專(zhuān)利名稱(chēng)：一種靶向傳遞金剛烷順鉑抗癌前藥的超分子組裝體及制備的制作方法
一種靶向傳遞金剛烷順鉑抗癌前藥的超分子組裝體及制備
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗癌藥物靶向傳遞技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種靶向傳遞金剛烷順鉬前藥的超分子組裝體及制備。
背景技木由于當(dāng)今社會(huì)環(huán)境污染、化學(xué)污染、電磁輻射、自由基毒素以及人類(lèi)自身遺傳因素等的影響，癌癥已經(jīng)成為威脅人類(lèi)健康的重大疾病之一。人類(lèi)為了對(duì)抗這一疾病，發(fā)明了各種治療方法，主要包括手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療等，其中順鉬是ー類(lèi)臨床應(yīng)用廣泛的廣譜抗癌化學(xué)治療藥物，具有作用強(qiáng)、可與多種抗癌藥協(xié)同作用且無(wú)交叉耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。但順鉬的毒副作用很大，具有顯著的骨髄抑制、腎臟毒性及神經(jīng)毒性等作用，對(duì)于患者的身體狀況和生活質(zhì)量影響很大，因此設(shè)計(jì)全新的靶向藥物傳遞體系來(lái)提高抗癌藥物治療效果及降低毒副作用成為了化學(xué)家，生物學(xué)家和醫(yī)藥工作者的重點(diǎn)和挑戰(zhàn)。透明質(zhì)酸(HA)是ー類(lèi) 親水的多聚糖高分子，在生物體內(nèi)廣泛的分布在細(xì)胞間質(zhì)中，是ー類(lèi)天然的保濕劑，能夠促進(jìn)細(xì)胞的増殖和分化，因此具有良好的生物兼容性和生物降解性。近些年研究表明透明質(zhì)酸能夠與癌細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)的透明質(zhì)酸受體強(qiáng)烈鍵合，而正常細(xì)胞表面此類(lèi)受體表達(dá)很少，因此透明質(zhì)酸可以用于藥物傳遞體系的靶向劑，同時(shí)由于透明質(zhì)酸的高分子特性，其本身就是ー類(lèi)良好的藥物載體。同時(shí)，非共價(jià)作用載體由于其優(yōu)良的緩釋效果、較低的藥物毒副作用以及不破壞藥物結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，在新近出現(xiàn)的藥物傳遞體系如脂質(zhì)體、無(wú)機(jī)納米粒子、囊泡以及碳納米材料等載體上廣為應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)分析，提供一種靶向傳遞金剛烷順鉬抗癌前藥的超分子組裝體及制備，該超分子組裝體對(duì)于癌細(xì)胞的選擇性強(qiáng)、毒副作用低，其制備方法簡(jiǎn)單且產(chǎn)率較高，適于放大合成和實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案一種靶向傳遞金剛烷順鉬抗癌前藥的超分子組裝體，為基于環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸和金剛烷順鉬前藥合成的ニ元超分子組裝體，其中環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸分子式為(C14H21NO11) 98 (C58H95N3O44) 17，平均一條高分子鏈上修飾17個(gè)環(huán)糊精単元，金剛烷順鉬前藥的結(jié)構(gòu)是順式的ニ金剛烷ニ氯合鉬，化學(xué)分子式為C2ciH34Cl2N2Pt ;該ニ元超分子組裝體以環(huán)糊精與金剛烷間強(qiáng)的非共價(jià)相互作用和分子間的兩親作用，形成以親水的透明質(zhì)酸為外売，疏水的金剛烷順鉬前藥為內(nèi)核的超分子納米粒子，納米粒子粒徑大小為30-50nm。一種所述靶向傳遞金剛烷順鉬抗癌前藥的超分子組裝體的制備，步驟如下I)將分子量為46000的透明質(zhì)酸鈉溶于pH為7. 2、濃度為Immol的磷酸緩沖溶液中，透明質(zhì)酸鈉與磷酸緩沖溶液的用量比為O. 073mmol/L，再加入I-こ基-(3-ニ甲基氨基丙基)碳ニ亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，攪拌反應(yīng)30分鐘，得到反應(yīng)液；2)將6-去氧-6-こニ胺環(huán)糊精溶于pH為7.2的磷酸緩沖溶液中，6-去氧-6-こニ胺_β -環(huán)糊精與磷酸緩沖溶液的用量比為O. lmol/L，再加入到上述反應(yīng)液中，在25° C條件下攪拌24小時(shí)，然后裝入截留范圍為8000-14000的透析袋中連續(xù)透析5天，將所得溶液凍干即可制得環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸(HACD)；3)將四氯合鉬酸鉀和碘化鉀分別溶于水中得到水溶液，四氯合鉬酸鉀與水的用量比為O. 102mol/L，碘化鉀與水的用量比為2. 025mol/L，將兩種水溶液混合后放置15分鐘，得到暗棕色的四碘合鉬酸鉀溶液；4)將I-金剛烷胺分散在水中，I-金剛烷胺與水的用量比為O. 2mol/L，然后加入到上述四碘合鉬酸鉀溶液中，I-金剛烷胺水溶液與四碘合鉬酸鉀溶液的容積比為5:7，在30° C條件下攪拌12小時(shí)，抽濾后收集固體，用水洗滌直至無(wú)鹵離子檢出并在真空度為O. IPa下干燥，得到順式ニ金剛烷ニ碘合鉬；5)將上述順式ニ金剛烷ニ碘合鉬懸浮在丙酮和水容積比為1:1的混合液中，順式ニ金剛烷ニ碘合鉬與丙酮和水混合液的用量比為7. 67mmol/L，加入硝酸銀，硝酸銀與丙酮和水混合液的用量比為15. 33mmol/L，在25° C條件下避光攪拌2天，抽濾后在濾液中加入氯化鉀，O. IPa下蒸餾除去丙酮后反應(yīng)液中產(chǎn)生黃色沉淀，將反應(yīng)液在25° C條件下靜置12小吋，抽濾收集固體，并用水洗滌三次，再在真空度為O. IPa下干燥即可制得金剛烷順鉬前藥ladamplatin)；6)將環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸(HA⑶)溶于水中得到溶液，環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸與水的用量比為O. 02mmol/L，將金剛烷順鉬前藥(adamplatin)溶于ニ甲基亞砜中得到溶液，金剛烷順鉬前藥與ニ甲基亞砜的用量比為11.33mmol/L，然后將兩種溶液按容積比為100:3均勻混合，即可制得靶向傳遞金剛烷順鉬前藥的超分子組裝體(HAP)。所述透明質(zhì)酸鈉、I-こ基-(3-ニ甲基氨基丙基)碳ニ亞胺鹽酸鹽、N-羥基硫代琥珀酰亞胺和6-去氧-6-こニ胺-β -環(huán)糊精的摩爾比為O. 0044:1. 75:1. 75:1。所述四氯合鉬酸鉀、碘化鉀、I-金剛烷胺、硝酸銀和氯化鉀的摩爾比為O. 51:4. 05 1 0. 92:0. 92。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是該靶向傳遞金剛烷順鉬前藥的超分子組裝體，利用透明質(zhì)酸與癌細(xì)胞表面過(guò)量表達(dá)的透明質(zhì)酸受體間強(qiáng)的抗原-抗體作用，將載有金剛烷順鉬前藥的超分子組裝體通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)吞作用特異性地帯入到癌細(xì)胞當(dāng)中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的選擇性殺傷；該藥物傳遞體系與直接使用順鉬和金剛烷順鉬前藥相比抗癌活性顯著提高，同時(shí)毒副作用明顯降低；該藥物傳遞體系的制備エ藝簡(jiǎn)單、易于實(shí)施且材料成本低，在癌癥的靶向治療領(lǐng)域有較大的應(yīng)用前景。

圖I為該超分子組裝體HAP的合成路線示意圖。圖2為環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸HA⑶的凝膠滲透色譜檢測(cè)信號(hào)-保留體積圖。圖3為環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸HA⑶的凝膠滲透色譜分子量-保留體積圖。圖4為環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸HA⑶的凝膠滲透色譜分子量分布圖。圖5為超分子組裝體HAP的透射電子顯微鏡圖。圖6為MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖7為ΝΙΗ3Τ3細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施方式下面通過(guò)實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步的說(shuō)明實(shí)施例一種靶向傳遞金剛烷順鉬前藥的超分子組裝體的制備，步驟如下I)將IOOmg (O. 0022mmol)分子量為46000的透明質(zhì)酸鈉溶于30mL pH為7. 2、濃度為Immol的磷酸緩沖溶液中，再加入167. 7mg (O. 875mmol) I-こ基-(3-ニ甲基氨基丙基)碳ニ亞胺鹽酸鹽和190mg (O. 875mmol)N-羥基硫代琥珀酰亞胺，攪拌反應(yīng)30分鐘，得到反應(yīng)液；2)將 588. 5mg (O. 5mmol) 6_ 去氧-6-こニ胺- β -環(huán)糊精溶于 5mL pH 為 7. 2 的磷酸緩沖溶液中，再加入到上述反應(yīng)液中，在25° C條件下攪拌24小時(shí)，然后裝入截留范圍為8000-14000的透析袋中連續(xù)透析5天，將所得溶液凍干即可制得環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸·(HACD)。檢測(cè)顯示本發(fā)明制備的環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸的核磁表征如下 NMR (400MHz, D2O, TMS, ppm) : δ 1.97 (s，3H，H of methyl group of HA), 2. 84-3. 93 (m,16. 24H, H of HA and C_3, C_5, C_6, C_2, C_4of β-CD)，4. 45-4. 50 (m，2H，H of HA),
5.04-5. 10(m，1.06H，H of C-I of0-ra)。通過(guò)對(duì)核磁譜圖積分計(jì)算可以得到環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸分子式為(C14H21NO11)98(C58H95N3O44)17，平均一條高分子鏈上修飾17個(gè)環(huán)糊精単元。3)將210mg (0. 51mmol)四氯合鉬酸鉀和672mg (4. 05mmol)碘化鉀分別溶于5mL和2mL水中得到水溶液，將兩種水溶液混合后放置15分鐘，得到暗棕色的四碘合鉬酸鉀溶液；4)將152mg (Immol) I-金剛烷胺分散在5mL水中，然后加入到上述四碘合鉬酸鉀溶液中，在30° C條件下攪拌12小時(shí)，抽濾后收集固體，用水洗滌直至無(wú)鹵離子檢出并在真空度為0. IPa下干燥，得到順式ニ金剛烷ニ碘合鉬；5)將上述順式ニ金剛烷ニ碘合鉬348mg(0. 46mmol)懸浮在60mL丙酮和水容積比為1:1的混合液中，加入157. lmg(0.92mmol)硝酸銀，在25° C條件下避光攪拌2天，抽濾后在濾液中加入69mg (0. 92mmol)氯化鉀，0. IPa下蒸餾除去丙酮后反應(yīng)液中產(chǎn)生黃色沉淀，將反應(yīng)液在25。C條件下靜置12小時(shí)，抽濾收集固體，并用水洗滌三次，再在真空度為0. IPa下干燥即可制得金剛燒順鉬前藥(adamplatin)。檢測(cè)顯示本發(fā)明制備的金剛烷順鉬前藥的核磁及質(zhì)譜表征如下=1H NMR(400MHz, DMS0-d6, TMS, ppm) : δ I. 58-1. 62 (m,6H, H of adamantane) , I. 90-2. 08 (m, 9H, H ofadamantane), 4. 43 (bs, lH,part of H Of-NH2)D ESI-MS :496. 3 [M-2C1-H]+，533. I [M_C1]+。通過(guò)核磁及質(zhì)譜表征可以得到制得的金剛烷順鉬前藥的結(jié)構(gòu)是順式的ニ金剛烷ニ氯合鉬，化學(xué)分子式為C2tlH34Cl2N2Pt156)將I. 27mg環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸(HACD)溶于ImL水中得到溶液，將0. 19mg金剛烷順鉬前藥(adamplatin)溶于30 μ L ニ甲基亞砜中得到溶液，然后將上述兩種溶液均勻混合，即可制得靶向傳遞金剛烷順鉬前藥的超分子組裝體(ΗΑΡ)。圖I為該超分子組裝體HAP的合成路線示意圖。圖5為超分子組裝體HAP的透射電子顯微鏡圖，通過(guò)透射電子顯微鏡表征可以得出該ニ元超分子組裝體以環(huán)糊精與金剛烷間強(qiáng)的非共價(jià)相互作用和分子間的兩親作用，形成以親水的透明質(zhì)酸為外殼，疏水的金剛烷順鉬前藥為內(nèi)核的超分子納米粒子，納米粒子粒徑大小為30-50nm。如圖2-4所示，凝膠滲透色譜顯示環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸的平均分子量為69230，遠(yuǎn)大于未修飾的透明質(zhì)酸分子量(46000)，同時(shí)環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸的核磁譜圖出現(xiàn)了環(huán)糊精的特征信號(hào)，由此可以證明環(huán)糊精被成功地共價(jià)修飾到透明質(zhì)酸上。此外，如圖5所示，透射電子顯微鏡顯示環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸與金剛烷順鉬前藥形成了以親水的透明質(zhì)酸為外殼，疏水的金剛烷順鉬前藥為內(nèi)核的超分子納米粒子，納米粒子粒徑大小為30-50nm。本發(fā)明的具體應(yīng)用效果如下將MCF-7細(xì)胞(人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞)和NIH3T3細(xì)胞(小鼠成纖維細(xì)胞)在鋪有含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的24孔板中培養(yǎng)24小時(shí)，分別加入順鉬(cisplatin)，adamplatin, HAP，含有過(guò)量透明質(zhì)酸(HA)的HAP，以及HA⑶，連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，用細(xì)胞計(jì) 數(shù)法測(cè)量各個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下的細(xì)胞生存率。結(jié)果表明，如圖6所示，在24小時(shí)范圍內(nèi)，HAP對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用大于cisplatin和adamplatin,當(dāng)加入過(guò)量的透明質(zhì)酸將細(xì)胞表面透明質(zhì)酸受體飽和后，超分子組裝體HAP對(duì)于MCF-7細(xì)胞的抑制作用大大減弱，證明了這種抑制作用是由于細(xì)胞受體為媒介的內(nèi)吞作用將超分子組裝體HAP帶入到細(xì)胞當(dāng)中。對(duì)于NIH3T3細(xì)胞,如圖7所示,cisplatin和adamplatin對(duì)其具有很大的殺傷作用，然而由于正常細(xì)胞表面透明質(zhì)酸受體的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于癌細(xì)胞，因此HAP對(duì)于正常細(xì)胞的副作用很小，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)正常細(xì)胞的保護(hù)和對(duì)癌細(xì)胞的靶向選擇性殺傷。
權(quán)利要求
1.一種靶向傳遞金剛烷順鉬抗癌前藥的超分子組裝體，其特征在于為基于環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸和金剛烷順鉬前藥合成的二元超分子組裝體，其中環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸分子式為(C14H21NO11)98(C58H95N3O44)17，平均一條高分子鏈上修飾17個(gè)環(huán)糊精單元，金剛烷順鉬前藥的結(jié)構(gòu)是順式的二金剛烷二氯合鉬，化學(xué)分子式為C2ciH34Cl2N2Pt ;該二元超分子組裝體以環(huán)糊精與金剛烷間強(qiáng)的非共價(jià)相互作用和分子間的兩親作用，形成以親水的透明質(zhì)酸為外殼，疏水的金剛烷順鉬前藥為內(nèi)核的超分子納米粒子，納米粒子粒徑大小為30-50nm。
2.一種如權(quán)利要求I所述靶向傳遞金剛烷順鉬抗癌前藥的超分子組裝體的制備，其特征在于步驟如下 1)將分子量為46000的透明質(zhì)酸鈉溶于pH為7.2、濃度為Immol的磷酸緩沖溶液中，透明質(zhì)酸鈉與磷酸緩沖溶液的用量比為0. 073mmol/L，再加入I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，攪拌反應(yīng)30分鐘，得到反應(yīng)液； 2)將6-去氧-6-乙二胺-P-環(huán)糊精溶于pH為7. 2的磷酸緩沖溶液中，6-去氧-6-乙二胺-￠-環(huán)糊精與磷酸緩沖溶液的用量比為0. lmol/L，再加入到上述反應(yīng)液中，在25° C條件下攪拌24小時(shí)，然后裝入截留范圍為8000-14000的透析袋中連續(xù)透析5天，將所得溶液凍干即可制得環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸(HA⑶)； 3)將四氯合鉬酸鉀和碘化鉀分別溶于水中得到水溶液，四氯合鉬酸鉀與水的用量比為0.102mol/L，碘化鉀與水的用量比為2. 025mol/L，將兩種水溶液混合后放置15分鐘，得到暗棕色的四碘合鉬酸鉀溶液； 4)將I-金剛烷胺分散在水中，I-金剛烷胺與水的用量比為0.2mol/L,然后加入到上述四碘合鉬酸鉀溶液中，I-金剛烷胺水溶液與四碘合鉬酸鉀溶液的容積比為5:7，在30° C條件下攪拌12小時(shí)，抽濾后收集固體，用水洗滌直至無(wú)鹵離子檢出并在真空度為0. IPa下干燥，得到順式二金剛烷二碘合鉬； 5)將上述順式二金剛烷二碘合鉬懸浮在丙酮和水容積比為1:1的混合液中，順式二金剛烷二碘合鉬與丙酮和水混合液的用量比為7. 67mmol/L，加入硝酸銀，硝酸銀與丙酮和水混合液的用量比為15. 33mmol/L，在25° C條件下避光攪拌2天，抽濾后在濾液中加入氯化鉀，0. IPa下蒸餾除去丙酮后反應(yīng)液中產(chǎn)生黃色沉淀，將反應(yīng)液在25° C條件下靜置12小時(shí)，抽濾收集固體，并用水洗滌三次，再在真空度為0. IPa下干燥即可制得金剛烷順鉬前藥(adamplatin)； 6)將環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸(HACD)溶于水中得到溶液，環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸與水的用量比為0. 02mmol/L，將金剛烷順鉬前藥(adamplatin)溶于二甲基亞砜中得到溶液，金剛烷順鉬前藥與二甲基亞砜的用量比為11.33mmol/L，然后將兩種溶液按容積比為100:3均勻混合，即可制得靶向傳遞金剛烷順鉬前藥的超分子組裝體(HAP)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述靶向傳遞金剛烷順鉬抗癌前藥的超分子組裝體的制備，其特征在于所述透明質(zhì)酸鈉、I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基硫代琥珀酰亞胺和6-去氧-6-乙二胺-￠-環(huán)糊精的摩爾比為0. 0044:1. 75:1. 75:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述靶向傳遞金剛烷順鉬抗癌前藥的超分子組裝體的制備，其特征在于所述四氯合鉬酸鉀、碘化鉀、I-金剛烷胺、硝酸銀和氯化鉀的摩爾比為0. 51:4. 05 1 0.92:0. 92。
全文摘要
一種靶向傳遞金剛烷順鉑前藥的超分子組裝體，為基于環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸和金剛烷順鉑前藥合成的二元超分子組裝體；其制備方法是首先分別合成環(huán)糊精修飾透明質(zhì)酸和金剛烷順鉑前藥，以環(huán)糊精與金剛烷間強(qiáng)的非共價(jià)相互作用和分子間的兩親作用，形成以親水的透明質(zhì)酸為外殼，疏水的金剛烷順鉑前藥為內(nèi)核的超分子納米粒子。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是該靶向藥物傳遞超分子組裝體，合成路線簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低且產(chǎn)率較高，適于放大合成和實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用；通過(guò)惡性腫瘤細(xì)胞表面透明質(zhì)酸受體為媒介的內(nèi)吞作用將超分子組裝體HAP靶向地帶入到癌細(xì)胞當(dāng)中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)正常細(xì)胞的保護(hù)和對(duì)癌細(xì)胞的靶向選擇性殺傷，抗癌活性顯著提高，同時(shí)毒副作用明顯降低。
文檔編號(hào)A61K33/24GK102698286SQ20121022414
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月2日
發(fā)明者劉育, 張瀛溟, 楊洋 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)