專利名稱：一種噴鼻黏膜免疫疫苗組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種噴鼻黏膜免疫疫苗組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，SARS、高致病性H5 N1禽流感、甲型HlNl流感等病原黏膜感染性疾病的危害日趨嚴(yán)唆。眾所周知，全球近20年新發(fā)、突發(fā)重大傳染病多為黏膜感染所致，且普遍易感，難以控制。此外，生態(tài)環(huán)境變化、傳病蟲媒孽生、抗生素濫用、病原體變異、超級(jí)細(xì)菌及超級(jí)病毒出現(xiàn)等原因，一些被控制的傳染病又呈死灰復(fù)燃，極易造成重大傳染病暴發(fā)流行。因此WHO權(quán)威人士預(yù)言，人類將面臨傳染病的嚴(yán)重威脅。眾所周知，95%以上的病原體感染發(fā)生在黏膜或由黏膜入侵而致病。黏膜系統(tǒng)廣泛分布在呼吸道、消化道和泌尿生殖道，以及外分泌腺，而呼吸道占首位。該系統(tǒng)在體內(nèi)的覆蓋面積大，形成機(jī)體抵抗外來(lái)病原體入侵的第一道防線，特別是黏膜免疫模擬自然感染誘導(dǎo)產(chǎn)生分泌性IgA和CTL效應(yīng)及全面免疫應(yīng)答在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用，且各黏膜間具有相通性。然而，現(xiàn)注射免疫疫苗途徑通常只能激發(fā)系統(tǒng)免疫應(yīng)答，而無(wú)黏膜免疫應(yīng)答及交叉免疫保護(hù)作用，使得疫苗品種、類型単一和依從性差，而使用受限。在過(guò)去的幾十年，人們?cè)噲D設(shè)計(jì)疫苗劑型既能產(chǎn)生系統(tǒng)免疫又能同時(shí)產(chǎn)生黏膜免疫及細(xì)胞免疫效應(yīng)，但在黏膜疫苗佐劑及載體傳遞系統(tǒng)沒有取得突破性進(jìn)展，特別是在量效控制、緩釋靶向性方面的存在技術(shù)瓶頸。因此，噴鼻黏膜疫苗佐劑及黏膜疫苗傳遞系統(tǒng)組合物吸引了人們的目光，并成為該領(lǐng)域發(fā)展的重點(diǎn)領(lǐng)域。近些年的研究表明，以細(xì)菌霍亂腸毒素CT、大腸埃希菌不耐熱腸毒素LT等毒素類成為具有潛力的黏膜免疫疫苗佐劑，它不僅能產(chǎn)生特異性抗體應(yīng)答，還可誘導(dǎo)較強(qiáng)的黏膜免疫應(yīng)答，并有效增強(qiáng)機(jī)體抵抗病原感染的能力，但其自身高免疫原性及毒素安全性使得在臨床研究中止步不前，特別是其自身蛋白大分子免疫原性強(qiáng)，而把目的抗原所覆蓋，由此難以成為候選人用黏膜疫苗佐劑成分。隨后的研究，集中在免疫細(xì)胞因子具有增強(qiáng)免疫應(yīng)答，并有一定佐劑效果，但免疫細(xì)胞因子龐大而種類復(fù)雜，至今還沒有確切是哪個(gè)，也沒有粘附性，且難以単一免疫細(xì)胞因子成為穩(wěn)定有效的黏膜疫苗佐劑的問題。同時(shí)有報(bào)道，殼聚糖作為ー種天然陽(yáng)離子生物高聚物，因具有生物粘附性、相容性和降解性，而其降解產(chǎn)物無(wú)毒、無(wú)免疫原性和無(wú)致癌性，且殼聚糖具有一定的黏膜疫苗傳遞載體效應(yīng)，成為很有前景的疫苗載體。但殼聚糖難溶于水，而易溶于稀酸溶液，這對(duì)大多數(shù)蛋白、肽類抗原效果欠佳，且使用受到限制。由此，試圖發(fā)展ー種安全、有效、穩(wěn)定和質(zhì)量可控制的黏膜疫苗佐劑及傳遞系統(tǒng)組合物是發(fā)展黏膜免疫疫苗的迫切重大需求。近年的研究表明，以縮水甘油三甲基氯化胺或碘甲烷等化合物與殼聚糖反應(yīng)可得到季胺化殼聚糖及其衍生物，它與殼聚糖相比具有更好的水溶性、親水性和陽(yáng)離子性，極大的適合蛋白、肽類、核酸等生物大分子類抗原，并且利用季銨化殼聚糖本身的陽(yáng)離子性質(zhì)，或?qū)ζ涓叻肿渔溕系牧u基、氨基修飾，通過(guò)調(diào)節(jié)殼聚糖與水分子之間的相互作用，可制備具有不同PH敏感響應(yīng)性水凝膠，使殼聚糖溶液在宿主體溫下發(fā)生膠凝，以達(dá)到疫苗抗原的長(zhǎng)效釋放效應(yīng)。并且季銨鹽殼聚糖水凝膠能夠與鼻上皮細(xì)胞及其粘液層發(fā)生強(qiáng)烈作用，以保證在被黏膜纖毛清除之前使疫苗抗原轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)鼻黏膜，此外還可以通過(guò)上皮細(xì)胞之間緊密連接處的暫時(shí)開放而增加極性蛋白、肽類抗原細(xì)胞旁路搬運(yùn)的能力，實(shí)現(xiàn)對(duì)疫苗抗原在黏膜傳遞載體效應(yīng)和靶向性的作用，從而實(shí)現(xiàn)黏膜疫苗載體傳遞效應(yīng)。到目前為止，制備的殼聚糖或季銨鹽殼聚糖水凝膠作為黏膜疫苗傳遞載體系統(tǒng)還存在致命缺點(diǎn)，限制了發(fā)展使用。主要表現(xiàn)在其ー是，盡管殼聚糖具有緩慢釋放及免疫增強(qiáng)效應(yīng)，但自身在酸性溶液才可發(fā)揮作用，這對(duì)于蛋白類、肽類抗原限制了使用；其ニ是，季銨化殼聚糖水凝膠盡管解決了酸性對(duì)蛋白、肽類抗原的影響，多是在體外成形植入或注射體內(nèi)，限制了季銨鹽殼聚糖水凝膠黏膜應(yīng)用范圍；其三是，季銨化殼聚糖水凝膠盡管有一定免疫增效，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能達(dá)到疫苗佐劑發(fā)揮的作用，還需要其他佐劑的協(xié)助；其四是現(xiàn)制備的pH敏感季銨化殼聚糖水凝膠的pH響應(yīng)性不夠敏感,難以迅速 響應(yīng)體內(nèi)pH微小變化而實(shí)現(xiàn)疫苗抗原的間斷性釋放；其五是疫苗抗原在儲(chǔ)備過(guò)程中易染菌使其失效或?qū)θ梭w造成其它危害。由此，很有必要研制一種噴鼻黏膜疫苗傳遞載體與佐劑的組合物，以實(shí)現(xiàn)對(duì)黏膜感染疾病安全簡(jiǎn)便、全面有效的免疫預(yù)防，實(shí)現(xiàn)免疫防控感染性疾病的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種噴鼻黏膜免疫疫苗組合物。本發(fā)明的目的還在于提供ー種噴鼻黏膜免疫疫苗組合物制備方法。本發(fā)明的目的也在于提供ー種噴鼻黏膜免疫疫苗組合物的在制備免疫預(yù)防藥物中的應(yīng)用。ー種噴鼻黏膜免疫疫苗組合物，所述疫苗組合物由占疫苗組合物總重的以下組分組成免疫細(xì)胞因子0. 01-20%、殼聚糖季胺鹽水凝膠45-80%、疫苗抗原0. 01-20%、硫柳汞
0.01-15%、聚こニ醇 0. 5-2%O所述免疫細(xì)胞因子為天然的或重組的IL-Ia、IL-IP、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-IUIL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-31、IL-33 中的ー種或ー種以上。所述免疫疫苗抗原為滅活或減毒的病毒抗原、細(xì)菌抗原、天然或重組的蛋白抗原、多糖抗原、核酸抗原、蛋白結(jié)合多糖抗原中的ー種或ー種以上。所述疫苗組合物通過(guò)噴鼻或滴鼻，也可舌下滴入免疫途徑接種。上述ー種噴鼻黏膜免疫疫苗組合物的制備方法，按照如下步驟進(jìn)行(I)殼聚糖季銨鹽的制備將6. 0克殼聚糖分散于90ml雙蒸水中，形成殼聚糖分散液，將75. 0克2，3環(huán)氧丙基三甲基氯化銨溶解于雙蒸水中并定容至30ml，將2，3環(huán)氧丙基三甲基氯化銨溶液邊攪拌邊加入殼聚糖分散液中形成混合溶液，于80°C下攪拌反應(yīng)6小時(shí)，將混合溶液倒入4°C預(yù)冷的丙酮中，放置在2-8°C過(guò)夜，其中混合溶液與丙酮的體積比為1:3 1:4。將過(guò)夜后的沉淀放置105°C條件下烘干，得到白色疏散固體物，為殼聚糖季銨鹽；(2)殼聚糖季銨鹽水凝膠的制備將殼聚糖季銨鹽6. 0克和聚こニ醇3克溶解于96ml 0. lmol/L的醋酸溶液中，冷卻至4°C,攪拌下逐滴加入濃度為0. 1-0. 5g/ml的a-甘油磷酸鈉溶液24ml,攪拌均勻，調(diào)節(jié)溶液PH值至7. 0 ;將該溶液加熱至37°C保溫60分鐘，形成殼聚糖季銨鹽水凝膠；然后置于2-8°C保存；(3)在配制的上述殼聚糖季銨鹽水凝膠中邊攪拌邊按比例加入免疫細(xì)胞因子2-8mg/ml,疫苗抗原10_20mg/ml,硫柳萊0. l_3mg/ml,調(diào)節(jié)溶液的pH值為6. 8 7. 0,即為噴鼻黏膜免疫疫苗組合物溶液，置2-8°C保存。上述ー種噴鼻黏膜免疫疫苗組合物在制 備免疫預(yù)防藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的噴鼻黏膜免疫疫苗組合物的組分之間發(fā)揮有效的疊加協(xié)同作用，免疫細(xì)胞因子作為黏膜疫苗佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑，殼聚糖季胺鹽水凝膠作為生物粘附物和抗原遞送系統(tǒng)，與疫苗抗原聯(lián)合使用，既增加了疫苗抗原在鼻腔中的停留時(shí)間，又増加了抗原的免疫應(yīng)答效應(yīng)，從而顯著的増加了噴鼻黏膜疫苗的有效性，還減少了疫苗噴霧劑對(duì)鼻黏膜的刺激性和抗原用量。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步說(shuō)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。以下實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)施例I噴鼻黏膜免疫疫苗組合物的制備殼聚糖的來(lái)源殼聚糖購(gòu)買于美國(guó)sigma公司或國(guó)內(nèi)藥用級(jí)生產(chǎn)公司，分子量為150KD,脫こ酰化85%以上。制備方法如下( I)殼聚糖季銨鹽的制備將6. 0克殼聚糖分散于90ml雙蒸水中，形成殼聚糖分散液，將75. 0克2，3環(huán)氧丙基三甲基氯化銨溶解于雙蒸水中并定容至30ml，將2，3環(huán)氧丙基三甲基氯化銨溶液邊攪拌邊加入殼聚糖分散液中形成混合溶液，于80°C下攪拌反應(yīng)6小時(shí)，將混合溶液倒入4°C預(yù)冷的丙酮中，放置在2-8°C過(guò)夜，其中混合溶液與丙酮的體積比為1:3。將過(guò)夜后的沉淀放置105°C條件下烘干，得到白色疏散固體物，為殼聚糖季銨鹽；(2)殼聚糖季銨鹽水凝膠的制備將殼聚糖季銨鹽6. 0克和聚こニ醇3克溶解于96ml 0. lmol/L的醋酸溶液中，冷卻至4°C,攪拌下逐滴加入濃度為0. 1-0. 5g/ml的a-甘油磷酸鈉溶液24ml,攪拌均勻，調(diào)節(jié)溶液PH值至7. 0 ;將該溶液加熱至37°C保溫60分鐘，形成殼聚糖季銨鹽水凝膠；然后置于2-8°C保存；(3)在配制的上述殼聚糖季銨鹽水凝膠中邊攪拌邊按比例加入免疫細(xì)胞因子4-8mg/ml,疫苗抗原10_20mg/ml,硫柳萊0. l_3mg/ml,調(diào)節(jié)溶液的pH值為6. 8 7. 0,即為噴鼻黏膜免疫疫苗組合物溶液，置2-8°C保存。實(shí)施例2不同免疫細(xì)胞因子作為免疫疫苗組合物佐劑產(chǎn)生的中和抗體效價(jià)I.免疫細(xì)胞因子的來(lái)源天然或重組的人IL-Ia、IL-IP、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-31、IL-33 共 26 種細(xì)胞因子，購(gòu)于 R&DSystems(Minneapolis, MN)公ロJ02.不同免疫細(xì)胞因子作為免疫疫苗組合物佐劑的制備按實(shí)施例I中的步驟和比例分別制備含上述免疫細(xì)胞因子的疫苗組合物，其中的免疫抗原分別為流感三價(jià)裂解抗原、呼吸道合胞病毒VLP抗原、百白破多糖結(jié)合蛋白抗原、肺炎23價(jià)多糖結(jié)合蛋白抗原、乳頭瘤6價(jià)VLP抗原、流感嗜血桿菌多糖結(jié)合蛋白抗原。用疫苗組合物分別滴鼻免疫接種Balb/c小鼠，間隔2周加強(qiáng)免疫I次，觀察體液免疫中和抗體效果，如表I所示。表I.不同免疫細(xì)胞因子作為免疫疫苗組合物佐劑產(chǎn)生的中和抗體效價(jià)

權(quán)利要求
1.一種噴鼻黏膜免疫疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物由占疫苗組合物總重的以下組分組成免疫細(xì)胞因子0. OI-20%、殼聚糖季胺鹽水凝膠45-80%、疫苗抗原0.01-20%、硫柳汞 0. 01-15%、聚乙二醇 0. 5-2%o
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種噴鼻黏膜免疫疫苗組合物，其特征在于，所述免疫細(xì)胞因子為天然的或重組的 IL-I a、IL-I P、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、 IL-13、 IL-15、 IL-17、 IL-18、 IL-19、 IL-20、 IL-21、 IL-22、 IL-23、 IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-31、IL-33 中的一種或一種以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種噴鼻黏膜免疫疫苗組合物，其特征在于，所述免疫疫苗抗原為滅活或減毒的病毒抗原、細(xì)菌抗原、天然或重組的蛋白抗原、多糖抗原、核酸抗原、蛋白結(jié)合多糖抗原中的一種或一種以上。
4.權(quán)利要求I所述的一種噴鼻黏膜免疫疫苗組合物的制備方法，其特征在于，按照如下步驟進(jìn)行 (1)殼聚糖季銨鹽的制備 將6. 0克殼聚糖分散于90ml雙蒸水中，形成殼聚糖分散液，將75. 0克2，3環(huán)氧丙基三甲基氯化銨溶解于雙蒸水中并定容至30ml，將2，3環(huán)氧丙基三甲基氯化銨溶液邊攪拌邊加入殼聚糖分散液中形成混合溶液，于80°C下攪拌反應(yīng)6小時(shí)，將混合溶液倒入4°C預(yù)冷的丙酮中，放置在2-8°C過(guò)夜，其中混合溶液與丙酮的體積比為1:3 1:4。將過(guò)夜后的沉淀放置105°C條件下烘干，得到白色疏散固體物，為殼聚糖季銨鹽； (2)殼聚糖季銨鹽水凝膠的制備 將殼聚糖季銨鹽6. 0克和聚乙二醇3克溶解于96ml 0. lmol/L的醋酸溶液中，冷卻至4°C，攪拌下逐滴加入濃度為0. 1-0. 5g/ml的a - P -甘油磷酸鈉溶液24ml，攪拌均勻，調(diào)節(jié)溶液PH值至7. 0 ;將該溶液加熱至37°C保溫60分鐘，形成殼聚糖季銨鹽水凝膠；然后置于2-8°C保存； (3)在配制的上述殼聚糖季銨鹽水凝膠中邊攪拌邊按比例加入免疫細(xì)胞因子2-8mg/ml，疫苗抗原10-20mg/ml，硫柳汞0. l_3mg/ml，調(diào)節(jié)溶液的pH值為6. 8 7. 0，即為噴鼻黏膜免疫疫苗組合物溶液，置2-8°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種噴鼻黏膜免疫疫苗組合物在制備免疫預(yù)防藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域的一種噴鼻黏膜免疫疫苗組合物及其制備方法。該疫苗組合物由占疫苗組合物總重的以下組分組成免疫細(xì)胞因子0.01-20%、殼聚糖季胺鹽水凝膠45-80%、疫苗抗原0.01-20%、硫柳汞0.01-15%、聚乙二醇0.5-2%。本發(fā)明的噴鼻黏膜免疫疫苗組合物的各組分之間發(fā)揮有效的疊加協(xié)同作用，免疫細(xì)胞因子作為黏膜疫苗佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑，殼聚糖季胺鹽水凝膠作為生物粘附物質(zhì)和抗原遞送系統(tǒng)，聚乙二醇作為穩(wěn)定劑，與疫苗抗原聯(lián)合使用，增加了疫苗抗原在鼻腔中的停留時(shí)間和抗原的免疫應(yīng)答，顯著的提高了噴鼻黏膜疫苗的全面有效性，減少疫苗噴霧劑對(duì)鼻黏膜的刺激性和抗原用量。
文檔編號(hào)A61K47/36GK102764430SQ20121022909
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月3日
發(fā)明者楊鵬輝, 段躍強(qiáng), 牛燕, 王希良, 王歡, 王鋮, 谷宏婧, 趙忠鵬, 邢麗 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所, 北京麥迪理邦生物科技有限公司