專利名稱：5α-8α-過氧麥角甾-6,22(E)-二烯-3β-醇在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及5 a -8 a -過氧麥角甾_6，22 (E) - ニ烯_3 P -醇在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是目前威脅人類生命的主要病因之一。世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的數(shù)據(jù)顯示，2000年全球新發(fā)腫瘤例數(shù)為1226萬，腫瘤死亡人數(shù)為756萬，從出生到75歲累積患癌危險(xiǎn)度為18. 7% (Ferlay J et al. , 2010)。我國衛(wèi)生部最新數(shù)據(jù)(2011)顯示，惡性腫瘤位居我國城市死亡原因首位和農(nóng)村死亡原因第二位，分別占全死因的23. 66%和19. 72%(中華人民共和國衛(wèi)生部，2010)。惡性腫瘤控制已成為世界各國政府的衛(wèi)生戰(zhàn)略重點(diǎn)。在惡性腫瘤的治療中，藥物治療是重要的治療方式之一，而在治療過程中出現(xiàn)耐藥性，是惡性腫瘤治療失敗的重要原因之一，因此，不斷尋找新的治療惡性腫瘤藥物成為必然。天然產(chǎn)物由于具有豐富的骨架和官能團(tuán)，賦予了其獨(dú)有的生物活性，已成為藥物先導(dǎo)化合物的重要組成部分，用于各種疾病的治療，且在抗腫瘤方面效果尤其顯著。目前，惡性腫瘤的治療很大程度上仍以化療為主。研究顯示，化療產(chǎn)生獲得性抵抗力是腫瘤干細(xì)胞的特性，這也成為功治愈惡性腫瘤的主要障礙。腫瘤干細(xì)胞(Tumor stemcells, TSCs)理論表明，腫瘤組織中TSCs (占0. 2%)是腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移浸潤的原因，而其余大部分的腫瘤細(xì)胞并無轉(zhuǎn)移能力，并且TSCs能抵抗化學(xué)藥物和放射線治療，是腫瘤復(fù)發(fā)的根源，也是腫瘤常規(guī)治療失敗的根本原因。5 a-8 a -過氧麥角甾_6，22(E)-ニ烯_3 ^ -醇，作為甾醇類化合物，在多種食藥用國中被發(fā)現(xiàn)°An ergosterol peroxide, a natural product that selectively ennancesthe inhibitory effect of linoleic acid on DNA polymerase beta (Mizushina Y，Watanbe I， Togashi H et al. ， Biological & Pharmaceutical Bulletin，1998，21(5) :444-8)中對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)的報(bào)道，并且有文獻(xiàn)報(bào)道該化合物具有抗炎、抗菌、抗動(dòng)脈粥樣硬化及抑制人T細(xì)胞増殖的作用，但是截止目前，沒有關(guān)于該化學(xué)物具有抑制惡性乳腺癌(MT-1)、淋巴瘤(Jurkat)及腦瘤(U87)細(xì)胞等抗腫瘤活性的報(bào)道，關(guān)于其對耐藥性的腫瘤干細(xì)胞的殺滅作用更是從未發(fā)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了 5 a -8 a -過氧麥角甾_6，22(E)- ニ烯-3 0-醇在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。5 a -8 a -過氧麥角甾_6，22 (E)- ニ烯-3 0-醇，俗稱過氧麥角甾醇，其分子式為C28H44O3，其結(jié)構(gòu)如圖I所示。本文所涉及5 a -8 a -過氧麥角留_6，22(E)- ニ烯-3 0-醇是從靈芝孢子中分離純化所得。
所述分離純化方法為
I、收集靈芝孢子，經(jīng)酶法破壁，再經(jīng)ニ氧化碳超臨界萃取儀進(jìn)行萃取，萃取條件為萃取壓力25MPa±lMPa，溫度40°C±5°C; ニ氧化碳流量175L/h± 15L/h ;分離壓カ6Mpa±lMpa，ニ級(jí)分離釜溫度40 °C±2 °C，三級(jí)分離釜溫度45 °C±2 °C，萃取時(shí)間4小吋；萃取完畢后，待萃取釜壓カ和分離釜壓カ達(dá)在平衡時(shí)，取出萃取物，即得到靈芝孢子油，16°C以下保存，備用。2、取靈芝孢子油，按照樣品硅膠=1:2的比例拌樣混合，按照樣品硅膠=1:30的比例上柱，使用4倍氯仿，3倍こ酸こ酯分別洗脫，分別獲得氯仿部分及こ酸こ酯部分，對氯仿部分和こ酸こ酯部分分別利用MT-1、U87及Jurkat進(jìn)行 活性追蹤檢測，選擇活性高的こ酸こ酯部分進(jìn)行進(jìn)一歩的分離。3、將こ酸こ酯部分拌樣、上柱，使用石油醚￠0-90)-こ酸こ酯進(jìn)行梯度洗脫，依次為石油醚-こ酸こ酯=20:1，9:1，8:2，7:3，5:5，最后再用こ酸こ酯洗脫，根據(jù)薄層色譜(TCL)結(jié)果，合并組份相同的餾分。4、利用MT-1、U87、Jurkat中的ー種或多種方法對上述餾分進(jìn)行活性追蹤檢測，選擇與こ酸こ酯部分相比活性提高最多的部分，拌樣上柱，用石油醚-丙酮=8:2洗脫，收集餾分。5、利用MT-1、U87、Jurkat中的ー種或多種方法對上述餾分進(jìn)行活性追蹤檢測，選擇活性提高最多的部分，通過反相-高效液相色譜儀(R-HPLC)進(jìn)行半制備，條件YMC C18柱，10X250um，流速4mL/min，洗脫劑是甲醇水=96:4，在60min收集到餾分GL421。利用核磁共振及質(zhì)譜分析鑒定GL421，5 a-8 a -過氧麥角甾-6，22 (E) - ニ烯-3 3-酉!■，I peroxide ergosterol 或 5，8-epidioxiergosta-6, 22-dien-3 3-ol) ,H色針狀結(jié)晶，分子量428,分子式C28H44O3。本發(fā)明所述腫瘤為惡性乳腺瘤、淋巴瘤、腦瘤。所述腫瘤干細(xì)胞為腦瘤干細(xì)胞。經(jīng)過發(fā)明人大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5 a -8 a -過氧麥角留-6，22(E)- ニ烯-3 0-醇對惡性乳腺瘤細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、腦瘤細(xì)胞等惡性腫瘤都有顯著的抑制作用，特別是對腦瘤干細(xì)胞等耐藥性的腫瘤干細(xì)胞的殺滅作用，使得5 a -8 a -過氧麥角留_6，22 (E) - ニ烯_3 P -醇可用于制作抗腫瘤藥物藥物，該藥物含有有效含量的5 a -8 a -過氧麥角留-6，22 (E) - ニ烯-3 3 -醇及藥學(xué)上可接受的載體。


圖I為5a-8a-過氧麥角甾-6,22 (E) - ニ烯_3 P -醇的結(jié)構(gòu)圖。圖2為實(shí)施例I分離純化的GL421的質(zhì)譜圖。圖3為實(shí)施例I分離純化的GL421的質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)ー步說明。實(shí)施例I :從靈芝孢子中分離純化5 a -8 a -過氧麥角甾-6，22(E)- ニ烯_3 P -醇
I、收集10公斤靈芝孢子，經(jīng)酶法破壁，再經(jīng)ニ氧化碳超臨界萃取儀進(jìn)行萃取，萃取條件為萃取壓力25MPa±lMPa，溫度40°C±5°C ;ニ氧化碳流量175L/h±15L/h ;分離壓カ6Mpa±lMpa，ニ級(jí)分離釜溫度40 °C±2 °C，三級(jí)分離釜溫度45 °C±2 °C，萃取時(shí)間4小時(shí)；萃取完畢后，待萃取釜壓カ和分離釜壓カ達(dá)在平衡時(shí)，取出萃取物，即得到靈芝孢子油，共1300g，16°C以下保存，備用。2、取靈芝孢子油21 Og，用250ml石油醚(60-90 )溶解，按照樣品硅膠=1:2的比例拌樣混合(硅膠160-200目)，按照樣品硅膠=1:30的比例上柱(柱直徑X長度為15cmX70cm)，使用4倍柱體積的氯仿，3倍柱體積こ酸こ酯分別洗脫，獲得氯仿部分132g，乙酸こ酯部分78g。利用活性追蹤的方法，確定進(jìn)一步分離部位，檢測方法如下分別將處于對數(shù)生長期的人惡性乳腺瘤細(xì)胞MT-1，經(jīng)0. 25%胰酶處理，消化后，重 新用含10%胎牛血清和1%雙抗(10000U/ml青霉素+10000U/ml鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基懸浮，然后計(jì)數(shù)，配制成2 X IO5個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，往12孔板中加入0. 96ml混勻的細(xì)胞懸液，于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)四小時(shí)后，在各孔中加入40ul稀釋后的含氯仿部分、こ酸こ酯部分的樣品溶液，其最終作用濃度為100ug/ml，每個(gè)樣品溶液設(shè)置3個(gè)重復(fù)，設(shè)置陰性對照為加入40ulDMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后，0. 25%胰酶處理，懸浮，吸取0. 5ml加入等量的0. 4%臺(tái)酚藍(lán)，3分鐘內(nèi)，在倒置顯微鏡下，進(jìn)行計(jì)數(shù)，取3個(gè)重復(fù)的平均值，按細(xì)胞死亡率(％) =樣品組死細(xì)胞數(shù)/ (活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))X 100%的公式計(jì)算樣品對人惡性乳腺瘤細(xì)胞MT-I殺死率。重復(fù)三次本實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表I。表I :
權(quán)利要求
1.5 a-8 a-過氧麥角留-6，22 (E) - 二烯-3 0-醇在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述5a -8 a -過氧麥角甾_6，22(E)- 二烯-3 P -醇是從靈芝孢子中分離純化所得，所述5 a -8 a -過氧麥角留_6，22 (E) - 二烯-3 P -醇的分子式為C28H44O3,分子量為428。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤為惡性乳腺瘤、淋巴瘤、腦瘤。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤為腦瘤干細(xì)胞。
5.一種抗腫瘤藥物藥物，其特征在于，含有有效含量的5 a-8 a-過氧麥角留-6, 22(E) - 二烯-3 P -醇及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及5α-8α-過氧麥角甾-6,22(E)-二烯-3β-醇在制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5α-8α-過氧麥角甾-6,22(E)-二烯-3β-醇對惡性乳腺瘤細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、腦瘤細(xì)胞等惡性腫瘤都有顯著的抑制作用，特別是對腦瘤干細(xì)胞等耐藥性的腫瘤干細(xì)胞的殺滅作用，使得5α-8α-過氧麥角甾-6,22(E)-二烯-3β-醇可用于制作抗腫瘤藥物藥物，該藥物含有有效含量的5α-8α-過氧麥角甾-6,22(E)-二烯-3β-醇及藥學(xué)上可接受的載體。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102764263SQ20121023319
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者余雄濤, 張智, 李向敏, 潘鴻輝, 焦春偉, 羅彪, 蔡勉華, 謝意珍 申請人:廣東省微生物研究所, 廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司