乙二醇(PEG)修飾的重組促紅素。聚乙二醇(PEG)的非抗原性水溶性聚合物常被運(yùn)用到治療和診斷有重大意義的多肽的共價(jià)修飾上。例如PEG共價(jià)連接到白介素、干擾素等治療性多肽上，已經(jīng)報(bào)道PEG的共價(jià)修飾可以延長這些治療性多肽在體內(nèi)的半衰期、和/或降低它們的免疫原性和抗原性。同樣的，PEG的共價(jià)修飾也適用于重組促紅素。臨床實(shí)驗(yàn)也證明了，將無體內(nèi)活性或生物利用度較低的重組促紅素經(jīng)聚乙二醇共價(jià)修飾，可以獲得具有體內(nèi)促紅細(xì)胞生產(chǎn)活性的重組促紅素產(chǎn)品，該產(chǎn)品的半衰期是第一代重組促紅素產(chǎn)品的16倍以上。除了 PEG以外，其他的聚環(huán)氧烷(非抗原性水溶性聚合物)也能用于修飾重組促紅素，起到延長血漿半衰期的作用。到目前為止，已經(jīng)公開了重組促紅素的多種類型的聚乙二醇化學(xué)修飾方法，例如W094/28024公開了一種具有促紅細(xì)胞生成素活性的糖修飾的PEG綴合物，其中PEG與rEPO的被氧化的糖鏈連接，在PEG化學(xué)修飾方法中，A)若只是采用純化學(xué)的方法綴合到PEG上(例如羅氏制藥的CERA是通過對(duì)重組促紅素內(nèi)的自由氨基進(jìn)行PEG化學(xué)修飾)，這類方法通常都存在選擇性差(無法定向和/或特異性修飾)，以及反應(yīng)條件惡劣等缺陷；B)采用PEG對(duì)重組促紅素的被氧化的糖基進(jìn)行共價(jià)修飾，由于共價(jià)修飾前涉及到糖基化以及糖基氧化的步驟，這類方法同樣存在選擇性差、反應(yīng)不完全的缺陷。WO 90/12874中公開了單甲氧基-PEG-EPO(mPEG-EPO)的制備方法，其中EPO內(nèi)通過基因工程手段導(dǎo)入了一個(gè)半胱氨酸殘基，再將特定的PEG試劑共價(jià)連接到該殘基上。將非天然氨基酸用基因編入法引入蛋白質(zhì)是實(shí)現(xiàn)在單氨基酸殘基水平上選擇性標(biāo)記蛋白質(zhì)的一種非常有效的方法，該方法利用一琥珀型抑制因子tRNA(tRNAraA)通讀一個(gè)存在于mRNA讀碼框內(nèi)的琥珀型終止密碼子(UAG)，在此過程中，氨?；鵢tRNA合成酶對(duì)該tRNA進(jìn)行了非天然氨基酸酰化，該體系與發(fā)現(xiàn)于一些產(chǎn)(甲)烷古生菌和一種革蘭氏陽性菌(Desulfitobacterium hafniense)細(xì)胞內(nèi)天然進(jìn)行的卩比咯賴氨酸(Pyl)引入機(jī)制相同，在這些生物細(xì)胞內(nèi)，一個(gè)讀碼框內(nèi)的琥珀密碼子對(duì)Pyl進(jìn)行共同翻譯并插入蛋白質(zhì)中，這一琥珀密碼子被一類具有CUA反密碼子并且由吡咯賴氨?；滨；?tRNA合成酶(PylRS)進(jìn)行Pyl?；腜yl琥珀型抑制因子tRNA(pylT)所抑制，這些生物體內(nèi)的PylRS-pylT配對(duì)體與細(xì)胞內(nèi)其他類型的合成酶-tRNA配對(duì)體正交，即無相互作用，因此該配對(duì)體只針對(duì)Pyl以確保精確引入Pyl。與Pyl引入機(jī)制類似，特定的氨?；?tRNA合成酶可以將非天然氨基酸特定連接到其同源tRNAo^上,形成正交的合成酶-tRNA·配對(duì)體，當(dāng)這一合成酶-tRNAo^配對(duì)體在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，非天然氨基酸在琥珀密碼子處被高效、精確地定點(diǎn)引入到蛋白質(zhì)中。這一方法可在細(xì)菌、酵母、及哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)將多種非天然氨基酸定點(diǎn)引入蛋白質(zhì)，并用以研究大量生物學(xué)課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明引入了兩種非天然氨基酸，4-乙酰苯丙氨酸(AcF)和2-氨基-8-羰基壬酸(KetoK)，均包含功能性酮基，引入這兩類非天然氨基酸可用于蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾。本發(fā)明將這兩類非天然氨基酸引入促紅細(xì)胞生成素(EPO)基因，并成功用于促紅細(xì)胞生成素與帶有羥胺基的20K聚乙二醇(PEG)的共價(jià)連接。

本發(fā)明提供了兩種化學(xué)修飾的重組促紅細(xì)胞生成素，在第一種重組促紅細(xì)胞生成素中，第65位和/或第152位的氨基酸殘基為4-乙酰苯丙氨酰殘基，至少一個(gè)4-乙酰苯丙氨酰殘基上共價(jià)連接了聚乙二醇；在第二種重組促紅細(xì)胞生成素中，第65位和/或第152位的氨基酸殘基為2-氨-8-氧代壬酰殘基，至少一個(gè)2-氨-8-氧代壬酰殘基上共價(jià)連接
了聚乙二醇。本發(fā)明還提供了上述化學(xué)修飾的重組促紅細(xì)胞生成素的制備方法，該方法采用基因工程技術(shù)時(shí)促紅素進(jìn)行重組，在促紅細(xì)胞生成素的第65位和/或第152位上引入具有化學(xué)活潑酮基的氨基酸殘基，該氨基酸殘基為4-乙酰苯丙氨酰殘基或2-氨-8-氧代壬酰殘基，然后用聚乙二醇對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行化學(xué)修飾，聚乙二醇特異性地與4-乙酰苯丙氨酰殘基或2-氨-8-氧代壬酰殘基反應(yīng)，反應(yīng)完全且不與其他氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)，所需要的反應(yīng)條件較溫和，解決了現(xiàn)有技術(shù)中選擇性差、反應(yīng)條件惡劣的問題。用來化學(xué)修飾4-乙酰苯丙氨酰殘基或2-氨-8-氧代壬酰殘基的聚乙二醇是一類親水聚合物，優(yōu)選地，羥氨基或聯(lián)氨基取代的聚乙二醇，這類聚乙二醇可以更特異地與4-乙酰苯丙氨酰殘基或2-氨-8-氧代壬酰殘基上的化學(xué)活潑的酮基反應(yīng)，反應(yīng)更完全，所需的反應(yīng)條件很溫和，一般只需要在生理?xiàng)l件下反應(yīng)即可。具有4-乙酰苯丙氨酰殘基的重組促紅細(xì)胞生成素的制備方法包括(I)構(gòu)建含有編碼4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因、琥珀突變抑制tRNA基因、在第65位和/或第152位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細(xì)胞生成素基因的重組表達(dá)載體，編碼4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因序列如SEQ ID No. 2所述，琥珀突變抑制tRNA基因序列如SEQ ID No.1所述，在第65位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細(xì)胞生成素基因序列如SEQID No. 3所述，在第152位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細(xì)胞生成素基因序列如SEQ ID No. 4所述；(2)將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞并從中分離得到在第65位和/或第152位具有4-乙酰苯丙氨酰殘基的重組促紅細(xì)胞生成素；(3)采用聚乙二醇對(duì)分離得到的所述重組促紅細(xì)胞生成素上的至少一個(gè)4-乙酰苯丙氨酰殘基進(jìn)行化學(xué)修飾。在一種具體實(shí)施方式
中,所述重組表達(dá)載體為重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS-EPOtte,所述宿主細(xì)胞為將含有編碼4_乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因、琥珀突變抑制tRNA基因、在第65位和/或第152位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細(xì)胞生成素基因的重組表達(dá)載體穩(wěn)定整合到CHO細(xì)胞染色體的CHO細(xì)胞。CHO細(xì)胞的全稱為中國倉鼠卵巢細(xì)胞。類似地，具有2-氨-8-氧代壬酰殘基的重組促紅細(xì)胞生成素的制備方法包括(I)構(gòu)建含有編碼2-氨-8-氧代壬酰-tRNA合成酶基因、琥珀突變抑制tRNA基因、在第65位和/或第152位 發(fā)生琥珀無義突變的促紅細(xì)胞生成素基因的重組表達(dá)載體，編碼2-氨-8-氧代壬酰-tRNA合成酶基因序列如SEQ ID No. 6所述，琥珀突變抑制tRNA基因序列如SEQ ID No. 5所述，在第65位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細(xì)胞生成素基因序列如SEQ ID No. 3所述，在第152位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細(xì)胞生成素基因序列如SEQ IDNo. 4所述；(2)將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞并從中分離得到在第65位和/或第152位具有2-氨-8-氧代壬酰殘基的重組促紅細(xì)胞生成素；(3)采用聚乙二醇對(duì)分離得到的所述重組促紅細(xì)胞生成素上的至少一個(gè)
2-氨-8-氧代壬酰殘基進(jìn)行化學(xué)修飾。在一種具體實(shí)施方式
中，所述重組表達(dá)載體為重組質(zhì)粒pcDNA3. l-pylT-KeoKRS-EPOTAG,所述宿主細(xì)胞為將含有編碼2_氨_8_氧代壬酰-tRNA合成酶基因、琥珀突變抑制tRNA基因、在第65位和/或第152位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細(xì)胞生成素基因的重組表達(dá)載體穩(wěn)定整合到CHO細(xì)胞染色體的CHO細(xì)胞。重組促紅細(xì)胞生成素的制備方法是利用琥珀密碼子無義抑制的方法在促紅細(xì)胞生成素中弓I入特定的氨基酸殘基，該氨基酸殘基為4-乙酰苯丙氨酰殘基或2-氨-8-氧代壬酰殘基，首先在促紅素的原始基因序列中合適的位點(diǎn)(第65位和/或第152位)制造至少一個(gè)琥珀無義突變，并在促紅素的表達(dá)載體中引入合適的琥珀突變抑制tRNA的基因序列和氨?；?tRNA合成酶的基因序列，然后，當(dāng)表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，發(fā)生了琥珀無義突變的位置翻譯成上述特定的氨基酸殘基，從而成功在促紅素中引入4-乙酰苯丙氨酰殘基或2-氨-8-氧代壬酰殘基。
本發(fā)明還提供了化學(xué)修飾的重組促紅細(xì)胞生成素在制備治療貧血藥物中的用途。PEG-EPO綴合物比天然EPO有更好的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征和更高的活性。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其中，該組合物包含化學(xué)修飾的重組促紅細(xì)胞生成素和藥學(xué)上可以接受的載體。本發(fā)明的重組促紅細(xì)胞生成素優(yōu)選哺乳動(dòng)物或人源化的重組促紅細(xì)胞生成素，更優(yōu)選人源化的重組促紅細(xì)胞生成素。


圖1是pKetoAmber_EP065TAG重組表達(dá)質(zhì)粒圖譜；圖2 是 pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS-EPO 重組表達(dá)質(zhì)粒圖譜；圖3 是 pcDNA3.1-pyl T-KeoKRS-EPO 重組表達(dá)質(zhì)粒圖譜；圖4是帶有羥氨基的聚乙二醇對(duì)本發(fā)明的重組促紅素進(jìn)行化學(xué)修飾的反應(yīng)式；圖5是未修飾重組促紅素與聚乙二醇修飾后的促紅素(EP0(AcF65))的SDS膠體電泳圖；圖6是未假飾重組促紅素與聚乙二醇修飾后的促紅素(EP0(AcF152))的SDS膠體電泳圖；圖7是未修飾重組促紅素與聚乙二醇修飾后的促紅素(EP0(KetoK65))的SDS膠體電泳圖；圖8是未修飾重組促紅素與聚乙二醇修飾后的促紅素(EP0(KetoK152))的SDS膠體電泳圖；圖9是天然促紅素 和聚乙二醇修飾后的重組促紅素在不同時(shí)間點(diǎn)在血液中的含量變化圖；圖10是注射天然促紅素和聚乙二醇修飾后的重組促紅素后血細(xì)胞比容值隨時(shí)間的變化圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一聚乙二醇化學(xué)修飾在第65位和/或第152位上帶有4_乙酰苯丙氨酰殘基的重組促紅細(xì)胞生成素(I)獲得在第65位和/或第152位上帶有4_乙酰苯丙氨酰殘基的重組促紅細(xì)胞生成素(Ia)重組表達(dá)載體的構(gòu)建一種方法參見圖1，首先，在體外構(gòu)建4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因的表達(dá)載體(PKeto)，即擴(kuò)增合成含有編碼4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶的基因(該基因序列參見SEQ ID No. 2)的DNA片段，將獲得的該DNA片段利用特異性的酶切位點(diǎn)導(dǎo)入合適的載體中，獲得含有編碼4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶的基因的表達(dá)載體。可以用一個(gè)帶有XbaI酶切位點(diǎn)的引物和一個(gè)帶有ApaI酶切位點(diǎn)的引物，利用PCR擴(kuò)增出帶有KetoRS (基因序列為圖3所示的SEQ ID No. 2)的DNA片斷，并進(jìn)過瓊脂糖電泳進(jìn)行分離，膠回收，得到純化的DNA片斷；再將該DNA片斷用XbaI和ApaI酶切后連接到pcDNA3. 1(+)(美國Invitrogen公司)的XbaI和ApaI位點(diǎn)之間；再將連接好的載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ToplO中，利用氨芐青霉素進(jìn)打篩選，最后提取質(zhì)粒，即表達(dá)載體pKeto (通過測序確認(rèn)表達(dá)載體pKeto的DNA序列)；然后，在體外構(gòu)建含有編碼4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶和琥珀突變抑制tRNA的基因的表達(dá)載體(pKetoAmber)，即擴(kuò)增合成含有編碼tRNACUA基因(該基因的序列參見SEQ ID No.1)的DNA片段，將獲得的該DNA片段利用特異性的酶切位點(diǎn)導(dǎo)入到上述的表達(dá)載體pKeto中。擴(kuò)增合成含有編碼tRNAeuA基因(該基因的序列參見SEQ ID No.1)的三聯(lián)體DNA片段將含有一個(gè)tRNAraA基因序列的DNA片段、四條多聚脫氧核酸鏈、含有人tRNATiT基因啟動(dòng)子的DNA片段通過PCR方法依次連接，四條多聚脫氧核酸鏈，按連接次序依次為鏈1:GCAACGGAATTCAGCGCTCCGGTTTTTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACAC ；鏈2 GCCACTTCGCTACCCCTCCGACGTGTACGTGTGTCGGCGTCCCCTGAGGT ；鏈3 CGGAGGGGTAGCGAAGTGGCTAAACGCGGCGGACTCTAAATCCGCTCCCT ；

鏈4 GCAACGGGATCCTGGAGGGGGACGGATTCGAACCGCCGAACCCAAAGGGAGCGGATTTAGAGTCC。連接完成后，利用EcoRI合BamHI酶切后連接到pUC18表達(dá)質(zhì)粒中形成pUC18-1tRNAcm 采用PCR的方法，利用帶有BglII和BamHI酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增pUClS-tRNA 中的含有一個(gè)tRNAraA基因序列的DNA片段和人tRNAT!T基因啟動(dòng)子的DNA片段，再用BglII和BamHI酶切后連接到pUC18-tRNAeuA的BamHI位點(diǎn)內(nèi)形成pUC18_2tRNACUA ；采用PCR的方法，利用帶有BglII和BamHl酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增pUClS-tRNA 中的含有兩個(gè)tRNAeuA基因序列的DNA片段和人tRNAT!T基因啟動(dòng)子的DNA片段，再用BglII和BamHI酶切后連接到pUC18-2tRNAeuA的BamHI位點(diǎn)內(nèi)形成pUC18_3tRNACUA ；采用PCR的方法，利用帶有BglII和EcoRI酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增pUClS-StRNA·中的的含有編碼tRNAeuA基因的三聯(lián)體DNA片段(3tRNAeuA)，再用BglII和EcoRI酶切純化后連接到表達(dá)載體pKeto的BglII和MfeI位點(diǎn)內(nèi)形成表達(dá)載體pKetoAmber。之后，再體外構(gòu)建含有編碼4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶、琥珀突變抑制tRNA和包含至少一個(gè)琥珀無義突變的促紅素的基因的表達(dá)載體(PKetoAmber-EPOTAG)JP :先構(gòu)建帶有人類野生型促紅素EPO的表達(dá)載體，利用定點(diǎn)突變?cè)噭┖袑?duì)該表達(dá)載體進(jìn)行處理，得到帶有人促紅素基因突變體EP065TAG(EP0基因中第65位的密碼子突變成TAG, SEQ ID No. 3)表達(dá)載體，再從該表達(dá)載體中擴(kuò)增出EP065TAG以及相應(yīng)的啟動(dòng)子和終止子DNA片段,并利用合適的酶切位點(diǎn)導(dǎo)入到上述的表達(dá)載體pKetoAmber中形成表達(dá)載體pKetoAmber-EP065TAG。首先可以采用PCR方法，利用帶有XbaI和ApaI酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增出人類野生型促紅素，再用XbaI和ApaI酶切后連接到pcDNA4/T0/Myc HisA表達(dá)載體內(nèi)形成pcDNA4-EP0 ；然后用快速點(diǎn)突變?cè)噭┖?美國Stratagene公司)和兩個(gè)引物GCTTGAATGAGTAGATCACTGTCCCAGAC 和 gtctgggacagtgatctactcattcaagc 合成表達(dá)載體pcDNA4-EP065TAG，該表達(dá)載體中的EPO基因中第65位發(fā)生琥珀無義突變(EP065TAG的序列參見SEQ ID No. 3)，在65位的天門冬酰胺被突變?yōu)門AG琥珀無義密碼子)；采用PCR方法，利用帶有BamHI和Bgl 11酶切位點(diǎn)的引物來擴(kuò)增pcDNA4_EP065TAG中的EP065TAG基因、以及帶有兩倍Tet02位點(diǎn)的啟動(dòng)子和BGH pA終止子的DNA片斷，最后用BamHI和BglII酶切純化后連接到pKetoAmber的BglII位點(diǎn)內(nèi)形成pKetoAmber_EP065TAG,如圖1所示。另外一種方法參見圖2，首先，將雙螺旋多聚核苷酸U6-EctRNACUATylr-BamH1-BglII (訂購自EpochBiolabs)(序列為SEQ ID No. 7)用內(nèi)切酶BamH1、BglII酶切后，插入質(zhì)粒pcDNA3.1/hygro (+)的 BglII 位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒 pcDNA3. 1-EctRNAtyr, EctRNAtyr 的序列為 SEQ IDNo.1 ；然后，使用AcFRS-Apa1-R (序列為 SEQ ID No. 8)和 AcFRS-Xbal-F (序列為 SEQ IDNo. 9)作為引物對(duì)AcFRS(4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶)(序列為SEQ ID No. 2)(來自PSffAN-AcFRS7)進(jìn)行擴(kuò)增，隨后用內(nèi)切酶Xba1、ApaI酶切；然后，將上述用內(nèi)切酶Xbal、ApaI酶切的產(chǎn)物插入重組質(zhì)粒pcDNA3. 1-EctRNAtyr,插入位點(diǎn)為 Xbal、ApaI,所得質(zhì)粒 pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS 含有U6-EctRNACUATyr 和 AcFRS 序列；之后，利用內(nèi)切酶Xbal、ApaI 對(duì) EPO-Xba1-ApaI (序列為 SEQ ID No. 10)(訂購自Epoch B iolabs)進(jìn)行酶切，后插入質(zhì)粒pcDNA3. 1/hygro (+),然后用CMV-BamH1-F (序列為 SEQ ID No. 11)、BGH-BglI1-R (序列為 SEQ ID No. 12)作為弓 I物，擴(kuò)增ΕΡ0，該EPO含有CMF啟動(dòng)子和BGH終止子，擴(kuò)增產(chǎn)物EPO用內(nèi)切酶BamH1、BglII酶切后，插入質(zhì)粒pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS的BglII位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS-EPOo 分別利用 EP0-65TAG-F (序列為 SEQ ID No. 13)和EP0-65TAG-R(序列為 SEQ ID No. 14)為一組、EP0-152TAG-F (序列為 SEQ ID No. 15)和EP0-152TAG-R(序列為 SEQ ID No. 16)為一組對(duì) pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS-EPO 進(jìn)行定點(diǎn)誘變，從而引入TAG突變?cè)?5和152位得到兩個(gè)質(zhì)粒pcDNA3. l-EctRNAtyr-AcFRS_EP065TAG 和 pcDNA3. l-EctRNAtyr-AcFRS_EP0152TAG。EP065TAG 的脫氧核糖核酸序列如 SEQ IDNo. 3. EP0152TAG的脫氧核糖核酸序列為SEQ ID No. 4。(Ib)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞和分離提純重組促紅素蛋白將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞置入含有非天然氨基酸的培養(yǎng)液中培養(yǎng)后，分離提純獲得帶有非天然氨基酸殘基的重組促紅素蛋白。對(duì)于重組表達(dá)載體pKetoAmber-EP065TAG,將 pKetoAmber-EP065TAG 和 Fugene6 (Roche公司)混合后來轉(zhuǎn)染中華豚鼠細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的中華豚鼠細(xì)胞在帶有25ug/ML濕霉素B的DMEM培養(yǎng)液(美國Invitrogen公司)篩選獲得培養(yǎng)獲得帶有pKetoAmber_EP065TAG的穩(wěn)定中華豚鼠細(xì)胞。又稱穩(wěn)定細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞在I升帶有ImM 4-乙酰苯丙氨酸和25ug/ML濕霉素B的DMEM培養(yǎng)液，37度和5 %二氧化碳的環(huán)境下培養(yǎng)三天后達(dá)到穩(wěn)定細(xì)胞量，細(xì)胞旋轉(zhuǎn)沉降后分離，利用超聲波破細(xì)胞后，細(xì)胞上清液經(jīng)過高效陰離子交換色譜柱分離得到純化的含有4-乙酰苯丙氨酸殘基(第65位)的重組促紅素蛋白(EP0(AcF65))。在本實(shí)施例中，經(jīng)檢測，純化后得到的重組促紅素蛋白量約為100毫克。對(duì)于重組表達(dá)載體pcDNA3. l-EctRNAtyr-AcFRS_EP065TAG 和 pcDNA3.1-EctRNAtyr-AcFRS-EP0152TAG，將CHO細(xì)胞培養(yǎng)在75cm2的組織培養(yǎng)瓶中達(dá)到80-90%克隆率后，利用60 μ I FuGENE 6將重組表達(dá)載體2 μ g對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。過夜培育后將培養(yǎng)基換為含有ImM 4-乙酰苯丙氨酸的新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞在37°C生長1_2天后收集，并用RIPA裂解液溶解細(xì)胞。細(xì)胞裂解后的上清液用PBS緩沖液進(jìn)行平衡與透析，然后裝入抗-EPO瓊脂糖凝膠層析柱。小鼠單克隆抗-EPO抗體(MAIIA Diagnostics)被固定于經(jīng)NHS活化的瓊脂糖凝膠(GE healthcare),根據(jù)生產(chǎn)商提供的說明，每克干凝膠固定6. 3mg抗-EP03F6。層析柱(直徑7mm)加入O. 3mL抗-EPO凝膠達(dá)到8mm高度后使用20mM Tris緩沖液pH 7. 5、30mMNaCl,O. 1% Tween 20,0. 02% NaN3進(jìn)行平衡。為了保護(hù)EPO不被蛋白酶降解，所有緩沖液每毫升均加入O. 01片絕對(duì)不含EDTA的片劑。大約IOOmL含EPO的細(xì)胞裂解物通過層析柱后用2mL平衡緩沖液洗脫。利用加入了 I μΜ胃蛋白酶抑制劑(Roche)的低pH (2. 2)溶液2. 5mL，將EPO解析。用試管收集洗脫液，并且立即調(diào)整其pH至6. 5。最后得到EP0(AcF65)和EP0(AcF152)(含有4-乙酰苯丙氨酸殘基(第152位)的重組促紅素蛋白)。(2)聚乙二醇的化學(xué)修飾一種方法首先將得到的重組促紅素放置在5mM的磷酸緩沖液滲析12個(gè)小時(shí)，滲析后的重組促紅素被稀釋到O. lmg/mL，然后再向其中加入分子量在10，000 20，000道爾頓之間的羥氨聚乙二醇進(jìn)行反應(yīng)(反應(yīng)式參見圖6)，反應(yīng)約12個(gè)小時(shí)，高速離心濃縮后，采用SDS膠體電泳分析(如圖7所示)，本實(shí)施例中聚乙二醇的修飾率達(dá)到99%以上，如圖4。其中羥氨聚乙二醇的合成可以采用以下途徑將帶有羥基的分子量在10，000 20，000道爾頓之間的聚乙二醇(美國Sigma公司)2克、N-羥基酞酰亞胺160毫克、三苯磷250毫克，溶解在15毫升的二氯甲烷內(nèi)；逐滴加入偶氮二甲酸二異丙脂(173微升)，邊加邊攪拌(溫度處于20度，攪拌約18小時(shí))；再向其中加入乙醚進(jìn)行沉降，過濾后得到羥氨聚乙二醇。另一種方法在標(biāo)準(zhǔn)多肽耦合條件下，含活性羥胺基的叔丁氧羰基氨氧基乙酸可與胺端基聚乙二醇(PEG)耦合制得分子量為2萬的PEG衍生物。在乙腈中將等量的叔丁氧羰基氨氧基乙酸與1-羥基苯并三氮唑(HOBt)反應(yīng)30分鐘，然后加入等量的胺端基聚乙二醇室溫?cái)嚢?小時(shí)。粗產(chǎn)物通過乙醚沉淀提純后在室溫下與95%的三氟乙酸水溶液共置攪拌3小時(shí)，減壓蒸餾除去三氟乙酸，得到的含活性羥胺基的PEG衍生物溶于水配制成IOmM溶液。含活性羥胺基的PEG衍生物與得到的重組促紅素在50%的乙腈水溶液中室溫共置I小時(shí)，隨后進(jìn)行干燥冷凍，從而完成與酮標(biāo)記蛋白的結(jié)合過程，如圖4所示。反應(yīng)混合物重新溶于水后用SDS-PAGE分離，如圖5和圖6所示。實(shí)施例二 聚乙二醇化學(xué)修飾在第65位和/或第152位上帶有2_氨_8_氧代壬酰殘基的重組促紅細(xì)胞生成素(I)獲得在第65位和/或第152位上帶有2_氨_8_氧代壬酰殘基的重組促紅細(xì)胞生成素參見圖3，首先，將雙螺旋多聚核苷酸U6-pylT-BamH1-BglII(序列為SEQ IDNo. 17)(訂購自Epoch Biolabs)用內(nèi)切酶BamH1、BglII酶切后，插入質(zhì)粒pcDNA3.1/hygro (+)的 BglII 位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒 pcDNA3. 1-pylT, PylT 的序列為 SEQ ID No. 5 ；然后， 用KetoKRS-Xba1-F (序列為 SEQ ID No. 18)，KetoKRS_Apa1-R(序列為 SEQ IDNo. 19)作為引物對(duì)2-氨-8-氧代壬酰基-tRNA合成酶(KetoKRS)(序列為SEQ ID No. 6)進(jìn)行擴(kuò)增，隨后用內(nèi)切酶Xbal、ApaI酶切；
然后，將用內(nèi)切酶Xba1、ApaI酶切的產(chǎn)物插入重組質(zhì)粒pcDNA3. l_pylT，插入位點(diǎn)為 Xbal、ApaI，所得質(zhì)粒 pcDNA3. 1-pylT-KetoKRS 含有 U6_pylT 和 KetoKRS 序列；之后，利用內(nèi)切酶Xbal、ApaI對(duì)EPO-Xbal-Apal進(jìn)行酶切，后插入質(zhì)粒pcDNA3. 1/hygro (+)。然后將 CMV-BamH1-F、BGH-BglI1-R 作為引物，擴(kuò)增 EP0，該 EPO 含有CMF啟動(dòng)子和BGH終止子。將擴(kuò)增產(chǎn)物EPO用內(nèi)切酶BamH1、BglII酶切后，插入質(zhì)粒pcDNA3. Ι-pylT-KetoKRS 的 BglII 位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pcDNA3. 1-pylT-KetoKRS-EPO。分別利用 EP0-65TAG-F 和 EP0-65TAG-R 為一組、EP0-152TAG-F 和 EP0-152TAG-R 為一組對(duì)pcDNA3. Ι-pylT-KetoKRS-EPO進(jìn)行定點(diǎn)誘變，從而引入TAG突變?cè)?5和152位得到兩個(gè)質(zhì)粒 pcDNA3. l-pylT-KetoKRS-EP065TAG 和 pcDNA3. l-pylT-KetoKRS_EP0152TAG。重組質(zhì)粒pcDNA3· l-pylT-KetoKRS-EP065TAG
和pcDNA3. l-pylT-KetoKRS_EP0152TAG被用來表達(dá)含非天然氨基酸的突變EPOs。將CHO細(xì)胞培養(yǎng)在75cm2的組織培養(yǎng)瓶中達(dá)到80-90 %克隆率后，利用60 μ IFuGENE 6將一種重組質(zhì)粒2 μ g對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。過夜培育后將培養(yǎng)基換為含有ImMKetoK的新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞在37°C生長1-2天后收集，并用RIPA裂解液溶解細(xì)胞。細(xì)胞裂解后的上清液用PBS緩沖液進(jìn)行平衡與透析，然后裝入抗-EPO瓊脂糖凝膠層析柱。小鼠單克隆抗-EPO抗體(MAIIA Diagnostics)被固定于經(jīng)NHS活化的瓊脂糖凝膠(GE healthcare),根據(jù)生產(chǎn)商提供的說明，每克干凝膠固定6. 3mg抗-EP03F6。層析柱(直徑7mm)加入O. 3mL抗-EPO凝膠達(dá)到 8mm 高度后使用 20mM Tris 緩沖液 pH 7. 5、30mM NaCl、O. 1% Tween 20、O. 02% NaN3進(jìn)行平衡。為了保護(hù)EPO不被蛋白酶降解，所有緩沖液每毫升均加入O. 01片絕對(duì)不含EDTA的片劑。大約IOOmL含EPO的細(xì)胞裂解物通過層析柱后用2mL平衡緩沖液洗脫。利用加入了 I μ M胃蛋白酶抑制劑(Roche)的低pH(2. 2)溶液2. 5mL，將EPO解析。用試管收集洗脫液，并且立即調(diào)整其pH至6. 5。最后得到EP0(KetoK65)(含有2-氨-8-氧代壬酰殘基(第65位)的重組促紅素蛋白)和EP0(KetoK152)(含有2-氨-8-氧代壬酰殘基(第152位)的重組促紅素蛋白)。(2)聚乙二醇的化學(xué)修飾在標(biāo)準(zhǔn)多肽耦合條件下，含活性羥胺基的叔丁氧羰基氨氧基乙酸可與胺端基聚乙二醇(PEG)耦合制得分子量為2萬的PEG衍生物。在乙腈中將等量的叔丁氧羰基氨氧基乙酸與1-羥基苯并三氮唑(HOBt)反應(yīng)30分鐘，然后加入等量的胺端基聚乙二醇室溫?cái)嚢?小時(shí)。粗產(chǎn)物通過乙醚沉淀提純后在室溫下與95%的三氟乙酸水溶液共置攪拌3小時(shí)，減壓蒸餾除去三氟乙酸，得到的含活性羥胺基的PEG衍生物溶于水配制成IOmM溶液。含活性羥胺基的PEG衍生物與得到的重組促紅素在50%的乙腈水溶液中室溫共置I小時(shí)，隨后進(jìn)行干燥冷凍，從而完成與酮標(biāo)記蛋白的結(jié)合過程，如圖4所示。反應(yīng)混合物重新溶于水后用SDS-PAGE分離，如圖7和圖8。實(shí)施例三聚乙二醇化 EP0(AcF65)、EP0(AcF152)、EP0(KetoK65)和EP0(KetoK152)的藥代動(dòng)力學(xué)研究和血細(xì)胞比容測定使用無DMSO的PBS反應(yīng)緩沖液(即用SC-PEG-12K在賴氨酸位點(diǎn)修飾天然ΕΡ0)，制備了聚乙二醇化 EP0(AcF65)、EPO (AcF152)、EPO (KetoK65)和 EPO (KetoK152)同濃度樣品。這些PEG化EPO化合物被用于與下列物質(zhì)比較藥代動(dòng)力學(xué)特征天然的、未經(jīng)修飾的、天然功能的EPO[來自Amgen, Inc. , Thousand Oaks, CA]作為基準(zhǔn)，因?yàn)樗潜籉DA核準(zhǔn)的產(chǎn)品，且由于蛋白的超糖基化而有較長的半衰期。為了檢測血液中的蛋白質(zhì)，用本領(lǐng)域已知的氯胺T法，用125I于酪氨酸位點(diǎn)標(biāo)記五個(gè)樣品。每一分子有約1-2個(gè)125I連接。每一樣品(SOug)均被標(biāo)記，使用脫鹽柱將其從殘余的未結(jié)合125I中分離，檢測蛋白質(zhì)的活性，用聚丙烯酰胺凝膠電泳和反相柱驗(yàn)證。評(píng)估PEG化樣品中的以下亞群綴合了一個(gè)PEG分子的EPO亞群(1PEG-EP0)、或綴合了二個(gè)PEG分子的EPO亞群(2PEG-EP0)。1PEG-EP0與2PEG-EP0 之比率，在 EP0-PEG201 中為 54 46 ;在 EP0-PEG202 中為 45 55.為了分析四個(gè)批次放射標(biāo)記蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)特征，將蛋白溶液以2Ci/kg體重的計(jì)量皮下注射到雄性Sprague-Dawley大鼠。大鼠被分為5個(gè)亞組，每亞組4只動(dòng)物，以避免每只動(dòng)物超過3次血液采樣。在注射后不同時(shí)間點(diǎn)(0,0. 5、1、2、4、8、12、16、24、36、48、72、96和120小時(shí))采集血液樣品。用閃爍計(jì)數(shù)器測定放射標(biāo)記蛋白在血液樣本中的量，對(duì)所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果顯示在圖9中，該圖比較了天然EPO和經(jīng)基因修飾得到的EPO在不同時(shí)間點(diǎn)測得的血液中含量。橫坐標(biāo)軸記錄測量時(shí)間點(diǎn)(單位h)，縱坐標(biāo)軸代表所測樣品在血液中的含量值(單位pCi/ml blood)。從圖中可以看出，天然EPO注射后立即達(dá)到高水平。其在注射約13小時(shí)后，血液中含量達(dá)到高峰。13小時(shí)后，天然EPO血液含量顯著減少，并在40小時(shí)內(nèi)基本被清除。實(shí)驗(yàn)測得四種經(jīng)基因修飾得到的EPO隨時(shí)間變化其在血液中含量變化相似。注射后其血液含量不斷上升，并在37小時(shí)左右達(dá)到峰值，隨后雖然其含量緩慢下降，但是仍然在很長時(shí)間內(nèi)保持較高值，整個(gè)代謝周期持續(xù)120小時(shí)以上。此夕卜，經(jīng)基因修飾得到的EPO在血液中濃度均顯著高于天然ΕΡ0，如本實(shí)驗(yàn)中測得基因修飾所得EPO的峰值是天然EPO峰值的大約1. 5倍，另外前者在注射120小時(shí)后的殘留值也略高于代謝相同時(shí)間的天然EPO殘留值。血細(xì)胞比容測定結(jié)果如圖10所示，該圖比較了注射天然EPO和經(jīng)基因修飾得到的EPO后血細(xì)胞比容值隨時(shí)間的變化。橫坐標(biāo)軸記錄測量時(shí)間點(diǎn)(單位D),縱坐標(biāo)軸代表在一定容積內(nèi)全血中紅細(xì)胞所占的百分比。從圖中可以看出，注射天然EPO大約12天后，全血中紅細(xì)胞含量達(dá)到峰值約51%，隨后不斷下降；注射后25天，血液中紅細(xì)胞含量恢復(fù)到注射前水平。注射 EP0(A cF152)-20K PEG、EP0 (KetoK65)-20KPEG 和 EPO (KetoK152)-20KPEG后，全血中紅細(xì)胞含量隨時(shí)間變化基本類似注射大約12天后，全血中紅細(xì)胞含量達(dá)到峰值約60%，比注射天然EPO后得到的峰值高約8% -9% ;隨后血液中紅細(xì)胞含量不斷下降，但含量均仍顯著高于注射天然EPO后同時(shí)間點(diǎn)的紅細(xì)胞含量；注射后25天，血液中紅細(xì)胞含量恢復(fù)到，或仍略高于，注射前水平。注射EP0(AcF65)-20K PEG后，血液中紅細(xì)胞含量在2-3天時(shí)達(dá)到最高值約56%，隨后下降，并在第12天時(shí)重新升高到大約55%，然后不斷下降；注射25天后，血液中紅細(xì)胞含量恢復(fù)到注射前水平。目前還不能很好地解釋這一波動(dòng)。
SEQUENCE LISTING<110>蘇州元基生物技術(shù)有限公司<120>重組促紅細(xì)胞生成素及制備方法<160> 19
<170> PatentIn version 3.3
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atggcaagca gtaacttgat taaacaattg caagagcggg ggctggtagc ccaggtgacg60
gacgaggaag cgttagcaga gcgactggcg caaggcccga tcgcactcat ttgtggcttc120
gatcctaccg ctgacagctt gcatttgggg catcttgttc cattgttatg cctgaaacgc180
ttccagcagg cgggccacaa gccggttgcg ctggtaggcg gcgcgacggg tctgattggc240
gacccgagct tcaaagctgc cgagcgtaag ctgaacaccg aagaaactgt tcaggagtgg300
gtggacaaaa tccgtaagca ggttgccccg ttcctcgatt tcgactgtgg agaaaactct360
gctatcgcgg ccaataatta tgactggttc ggcaatatga atgtgctgac cttcctgcgc420
gatattggca aacacttctc cgttaaccag atgatcaaca aagaagcggt taagcagcgt480
ctcaaccgtg aaggtcaggg gatttcgttc actgagtttt cctacaacct gctgcagggt540
tatggtatgg cctgtgctaa caaacagtac ggtgtggtgc tgcaaattgg tggttctgac600
caatggggta acatcacttc tggtatcgac ctgacccgtc gtctgcatca gaatcaggtg660
tttggcctga ccgttccgct gatcactaaa gcagatggca ccaaatttgg taaaactgaa720
ggcggcgcag tctggttgga tccgaagaga accagcccgt acaaattcta ccagttctgg780
atcaacactg cggatgccga cgtttaccgc ttcctgaagt tcttcacctt tatgagcatt840
gaagaaatca acgccctgga agaagaagat aaaaacagcg gtaaagcacc gcgcgcccag900
tatgtactgg cggagcaggt gactcgcctg gttcacggtg aagaaggttt acaggcggca960
aaacgtatta ccgaatgcct gttcagcggt tctttgagtg cgctgagtga agcggacttc 1020gaacagctgg cgcaggacgg cgtaccgatg gttgagatgg aaaagggcgc agacctgatg 1080caggcactgg tcgattctga actgcaacct tcccgtggtc aggcacgtaa aactatcgcc 1140tccaatgcca tcaccattaa cggtgaaaaa cagtccgatc ctgaatactt ctttaaagaa 1200gaagatcgtc tgtttggtcg ttttacctta ctgcgtcgcg gtaaaaagaa ttactgtctg 1260atttgctggaaataa
1275
<210> 3<211> 579<212> DNA<213> 人工序列
<400> 3
atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct60
ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctgcag120
aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc180
agcttgaatg agtagatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg240
atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct300 gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg360
catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctggga420
gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc480
actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg540aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacaga 579
<210>4
<211>579
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 4
atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct60
ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctgcag120
aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc180
agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg240
atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct300
gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg360
catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctggga420
gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcgtagtcag ctgctccact ccgaacaatc480
actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg540aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacaga 579<210>5
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 5
ggaaacctga tcatgtagat cgaatggact ctaaatccgt tcagccgggt tagattcccg60
gggtttccgcca
72
<210> 6<211> 1263·<212> DNA<213> 人工序列
<400> 6
atgtcagata aaaaaccatt agatgtttta atatctgcga ccgggctctg gatgtccagg60
actggcacgc tccacaaaat caagcaccat gaggtctcaa gaagtaaaat atacattgaa120
atggcgtgtg gagaccatct tgttgtgaat aattccagga gttgtagaac agccagagca180
ttcagacatc ataagtacag aaaaacctgc aaacgatgta gggtttcggg cgaggatatc240
aataattttc tcacaagatc aaccgaaagc aaaaacagtg tgaaagttag ggtagtttct300
gctccaaagg tcaaaaaagc tatgccgaaa tcagtttcaa gggctccgaa gcctctggaa360
aattctgttt ctgcaaaggc atcaacgaac acatccagat ctgtaccttc gcctgcaaaa420
tcaactccaa attcgtctgt tcccgcatcg gctcctgctc cttcacttac aagaagccag480
cttgataggg ttgaggctct cttaagtcca gaggataaaa tttctctgaa tatggcaaag540
cctttcaggg aacttgagcc tgaacttgtg acaagaagaa aaaacgattt tcagcggctc600
tataccaatg atagagaaga ctacctcggt aaactcgaac gtgatattac gaaatttttc660
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agaatgggta ttaataatga tactgaactt tcaaaacaga tcttccgggt ggataaaaat780
ctctgcttga ggccaatggt tgccccgact attttcaact atgcgcgaaa actcgatagg840
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ggcaaagagc acctggaaga atttactatg gtgaacttct ttcagatggg ttcgggatgt960
^ctcgggaaa atcttgaagc tctcatcaaa gagtttctgg actatctgga aatcgacttc1020
gaaatcgtag gagattcctg tatggtctat ggggatactc ttgatataat gcacggggac1080
ctggagcttt cttcggcagt cgtcgggcca gtttctcttg atagagaatg gggtattgac1140
aaaccatgga taggtgcagg ttttggtctt gaacgcttgc tcaaggttat gcacggcttt1200
aaaaacatta agagggcatc aaggtccgaa tcttactata atgggatttc aaccaatctg1260taa1263
<210> 7<211> 368 <212> DNA <213> 人工序列
<400> 7
cgggggatcc aaaaaagggg gacggattcg aaccgccgaa cccaaaggga gcggatttag60
agtccgccgc gtttagccac ttcgctaccc ctccggtgtt tcgtcctttc cacaagatat 120 ataaagccaa gaaatcgaaa tactttcaag ttacggtaag catatgatag tccattttaa 180 aacataattt taaaactgca aactacccaa gaaattatta ctttctacgt cacgtatttt 240 gtactaatat ctttgtgttt acagtcaaat taattctaat tatctctcta acagccttgt 300 atcgtatatg caaatatgaa ggaatcatgg gaaataggcc ctcttcctgc ccgaccttag 360 atccgttg 368
<210>8
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 8
aaacgggccc tttccagcaa atcagacagt a31
<210> 9
<211>31 <212> DNA
<213>人工序列
<400> 9
cgagtctaga atggcaagca gtaacttgat t31
<210>10
<211>603
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 10
cgagtctaga atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct60
gtcgctccct ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg 120
權(quán)利要求
1.一種化學(xué)修飾的重組促紅細(xì)胞生成素，其中，第152位的氨基酸殘基為4-乙酰苯丙氨酰殘基，所述的4-乙酰苯丙氨酰殘基是通過在促紅細(xì)胞生成素基因序列的第152位發(fā)生琥珀無義突變后由該琥珀無義突變的位置翻譯而成的，在第152位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細(xì)胞生成素基因序列如SEQ ID No. 4所述，所述的4-乙酰苯丙氨酰殘基上共價(jià)連接了聚乙二醇。
2.如權(quán)利要求1所述的重組促紅細(xì)胞生成素，其中，所述的聚乙二醇為羥氨基或聯(lián)氨基取代的聚乙二醇。
3.制備如權(quán)利要求1所述的重組促紅細(xì)胞生成素的方法，其中，該方法包括 (1)構(gòu)建含有編碼4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因、琥珀突變抑制tRNA基因、在第152位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細(xì)胞生成素基因的重組表達(dá)載體，所述編碼4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因序列如SEQ ID No. 2所述，所述琥珀突變抑制tRNA基因序列如SEQ IDNo.1所述，所述在第152位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細(xì)胞生成素基因序列如SEQ ID No. 4所述； (2)將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞并從中分離得到在第152位具有4-乙酰苯丙氨酰殘基的重組促紅細(xì)胞生成素； (3)采用聚乙二醇對(duì)分離得到的所述重組促紅細(xì)胞生成素上的4-乙酰苯丙氨酰殘基進(jìn)行化學(xué)修飾。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述重組表達(dá)載體為 重組質(zhì)粒 pcDNA3. l-EctRNAtyr-AcFRS-EPOTAG。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述宿主細(xì)胞為將含有編碼4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因、琥珀突變抑制tRNA基因、在第152位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細(xì)胞生成素基因的重組表達(dá)載體穩(wěn)定整合到CHO細(xì)胞染色體的CHO細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1所述的化學(xué)修飾的重組促紅細(xì)胞生成素在制備治療貧血藥物中的應(yīng)用。
7.一種治療貧血的藥物組合物,其中，該組合物包含權(quán)利要求1所述的化學(xué)修飾的重組促紅細(xì)胞生成素和藥學(xué)上可以接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及化學(xué)修飾的重組促紅細(xì)胞生成素及制備方法，采用基因工程技術(shù)對(duì)促紅素進(jìn)行重組，在促紅素中引入了具有化學(xué)活潑酮基的4-乙酰苯丙氨酰殘基，在聚乙二醇對(duì)重組促紅素共價(jià)修飾時(shí)，聚乙二醇特異性地與4-乙酰苯丙氨酰殘基反應(yīng)，反應(yīng)完全，且不與其他氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)，所需要的反應(yīng)條件較溫和，解決了現(xiàn)有技術(shù)中選擇性差、反應(yīng)條件惡劣的問題。聚乙二醇化的重組促紅素的藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果、血細(xì)胞比容測定結(jié)果均優(yōu)于天然的促紅素。
文檔編號(hào)A61P7/06GK103044539SQ201210222130
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2010年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日
發(fā)明者萬為 申請(qǐng)人:蘇州元基生物技術(shù)有限公司